田亞原 覃 譚 張旭林 覃繼肖王 旭 盧 琦,2 Paengkoum Pramote 田興舟,2

(貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院1，貴陽 550025)(貴州大學(xué)動物營養(yǎng)與飼料研究所2，貴陽 550025)(泰國蘇蘭拉里理工大學(xué)3，呵叻 30000)

熱應(yīng)激是高溫高濕環(huán)境山羊產(chǎn)生熱量蓄積體內(nèi)，增強機體熱負荷引起的一系列非特異性生理反應(yīng)，是阻礙奶山羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素之一。如何有效地緩解反芻動物熱應(yīng)激，提高生產(chǎn)性能，是現(xiàn)今亟需待解決的問題?；ㄇ嗨鼐哂袠O強的抗氧化活性，可與不穩(wěn)定自由基(free radical, FR)發(fā)生反應(yīng)，抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。同時，花青素具無殘留、無污染、來源廣等優(yōu)點，且有抗氧化、抗炎癥等生理功能，對促進家畜生長、提高機體免疫力和抗氧化能力有積極作用[1]。Tian等[2]發(fā)現(xiàn)，奶山羊飼喂富含花青素紫玉米秸稈青貯飼料(purple corn stover silage，PSS)可顯著提高血漿超氧化物歧化酶(SOD)。周迪等[3]指出，花青素作為優(yōu)良的天然抗氧化劑源，有提高反芻動物抗氧化能力、降低氧化應(yīng)激的作用。Matsuba等[4]飼予泌乳期奶牛紫玉米青貯飼料，對產(chǎn)奶量和奶成分無顯著影響，但可增強機體抗氧化性能。因此，植物源花青素飼料有提高反芻動物免疫性能和抗氧化能力的作用，有緩解機體熱應(yīng)激的潛力。

當(dāng)奶山羊處于熱應(yīng)激環(huán)境中時，體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能發(fā)生紊亂，F(xiàn)R在體內(nèi)大量聚集且抗氧化酶清除FR的速率下降，造成機體損傷。研究指出，花青素不僅可直接消除體內(nèi)多余的FR數(shù)量，而且有通過激活Nrf2-ARE信號通路，間接抑制NF-κB活性，提高反芻動物機體抗氧化性能的潛在作用，從而緩解機體熱應(yīng)激[3]。目前，花青素研究主要圍繞單胃動物或其他草食動物展開，反芻動物亦多以瘤胃體外產(chǎn)氣實驗為主，現(xiàn)有研究鮮見花青素緩解奶山羊熱應(yīng)激的報道。因此，本試驗旨在研究富含花青素PSS對熱應(yīng)激奶山羊能量利用、血漿代謝和抗氧化參數(shù)的影響，為廣泛應(yīng)用這種新型綠色非常規(guī)飼料資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗采用4×4拉丁方試驗設(shè)計，選取8只體況良好的經(jīng)產(chǎn)薩能奶山羊[體重(41.50±1.84) kg；平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差]隨機分為4組，四種日糧處理分別為(粗飼料均占日糧干物質(zhì)50%)：粗飼料為稻草日糧組(NC)、黏玉米秸稈青貯飼料(sticky corn stover silage，SSS)組(PC1)、SSS+1 g/d商業(yè)紫玉米花青素提取物組(PC2)與紫玉米秸稈青貯飼料組(AR)，見表1。每個處理組8個重復(fù)(n=8)。每期試驗周期持續(xù)21 d，其中最后7 d為樣品采集期。紫玉米花青素提取物購于南京草本源生物科技有限公司。通過高效液相色譜儀檢測，PSS總花青素水平高于SSS(74.55 mg/100 g DM vs. 28.65 mg/100 g DM)。羊只單籠飼養(yǎng)，自由采食和飲水，分別于08:00與17:00飼喂飼糧。羊只營養(yǎng)需要參考NRC[5]，各組飼糧均一次配齊并置于干燥通風(fēng)處保存。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))%

1.2 檢測指標(biāo)

1.2.1 溫濕指數(shù)

將溫濕度記錄儀懸掛于羊圈中部與羊只等高處，測定試驗周期每天06:00、14:00和20:00舍內(nèi)的溫度和相對濕度，根據(jù)Minka和Ayo[6]計算溫濕指數(shù)(THI)。數(shù)據(jù)顯示試驗周期內(nèi)，羊舍全天平均溫度為26.10～37.20 ℃，總平均溫度為30.54 ℃；全天平均濕度為44.00%～94.00%，總平均濕度為72.66%；全天平均溫濕指數(shù)為76.55～90.12，總平均溫濕指數(shù)為82.28。因此，試羊處于中重度熱應(yīng)激環(huán)境范圍。

1.2.2 飼糧營養(yǎng)成分

利用四分法將配好的各組試驗飼糧采集500 g于65 ℃烘箱中烘干后，室溫回潮24 h過1 mm篩粉碎轉(zhuǎn)入自封袋制備風(fēng)干樣。參照AOAC[7]測定飼糧干物質(zhì)(DM)、有機物(OM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、總能(GE)、中性洗滌纖維(NDF)及酸性洗滌纖維(ADF)。運用Parr 6200全自動氧彈量熱儀分析樣品能量。

1.2.3 玉米秸稈青貯飼料蛋白和能量價值參數(shù)

檢測玉米秸稈青貯飼料的中性洗滌不溶蛋白(NDICP)、中性洗滌不溶氮(NDIN)、酸性洗滌不溶蛋白(ADICP)、酸性洗滌不溶氮(ADIN)；維持水平總可消化養(yǎng)分(TDN1X)、維持水平消化能(DE1X)、生產(chǎn)水平消化能(DEP)、生產(chǎn)水平代謝能(MEP)和生產(chǎn)水平泌乳凈能(NELP)預(yù)測參照文獻[8]。每個樣品平行測定3次。

1.2.4 能量代謝參數(shù)

每期最后7 d進行消化代謝試驗，全收糞尿法收集糞樣及尿樣，每天準(zhǔn)確稱量鮮糞并混勻，取10%作為樣品裝入自封袋中，尿液經(jīng)4層紗布過濾后記錄體積，取10%作為試樣，每期的糞樣和尿液混合均勻后置于-20 ℃保存?zhèn)錅y。待試驗結(jié)束后，將糞樣置于65 ℃烘箱中烘至恒重，室溫回潮24 h過1 mm篩粉碎轉(zhuǎn)入自封袋制備風(fēng)干樣，尿樣解凍測定能量。通過公式計算能量平衡狀態(tài)。消化能(DE)=總能(GE)-糞能(FE)；代謝能(ME)=DE-尿能(UE)-甲烷能(Eg)；總能表觀消化能=DE/GE×100%；總能利用率=ME/GE×100%；消化能利用率=ME/DE×100%。

Eg根據(jù)Pelchen和Peters[9]方程預(yù)測。

Eg/GE=1.3+0.112D+L(2.37-0.05D)

式中：Eg/GE為甲烷占總能的百分比(%)；D為總能消化率(%)；L為飼養(yǎng)水平(維持飼養(yǎng)的倍數(shù))。

1.2.5 血漿代謝與抗氧化參數(shù)

在每個周期的20 d，通過K3-EDTA VACUETTE?真空管于晨飼前(0 h)和飼喂后(2、4 h)從頸靜脈采血10 mL，于1 788.6×g 4 ℃離心機離心15 min，上層血漿轉(zhuǎn)移至1.5 mL試管，儲存在-80 ℃?zhèn)錅y。葡萄糖(Glu)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、還原型谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購于Sigma-Aldrich公司。

2型糖尿病（T2DM）是一種臨床常見的代謝紊亂疾病，其主要特征為慢性高血糖以及高血糖致使的多器官損害并發(fā)癥。T2DM的特征性病理生理損害為胰島B細胞功能失調(diào)以及機體的胰島素抵抗（IR）。T2DM引起的最常見的病理改變包括糖尿病神經(jīng)病變以及糖尿病血管病變，這兩種病變成為糖尿病慢性并發(fā)癥的基礎(chǔ)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Excel 2010對數(shù)據(jù)進行基本整理后，試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.1.3統(tǒng)計分析軟件中的MIXED模板進行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計分析模型為：Yij(k)=μ+Ri+Cj+τ(k)+εij(k)，式中：Yij(k)為觀測值，μ為總平均值，Ri為周期隨機效應(yīng)，Cj為奶山羊隨機效應(yīng)，τ(k)為組別固定效應(yīng)，εij(k)為均值為0，方差σ2的隨機誤差。差異顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白和能量價值參數(shù)

由表2可知，SSS和PSS的蛋白和能量價值參數(shù)(NDICP、NDIN、ADICP、ADIN、TDN1X、DE1X、DEP、MEP和NELP)差異均不顯著(P>0.05)。

表2 紫玉米秸稈青貯飼料的蛋白和能量價值參數(shù)

2.2 能量代謝參數(shù)

各組間干物質(zhì)采食量(DMI)差異不顯著(P>0.05)，見表3。相似地，4組間GE攝入量、UE、Eg無顯著(P>0.05)差異。NC組FE顯著(P<0.05)低于PC2組和AR組。與其他組相比，NC組顯示較低水平(P<0.05)的DE、ME、DE/GE和ME/GE。特別地，AR組ME/DE顯著(P<0.05)高于其他組。

表3 紫玉米秸稈青貯飼料對奶山羊能量代謝的影響

2.3 血漿代謝和抗氧化參數(shù)

由表4可見，對Glu，NC組顯著(P<0.05)低于PC2組和AR組。4組間山羊血漿AST和ALT差異均不顯著(P>0.05)。PC1、PC2和AR的UN顯著(P<0.05)低于NC組。對GST，PC2與AR組間差異未達顯著(P>0.05)水平，但均顯著(P<0.05)高于NC和PC1組。不同地，PC2與AR組間差異未表現(xiàn)差異顯著(P>0.05)，但均顯著(P<0.05)低于NC和PC1組。

表4 紫玉米秸稈青貯飼料對奶山羊血漿代謝和抗氧化參數(shù)的影響

3 討論

3.1 紫玉米秸稈青貯飼料的蛋白和能量價值參數(shù)

能量是衡量飼糧營養(yǎng)價值重要指標(biāo)之一，通過檢測奶山羊PSS的蛋白和能量價值參數(shù)，可綜合評價PSS的內(nèi)在品質(zhì)?；ㄇ嗨厥且环N有效的抗氧化劑和FR清除劑，有保護植物免受外界生物和非生物脅迫損傷的作用[10]。此外，自然界的花青素均以糖苷形式存在，花青素中的糖苷可能參與碳水化合物代謝，有為機體提供能量的潛力[11-12]。但是，花青素對山羊機體能量代謝的調(diào)控機制研究鮮見報道，尚待進一步研究與驗證。Suksombat和Junpanichcharoen[13]試驗指出，反芻動物攝入高濃度NELP的粗飼料，機體也會表現(xiàn)較高水平的NELP，更有利于機體的泌乳性能。本研究發(fā)現(xiàn)，SSS與PSS各項能量價值參數(shù)(DE1X、DEP、MEP、NELP)差異均較小，一方面，表明飼予PSS不會降低奶山羊能量需要，影響產(chǎn)奶量，為花青素緩解機體熱應(yīng)激奠定基礎(chǔ)；另一方面，說明在給奶山羊提供能量方面，兩者粗飼料的功能可能基本相同，可以實現(xiàn)能量相互替換[14]。

3.2 紫玉米秸稈青貯飼料對奶山羊能量代謝參數(shù)的影響

反芻動物汗腺不發(fā)達，處于高溫環(huán)境下的山羊難以通過皮膚蒸發(fā)散熱調(diào)節(jié)體溫，更易發(fā)生熱應(yīng)激，影響生產(chǎn)性能。一方面，熱應(yīng)激奶山羊降低DMI攝入，不能滿足機體能量需要，消耗組織維持機體需要。另一方面，熱應(yīng)激奶山羊加快皮膚和肺部血流量，減少胃腸道血流量，導(dǎo)致胃腸黏膜和細胞受損，降低營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。奶山羊更喜食甜味飼糧，花青素較苦澀，可能降低動物的采食量。本研究顯示各組間DMI差異較小(表3)，說明PSS不降低熱應(yīng)激奶山羊適口性。有趣地，與PC2比，AR組山羊顯示更高水平消化能利用率，可能與植物和提取物花青素在反芻動物中的代謝吸收效率差異有關(guān)[15]。研究發(fā)現(xiàn)，花青素既能有效清除體內(nèi)過多FR，協(xié)助機體修復(fù)損傷細胞，促進細胞新陳代謝；又可促進谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的分泌，加強機體自身清除FR的能力[2]。據(jù)本實驗數(shù)據(jù)可知，富含花青素PSS有提高奶山羊消化能、代謝能、總能表觀消化率、總能利用率及消化能利用率的作用，因此，花青素有改善機體能量代謝的潛力。自然界少見游離的花青素，常與一個或多個葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖結(jié)合形成，花青素結(jié)構(gòu)中糖類物質(zhì)可能參與奶山羊中的能量代謝途徑，進一步有提高體內(nèi)抗氧化酶活性、抑制體內(nèi)FR數(shù)量的作用，這也是將來研究熱點之一。

3.3 紫玉米秸稈青貯飼料對奶山羊血漿代謝和抗氧化參數(shù)的影響

肝臟是機體重要解毒器官，轉(zhuǎn)氨酶可用來判斷肝臟損害程度，是檢測肝功能重要指標(biāo)。熱應(yīng)激增加反芻動物細胞膜通透性，胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶釋放入血，增加肝臟代謝負擔(dān)。研究發(fā)現(xiàn)，動物能量攝入與血漿AST和ALT水平呈正相關(guān)關(guān)系[16]。Hosoda等[17]試驗指出，泌乳期奶牛補飼富含花青素紫玉米青貯飼料對ALT無顯著性影響，但可顯著降低血漿AST的濃度，這可能與攝入能量水平有關(guān)。本研究中，各組日糧等能等氮，且DMI差異不顯著(表3)，因此，奶山羊補飼PSS/紫玉米提取物不影響血漿AST和ALT濃度，說明PSS對熱應(yīng)激試羊肝臟代謝無副作用影響。

血液UN含量是動物機體蛋白質(zhì)代謝的主要終末產(chǎn)物之一，高分解代謝狀態(tài)可引起UN含量升高。熱應(yīng)激降低奶山羊消化機能，可導(dǎo)致飼糧蛋白質(zhì)在瘤胃中降解為氨，經(jīng)由瘤胃吸收進去血液造成氨濃度升高，進而轉(zhuǎn)化為尿素排出體外。本實驗發(fā)現(xiàn)PC1、PC2、AR組顯示較高水平的能量利用效率(表3)，因此，在奶山羊飼糧中飼喂PSS對肝臟代謝負擔(dān)無副作用影響。Hosoda等[17]研究顯示，泌乳奶牛飼喂富含花青素紫玉米青貯飼料，顯示較高水平血漿UN，可能與飼糧較高水平蛋白質(zhì)有關(guān)。本研究所有試羊在飼養(yǎng)周期均處于健康狀態(tài)，飼糧蛋白質(zhì)水平一致，因此血漿UN水平無顯著性差異。

動物發(fā)生熱應(yīng)激，易造成腸道內(nèi)缺氧缺血，誘發(fā)內(nèi)源性FR產(chǎn)生，F(xiàn)R可根據(jù)刺激機體時間的長短與氧化應(yīng)激的程度誘導(dǎo)相關(guān)信號通路，影響機體健康。研究表明，花青素作為Nrf2的活化劑，可直接修飾Keap1存在的傳感器半胱氨酸，激活Nrf2并誘導(dǎo)具有抗氧化功能的細胞保護蛋白；同時間接抑制NF-κB信號通路，降低相關(guān)炎癥因子的基因表達，達到提高反芻動物抗氧化性能的作用[3]。因此，花青素可通過增強機體Mn-SOD、Cu/Zn-SOD和GSH-Px 等mRNA表達提高動物抗氧化能力[18]。GST是機體解毒過程的關(guān)鍵酶，催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)起始步驟。本試驗結(jié)果顯示，在奶山羊飼糧中補飼PSS或紫玉米提取物可顯著增強血漿GST濃度。GSH參與體內(nèi)氧化還原過程，可與過氧化物或FR反應(yīng)，減弱氧化應(yīng)激?；ㄇ嗨貨]有提高熱應(yīng)激奶山羊血漿GSH作用，可能是SOD將毒性更高的超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為毒性較低的過氧化氫，對熱應(yīng)激奶山羊已有緩解作用[2]。MDA是氧化反應(yīng)終產(chǎn)物，可引起核酸、蛋白質(zhì)等生命大分子交聯(lián)聚合，降低機體抗氧能力?；ㄇ嗨啬転镕R提供電子，預(yù)防FR氧化鄰近細胞，保持處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時宿主動物FR平衡。因此，PSS或紫玉米提取物可顯著降低血漿MDA水平。這說明花青素可提高奶山羊血漿抗氧化酶的活性，減少機體過程中FR和過氧化物等的生成，有提高機體抗氧化性能，進一步緩解奶山羊熱應(yīng)激的潛力。Ngo Thi[19]報道，飼予生長肉羊富含花青素象草青貯飼料有提升血漿GST和GSH，降低MDA水平的趨勢。Hosoda等[20]試驗表明，在綿羊飼糧中補飼富含花青素青貯稻草有改善機體血漿抗氧化酶活性的作用。

4 結(jié)論

富含花青素PSS是一種值得推廣的優(yōu)良粗飼料，因為PSS蛋白和能量價值參數(shù)與SSS差異較??；PSS可提高熱應(yīng)激奶山羊消化能利用率，改善能量利用效率；PSS對熱應(yīng)激奶山羊血漿代謝參數(shù)無副作用影響，可提高血漿抗氧化能力，有助于緩解山羊熱應(yīng)激。