李橋妹 王宗德 謝禮文黎冬明, 范國榮 陳尚钘

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，南昌 330045)(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院；國家林草局木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心；國家林草局/江西省樟樹工程技術(shù)研究中心2，南昌 330045)

山蒼子為樟科木姜子屬落葉灌木或小喬木，主要分布在我國長江以南的向陽丘陵、山地灌木叢或疏林中[1, 2]。山蒼子核是山蒼子經(jīng)水蒸氣蒸餾出表皮精油后剩余得到的固體殘渣。山蒼子精油中含有豐富的檸檬醛，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)占60%～80%，是合成紫羅蘭酮、甲基紫羅蘭酮等名貴香料的理想原料[3, 4]。山蒼子核仁含油量可達(dá)40%以上，其中C10和C12這兩種中碳脂肪酸甘油酯占90%以上[1, 5]。中碳脂肪酸甘油酯在食品、化妝品、藥品等方面的應(yīng)用越來越廣泛，由于代謝的特殊性，可減少血清膽固醇和肝膽固醇量，對于動脈硬化、血栓癥有一定的療效[6]。江西省含有豐富的山蒼子資源，但是一些加工企業(yè)或個人將山蒼子核直接廢棄或者焚燒，不僅造成了資源的浪費，而且還會對環(huán)境造成污染。若將山蒼子核仁油中的中碳脂肪酸甘油酯加以充分利用, 使其產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)效益、社會效益和生態(tài)效益，具有重大的意義。

甘油二酯(Diacylglycerol，DAG)是甘油三酯(Triacylglycerol，TAG)中一個脂肪酸被羥基所取代的結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，DAG有1,2-DAG和1,3-DAG這兩種同分異構(gòu)體[7]。DAG在天然油脂中的含量雖然很低，但它卻是合成甘油三酯、磷脂和糖脂的前體物質(zhì)，是油脂在體內(nèi)代謝的中間產(chǎn)物，是重要的生物物質(zhì)[8]。早期發(fā)現(xiàn)，在食品、化妝品和制藥等行業(yè)領(lǐng)域中，DAG是重要的表面活性劑。近年來，有研究表明它具有減肥，降血脂等功能[9]。中鏈脂肪酸具有減少體內(nèi)脂肪積累、快速供應(yīng)能量、提高葡萄糖耐量和胰島素敏感性，從而改善胰島素抵抗等功能[10]。中碳鏈DAG不但具有DAG和中鏈脂肪酸的生物學(xué)功能，而且它的保健功能顯著，可用于減肥功能性食品中，具有較好的經(jīng)濟(jì)價值和應(yīng)用前景[11]。

目前，根據(jù)制備機(jī)理的不同，國內(nèi)外DAG的制備方法主要有以下幾種：甘油與脂肪酸的酯化反應(yīng)、脂肪酸酯的甘油解法、油脂的水解法、脂肪酸酯的醇解法。酶法具有條件溫和、高效、安全等特點，因此本文以山蒼子核仁油為原料，對3種固定化脂肪酶LipozymeRMIM、LipozymeTLIM和Novozym435進(jìn)行篩選，選擇最佳的固定化脂肪酶催化油脂水解制備中碳鏈DAG，采用高效液相色譜儀測定中碳鏈DAG的含量，并通過正交試驗優(yōu)化油脂水解條件，為中碳鏈DAG在工業(yè)中生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山蒼子核仁油(癸酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.31%，月桂酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為51.53%，月桂烯酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為14.61%)實驗室提取；甲醇、乙腈、異丙醇均為色譜純； LipozymeRMIM、LipozymeTLIM、Novozym435脂肪酶、癸酸甘油二酯、月桂酸甘油二酯。

1.2 儀器設(shè)備

FA224-型分析天平，SHZ-C-型水浴恒溫振蕩器，LG16-WS-型臺式高速離心機(jī),SHZ-D(Ⅲ)-型循環(huán)水式真空泵,Watere2695高效液相色譜儀。

1.3 實驗方法

1.3.1 山蒼子核仁油的脫膠處理

根據(jù)程謙偉[12]等的超聲波輔助水化脫膠方法，稍作修改。取適量經(jīng)石油醚提取的山蒼子核仁油于錐形瓶中，加入4%(按核仁油質(zhì)量計算)的蒸餾水，放在超聲溫度為50 ℃，超聲功率為75 W的條件下，超聲時間為8 min。取出后靜置30 min，放入離心機(jī)中，設(shè)置轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，離心時間為20 min。得到上清液則為水化油脂，水化脫膠的得率為91.6%。

1.3.2 甘油二酯的制備

根據(jù)盧夢青[13]的水解法制備1,3-甘油二酯方法，稍作修改。稱取適量的山蒼子核仁油于50 mL具塞錐形瓶中，加入一定比例的蒸餾水混合均勻，再加入一定量的固定化脂肪酶，并將其放置在溫度為70 ℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫水浴振蕩器中，反應(yīng)一定的時間。反應(yīng)結(jié)束后，在9 500 r/min的臺式高速離心機(jī)下離心8 min，將油脂與其余物質(zhì)分離開，取上層油脂進(jìn)行分析。

1.3.3 固定化脂肪酶的篩選

稱取適量的山蒼子核仁油，加入10%的蒸餾水(占油重)混合均勻，分別加入14%(占油重)固定化脂肪酶(LipozymeRMIM、LipozymeTLIM和Novozym435)，并置于酶適宜溫度分別為50、55、70 ℃，轉(zhuǎn)速為200 r/min的恒溫水浴振蕩器中，在反應(yīng)3、4、5、6、7 h后，定時取反應(yīng)產(chǎn)物，在9 500 r/min的臺式高速離心機(jī)下離心8 min，然后取上層油脂進(jìn)行檢測。

1.3.4 單因素試驗

以山蒼子核仁油為原料，中碳鏈DAG含量為指標(biāo)，分別對加酶量、加水量、反應(yīng)時間3個單因素進(jìn)行酶法制備富含中碳鏈DAG的山蒼子核仁油工藝探究，單因素試驗因素水平表見表1。

表1 單因素試驗因素水平表

1.3.5 正交試驗優(yōu)化設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以加水量、加酶量、反應(yīng)時間這3個因素為自變量，中碳鏈DAG為指標(biāo)，采用DPS軟件設(shè)計L9(34)的正交試驗因素水平，見表2所示。

表2 正交試驗因素水平表

1.3.6 中碳鏈甘油二酯的測定

樣品前處理：取適量上述所得的上清液，用異丙醇流動相溶解樣品，配制樣品質(zhì)量質(zhì)量濃度為10 mg/mL。漩渦振蕩均勻后，用0.22 μm的有機(jī)膜過濾，置于2 mL的進(jìn)樣瓶中，等待檢測分析。

中碳鏈DAG的測定：采用HPLC檢測中碳鏈DAG含量，條件如下：色譜柱為SymmetryC18(5 μm，4.6 mm×150 mm)，PDA檢測器；檢測波長：210 nm；柱溫：40 ℃；流動相∶乙腈∶異丙醇=75∶25；采用等濃度梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。通過癸酸DAG標(biāo)準(zhǔn)品與月桂酸DAG標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間，以此確定中碳鏈DAG的出峰區(qū)間，采用峰面積歸一法計算中碳鏈DAG含量，即中碳鏈DAG的含量表示為中碳鏈DAG的峰面積之和占所有的甘油酯峰面積的百分比[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 山蒼子核仁油中碳鏈甘油二酯出峰位置的確定

山蒼核仁油中的中鏈脂肪酸主要成分(質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于10%)為癸酸、月桂酸、月桂烯酸。本文主要研究這3種脂肪酸所組成的DAG。用反相色譜柱分析時，甘油酯的出峰時間順序與當(dāng)量碳數(shù)(ECN)有關(guān)，ECN值越小就越容易出峰。一般來說，ECN值相同的甘油酯會同時出峰，僅用HPLC是比較難分開[14]。山蒼子核仁油中碳鏈DAG的當(dāng)量碳數(shù)值如表3。根據(jù)表3可知，山蒼子核仁油中碳鏈DAG中的癸酸DAG最先出峰，月桂酸DAG最后出峰，通過測定癸酸DAG和月桂酸DAG標(biāo)準(zhǔn)樣品的出峰時間，從而確定山蒼子核仁油中碳鏈DAG的出峰時間區(qū)間為4.025～5.769 min。

表3 中碳鏈DAG的當(dāng)量碳數(shù)值

2.2 固定化脂肪酶的篩選

選擇了3種固定化脂肪酶即LipozymeRMIM、LipozymeTLIM和Novozym435，在其他反應(yīng)條件一致的情況下，催化部分水解山蒼子核仁油生成中碳鏈DAG，篩選出水解效率最佳的脂肪酶。以時間為橫坐標(biāo)、中碳鏈DAG含量為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 3種固定化脂肪酶對中碳鏈DAG的影響

由圖1可知，對于LipozymeRMIM脂肪酶而言，反應(yīng)至7 h，該脂肪酶催化部分水解反應(yīng)得到中碳鏈DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.23%；對于Novozym435脂肪酶而言，反應(yīng)至7 h，該脂肪酶催化部分水解反應(yīng)得到中碳鏈DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.68%；對于LipozymeTLIM脂肪酶而言，反應(yīng)至6 h時，該脂肪酶催化部分水解反應(yīng)得到中碳鏈DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37.12%，此時該酶催化效率最好?？梢奓ipozymeRMIM和Novozym435脂肪酶都隨著反應(yīng)時間的增加，中碳鏈DAG的含量也不斷增加，當(dāng)反應(yīng)到一定的時間后，中碳鏈DAG含量增加的幅度很??；而LipozymeTLIM脂肪酶則是隨著反應(yīng)時間的延長，中碳鏈DAG含量先增加后減少。可以明顯的看出，任意反應(yīng)時間內(nèi)，催化部分水解反應(yīng)得到的中碳鏈DAG含量比其余兩種脂肪酶催化部分水解反應(yīng)得到的中碳鏈DAG含量都要高?？赡苁遣煌久傅慕Y(jié)構(gòu)存在差異，而導(dǎo)致催化效率不一樣。因此選擇LipozymeRMIM為最佳脂肪酶，繼續(xù)為后續(xù)部分水解工藝進(jìn)行研究。

2.3 加酶量對中碳鏈甘油二酯的影響

在加水量為10%(占油重)，反應(yīng)時間為3 h的條件下，考察加酶量(占油重)為10%、12%、14%、16%、20%對部分水解山蒼子核仁油制備中碳鏈DAG含量的影響，結(jié)果如圖2所示。加酶量在10%到14%這個范圍內(nèi)，中碳鏈DAG含量不斷的增加；當(dāng)加酶量為14%時，水解得到的中碳鏈DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.09%,此時為最大值；加酶量繼續(xù)增加時，中碳鏈DAG含量反而減少。這是因為隨著加酶量的增加，油脂與脂肪酶接觸的幾率增多，脂肪酶與固定含量的油脂結(jié)合的更充分，使水解反應(yīng)速率加快；當(dāng)加酶量增加到一定的程度時，由于固定化本身酶顆粒較大，含量過多，在反應(yīng)過程中可能會阻礙酶的結(jié)合位點，導(dǎo)致酶的活性降低，從而使水解反應(yīng)速率降低，同時反應(yīng)體系的黏度也不斷的增加，不利于物質(zhì)傳質(zhì)過程[15，16]。因此，加酶量宜選擇為14%。

圖2 加酶量、加水量、反應(yīng)時間對中碳鏈DAG的影響

2.4 加水量對中碳鏈甘油二酯的影響

在加酶量為14%(占油重)，反應(yīng)時間為3 h的條件下，考察加水量(占油重)為0%、5%、10%、15%、20%、25%對部分水解山蒼子核仁油制備中碳鏈DAG含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，加水量在0%到15%這個范圍內(nèi)，中碳鏈DAG含量不斷的增加；當(dāng)加水量增加至15%時，酶法制備得到中碳鏈DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為36.36%，此時得到中碳鏈DAG含量為最大值；繼續(xù)增加水含量，中碳鏈DAG含量不斷的減少。這可能是因為與脂肪酶的結(jié)構(gòu)特點有關(guān)。脂肪酶由親水、疏水氨基酸這兩個部分組成，而脂肪酶的活性中心是被一個親水性的短α-螺旋覆蓋，而里面則是靠近分子疏水端[17]。脂肪酶需要適量水來保激活酶的活性，使這個脂肪酶在這個油-水界面催化反應(yīng)；但是含水量過多，會使水解反應(yīng)發(fā)生逆反應(yīng)，合成甘油三酯；雖然體系的界面面積增加,但是酶的相對濃度下降導(dǎo)致酶的活性有所降低，從而導(dǎo)致中碳鏈DAG含量不斷的減少[18]。因此，選擇加水量(占油重)為10%較為適宜。

2.5 反應(yīng)時間對中碳鏈甘油二酯的影響

在加酶量為14%(占油重)，加水量為10%(占油重)的條件下，考察反應(yīng)時間為1、3、5、7、9 h對部分水解山蒼子核仁油制備中碳鏈DAG含量的影響，結(jié)果如圖2所示。隨著反應(yīng)時間的延長，中碳鏈DAG含量逐漸增加；當(dāng)反應(yīng)時間到達(dá)7 h時，酶法制備得到中碳鏈DAG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41.44%，反應(yīng)基本達(dá)到了穩(wěn)定；反應(yīng)時間繼續(xù)增加，中碳鏈DAG含量增加的幅度很小。綜合考慮能耗與時間等因素，反應(yīng)時間選擇7 h最為合適。

2.6 正交試驗

以山蒼子核仁油為原料，在固定化脂肪酶LipozymeRMIM催化水解得到中碳鏈DAG的單因素分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)行正交試驗優(yōu)化油脂水解條件。L9(34)正交試驗結(jié)果如表4，方差分析表如表5，Duncan多重比較如表6。

表4 L9(34)正交試驗結(jié)果

表5 方差分析表

表6 Duncan多重比較

由表4可以得出：根據(jù)R值可知在選定的加酶量、加水量、反應(yīng)時間這3個因素對制備中碳鏈甘油二酯都存在顯著影響，以加水量的影響最大，其次是加酶量、反應(yīng)時間，即A>B>C；通過k值比較，得到脂肪酶LipozymeRMIM催化部分水解山蒼子核仁油制備中碳鏈DAG的最優(yōu)試驗條件為A1B3C2。由表5中可以知道，因素A、因素B和因素C都具有差異極顯著。從表6可以看出，因素A各個水平間差異極顯著但水平A1的中碳鏈DAG含量最高，所以因素A的最佳水平選擇A1；因素B各個水平間差異極顯著但水平B3的中碳鏈DAG含量最高，因此因素B的最佳水平選擇B3；因素C水平間存在差異顯著，C1與C2、C3差異顯著，C2與C3差異不顯著且C2的中碳鏈DAG含量最高，因此因素C的最佳水平選擇C2。可以得出脂肪酶LipozymeRMIM催化部分水解制備富含中碳鏈DAG的山蒼子核仁油的最佳反應(yīng)條件為A1B3C2，即加水量為5%(占油重)、加酶量為16%(占油重)、反應(yīng)時間為7 h。

2.7 驗證試驗

由正交試驗確定得到脂肪酶LipozymeRMIM催化部分水解制備富含中碳鏈DAG的山蒼子核仁油的最佳工藝條件，即加水量為5%(占油重)、加酶量為16%(占油重)、反應(yīng)時間為7 h的條件下做驗證試驗，做3組平行試驗，取其平均值，結(jié)果如表7。

表7 驗證試驗結(jié)果

由表7可知，驗證試驗條件下得到的結(jié)果與正交表中結(jié)果比較，驗證試驗條件下得到的中碳鏈DAG含量要高于正交表里的任何一組。因此，可以確定脂肪酶LipozymeRMIM催化部分水解制備富含中碳鏈DAG山蒼子核仁油的最佳工藝條件為：加水量5%(占油重)、加酶量16%(占油重)、反應(yīng)時間7 h。在該反應(yīng)條件下制備的中碳鏈DAG，采用峰面積歸一法計算得到中碳鏈DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.51%，山蒼子核仁原油中的中碳鏈DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.24%，可見與山蒼子核仁油原油中的中碳鏈DAG的含量相比提高了2.76倍。

3 結(jié)論

以山蒼子核仁油為原料，采用脂肪酶部分水解法制備富含中碳鏈DAG的山蒼子核仁油，利用高效液相色譜法確定反應(yīng)后產(chǎn)物中的中碳鏈DAG的含量。對LipozymeRMIM、LipozymeTLIM和Novozym435三種固定化脂肪酶進(jìn)行篩選，得出LipozymeRMIM固定化脂肪酶的催化效果最好。以LipozymeRMIM固定化脂肪酶為催化劑，催化部分水解制備中碳鏈DAG。在單因素結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，以中碳鏈DAG含量為指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)化富含中碳鏈DAG的山蒼子核仁油的制備條件。結(jié)果表明酶解制備富含中碳鏈DAG的山蒼子核仁油的最佳工藝為：加水量5%(占油重)，加酶量16%(占油重)，反應(yīng)時間7 h。該條件下制備中碳鏈DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為47.51%，而山蒼子核仁原油中的中碳鏈DAG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17.24%，可見與其原油中的中碳鏈DAG的含量相比提高了2.76倍。