陳蕭月，張永強，饒 青，宋晶睿，李艷梅*

1.貴州大學(xué)醫(yī)學(xué)院(貴州 貴陽 550025)

2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點實驗室(貴州 貴陽 550014)

2019年12月以來，武漢市部分醫(yī)院陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多例有華南海鮮市場暴露史的不明原因肺炎病例，現(xiàn)已證明為一種新型冠狀病毒感染引起的急性呼吸道傳染性疾病，其大規(guī)模傳播已成為全球性的主要流行病學(xué)事件，隨即世界衛(wèi)生組織(WTO)將其正式命名COVID－19[1]。由于我國采取的嚴格防控措施和治療手段，病毒在我國的蔓延已經(jīng)初步抑制，這其中中藥在防治新冠肺炎中起到關(guān)鍵性作用。目前疫情在全球蔓延，并已感染了全球220個國家和地區(qū)，總感染人數(shù)超過157，825，944例[2]。由于沒有有效的防控措施，WTO最終要求會員國擴大應(yīng)急反應(yīng)機制并尋找新的疫苗和有效藥[3]。

趙軍寧等[4]認為對于COVID－19的治療主要通過抗病毒、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等，其次增強對于靶器官的保護、解熱、化痰等。甘草－杏仁出自于《金匱要略》中的茯苓杏仁甘草湯，甘草味甘，性平，主五臟六腑寒熱邪氣，具有清熱解毒以及滋潤肺部的作用，日常多用于治療咳嗽、痰多；杏仁味甘，性溫，主咳逆上氣，使肺氣下通。二者結(jié)合有行氣利水、升散外邪。李安琪等[5]通過此藥成功治愈炎癥與發(fā)熱患者。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，通過篩選甘草－杏仁活性成分、預(yù)測靶點蛋白及信號通路、構(gòu)建“中藥－活性成分－靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，從而預(yù)測活性成分、靶點蛋白和疾病通路之間的潛在作用機制，為中藥治療COVID－19提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 甘草－杏仁有效化合物及作用靶點篩選通過運用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查詢單味藥的有效活性成分[6]，以“甘草”“杏仁”為搜索關(guān)鍵詞，收集全部活性成分，并對其進行數(shù)據(jù)整理。依據(jù)篩選原則口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18篩選出中藥各自的活性成分及對應(yīng)的靶點信息，將篩選出的有效成分靶點進行整理后輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org)轉(zhuǎn)換為Gene Symbol并獲得Swiss－Prot ID。

1.2 COVID－19疾病靶點的收集檢索COVID－19的重要靶點，以“Novel coronavirus pneumonia”為關(guān)鍵詞，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(http://www/genecards.org)，根據(jù)篩選原則:篩選GeneCards數(shù)據(jù)庫中疾病與靶點相關(guān)性得分＞0.18的基因，將得到的疾病靶點與藥物靶點進行交集處理獲得共同靶點。

1.3 甘草－杏仁治療COVID－19關(guān)鍵蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將獲得的藥物－疾病共同靶點導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫(http://string－db.org/)，限定物種為“homo sapiens”，設(shè)置最低相互作用閾值(中等置信度)0.4，其余參數(shù)保持默認設(shè)置。

1.4 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因利用Cytoscape 3.7.2軟件插件Bisogenet進行靶蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建，并利用CytoNCA插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，將第一次篩選條件將度中心性DC設(shè)置為大于62，第二次篩選條件設(shè)置為中間中心性BC＞200。

1.5 “藥物－成分－疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“藥物－成分－疾病靶點”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(note)代表甘草－杏仁活性成分及治療靶點；網(wǎng)絡(luò)中邊(edge)代表“單味藥－活性成分”以及“活性成分－治療靶點”的對應(yīng)連接線；圖中節(jié)點連線的多少用度(degree)來表示。

1.6 關(guān)鍵靶點GO富集分析與KEGG通路分析將關(guān)鍵靶點基因輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中，分別得到GO富集生物學(xué)過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細胞組成(cellular component，CC)，以及KEGG Pathway信號通路富集分析圖，通過繪制氣泡圖和詞云圖來研究交集靶點的富集功能，進而闡述甘草－杏仁藥對治療COVID－19富集的主要信號通路。

1.7 成分－靶點分子對接從PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載SARS－CoV－2 3CL水解酶(PDB ID:6lu7)和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶II(ACE2)(PDB ID:1r42)的3D結(jié)構(gòu)pdb格式文件，運用Pymol軟件對蛋白進行加氫、去水以及去除配體的操作并重新保存為pdb格式。從ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org)下載化合物的3D結(jié)構(gòu)保存為mol2格式。利用Auto Dock軟件將化合物以及靶蛋白轉(zhuǎn)換為pdbqt格式文件，最后運行Vina進行分子對接。結(jié)合能＜0時說明配體小分子能夠自發(fā)的與受體蛋白結(jié)合在一起，并且能量越低結(jié)合越穩(wěn)定，發(fā)揮作用的可能性越大。

1.8 研究方案設(shè)計本研究的整個分析步驟如圖1所示。COVID－19疾病靶點基因通過GeneCards數(shù)據(jù)庫挖掘。用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選甘草－杏仁藥對的有效活性成分和對應(yīng)的靶點信息，用STRING數(shù)據(jù)庫對其GO功能富集和信號通路富集分析。運用Auto Dock軟件將篩選到的主要有效成分與SARSCoV－2 3CL水解酶、ACE2進行分子對接，技術(shù)路線如圖1。

圖1 甘草－杏仁治療COVID－19機制分析技術(shù)路線圖

2 結(jié)果

2.1 甘草－杏仁有效化合物和作用靶點的篩選通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到甘草－杏仁共393個化合物，其中甘草280個，杏仁113個，根據(jù)藥物成分活性原則篩選OB≥30%、DL≥0.18，進一步篩選甘草－杏仁中甘草92個、杏仁19個有效活性成分，對應(yīng)的靶點共1389個，將靶點信息輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因名和Swiss－Prot ID標準化。

2.2 疾病靶點收集設(shè)定篩選條件從GeneCards數(shù)據(jù)庫中篩選出疾病相關(guān)靶點259個，根據(jù)篩選原則疾病與靶點相關(guān)性得分＞0.08。為了方便后續(xù)統(tǒng)計分析，將所獲靶點轉(zhuǎn)化為Uniprot數(shù)據(jù)庫統(tǒng)一識別碼格式。

2.3 甘草－杏仁潛在活性成分治療COVID－19的作用靶點預(yù)測將藥物有效成分靶點信息輸入到Uniprot數(shù)據(jù)庫進行基因名和Swiss－Prot ID標準化，得到Gene symbol形式。將化合物靶點與藥物靶點進行映射得到46個共同基因作為甘草－杏仁治療COVID－19的靶基因，見表1。

表1 甘草－杏仁治療新冠病毒肺炎COVID－19的潛在靶點蛋白信息表

續(xù)表1

2.4 靶點蛋白PPI相互作用關(guān)系將獲得的46個交集靶點蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，設(shè)置置信度為0.4和“Human Sapiens”為篩選種屬。得到的PPI網(wǎng)絡(luò)圖包含46個蛋白節(jié)點，620條蛋白相互作用連接線，平均節(jié)點度值為27，平均局部聚類系數(shù)為0.818，在線繪制網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)。

圖2 甘草－杏仁靶點蛋白－蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 網(wǎng)絡(luò)拓撲分析結(jié)果根據(jù)“藥物－疾病”靶點的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)文本形成初步PPI網(wǎng)絡(luò)，共有154 264個節(jié)點，第一次根據(jù)DC＞62篩選后得到1 488個節(jié)點，第二次根據(jù)BC＞200篩選后得到217個節(jié)點的網(wǎng)絡(luò)圖(圖3)。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析

2.6 構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖采用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“甘草杏仁－有效成分－疾病靶點”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，其中包含112個潛在有效成分和46個作用靶點，在可視化網(wǎng)絡(luò)中得到藥物靶向蛋白環(huán)氧化酶2(PTGS2，degree＝91)、絲裂原活化蛋白激酶－14(MAPK14，degree＝51)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(NOS2，degree＝67)，這3個蛋白可能為藥對治療COVID－19主要靶點(圖4)。

圖4 甘草－杏仁－有效化合物－作用靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 GO富集分析和KEGG通路分析結(jié)果將46個交集蛋白輸入到STRING數(shù)據(jù)庫進行生物富集分析得到GO生物學(xué)過程(biological processes，BP)1183條涉及生物調(diào)節(jié)、對刺激的反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)等(圖5A)，GO分子功能(molecular function，MF)106條涉及酶結(jié)合、離子結(jié)合、有機化合物結(jié)合等(圖5B)，細胞組成(cellular component，CC)57條涉及細胞外間隙、內(nèi)膜系統(tǒng)等(圖5C)，且對結(jié)果分析得到誤差發(fā)生率(FDR)＜0.05。表明甘草－杏仁通過參與多種細胞過程從而發(fā)揮抑制COVID－19的作用，柱狀圖越長說明富集的基因越多。

圖5 甘草－杏仁有效成分靶點GO富集功能分析圖

進一步通過KEGG富集分析得到167條通路，按照靶點降數(shù)篩選20條靶點富集最多的通路，涉及IL－17信號通路、癌癥通路、TNF信號通路等信號通路，繪制氣泡圖和詞云圖(圖6)。

圖6 甘草－杏仁有效作用靶點KEGG pathway氣泡圖與詞云圖

2.8 核心成分與ACE2和SARS－CoV－2 3CL水解酶分子對接結(jié)果分析通過藥物－疾病靶點篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草－杏仁中主要有效成分有槲皮素、山奈酚和柚皮素等。為了進一步證明藥物有效成分對COVID－19的潛在治療作用，將3個主要有效成分分別與ACE2蛋白和SARS－CoV－2 3CL水解酶進行分子對接。一般認為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，發(fā)生作用的可能性就越大。對接結(jié)果如圖7，其中槲皮素通過HIS493、TKP207，山奈酚通過PRO490、THR26和GLY143，柚皮素通過TRP610，分別與ACE2蛋白SARS－CoV－2 3CL水解酶形成穩(wěn)定氫鍵。由此表明槲皮素、山奈酚、柚皮素與靶蛋白具有較好的結(jié)合活性(圖7)。

圖7 分子對接結(jié)果

3 討論

本研究通過運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，篩選出甘草－杏仁中潛在的有效成分獲取其靶點，映射到治療COVID－19的靶點，建立“藥物－有效成分－靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)圖，通過進一步篩選得到88個潛在活性成分和46個靶點蛋白，從系統(tǒng)層面揭示甘草－杏仁藥對治療COVID－19疾病的藥理學(xué)機制。

通過對“藥物－有效成分－靶點”可視化網(wǎng)絡(luò)圖的遴選得到主要有效成分包括:槲皮素(MOL000098)、山奈酚(MOL000422)、柚皮素(MOL004328)等。已有研究表明槲皮素通過抑制IL－6、MCP－1、IP－10、TNF－α、VEGF等炎癥因子的產(chǎn)生從而發(fā)揮抗炎作用[7]。Si等[8]觀察到槲皮素和碳六烯酸聯(lián)用可以抑制一氧化氮(NO)、前列腺素E2(PGE2)和環(huán)氧化酶－2(COX－2)的表達水平，減少脂多糖(LPS)刺激的RAW264.7細胞的炎癥介質(zhì)水平，從而發(fā)揮一定抗炎作用。山奈酚為黃酮類化合物，具有調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及自噬作用并對功能失調(diào)的細胞具有保護作用，通過調(diào)節(jié)非癌性細胞的自噬來保護細胞免疫功能障礙[9－10]。柚皮素可以作用于巨噬細胞激活抗炎反應(yīng)因子Nrf2導(dǎo)致血紅霉素－1(H0－1)的表達[11]。本研究結(jié)果顯示PTGS2、MAPK14、NOS2、PPARG、INF、IL2、CCL2、IL－10、CXCL8、STAT1、CASP8等自由度最高，可視為甘草－杏仁藥對治療COVID－19的主要靶點。其中IL2、CXCL8、CCL2、IL10、INF等為重要的炎癥因子[12]。絲裂原活化蛋白激酶－14(MAPK－14)是絲裂原活化蛋白激酶家族(MAPKs)的重要成員之一，可通過促進SIRT1、FOXO、p53等活性因子抑制NF－κB活性從而減少炎性因子白介素的累積，減弱體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[13]。PTGS2在影響RNA病毒復(fù)制等方面發(fā)揮著重要作用[14]。NOS2利用NO的氧化應(yīng)激協(xié)助巨噬細胞對抗病原體[15]。

GO生物功能富集分析及KEGG信號通路分析結(jié)果顯示，甘草－杏仁在治療COVID－19過程中主要涉及到癌癥通路、AGE－RAGE信號通路、IL－17信號通路、TNF信號通路等，均與炎癥發(fā)生過程密切相關(guān)。分子對接結(jié)果顯示，甘草－杏仁中主要有效成分槲皮素、山奈酚、柚皮素與靶蛋白ACE2、SARSCoV2－3CL水解酶具有穩(wěn)定的結(jié)合構(gòu)象。

綜上所述，甘草－杏仁治療COVID－19的作用機制可能通過抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細胞應(yīng)激及功能障礙等過程起到潛在的治療目的。由于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)本身具有一定的局限性，甘草－杏仁的活性成分是否通過PTGS2、MAPK14、NOS2等作用于癌癥通路、AGE－RAGE信號通路、IL－17信號通路和TNF通路而起到抑制COVID－19的作用仍需要進一步證明。