郭建儀，呂 靜，馬銘悅，張春輝，莊曉巖，張忠勝

1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)(遼寧 沈陽 110847)

2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院(遼寧 沈陽 110032)

慢性腎臟疾病在發(fā)展中國家非常普遍，對國家和社會造成很大負(fù)擔(dān)[1]。慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)指疾病遷延發(fā)展所致的慢性腎臟病，會有腎臟纖維化和萎縮的表現(xiàn)，最終水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂，周身臟器受損，危及患者生命[2]。

郭恩綿教授認(rèn)為CRF發(fā)病機制是濕濁毒邪內(nèi)蘊，損傷肺脾腎三臟，之后侵及心肝，導(dǎo)致五臟虛損，氣血陰陽不足，元氣虛衰，因此命名為“虛勞水氣病”[3]。以“腎虛毒蘊”的病機理論，提出補脾益腎，祛濕化濁，活血散瘀利水的治法，并歸納出角藥、藥對，分期而治[4]。本文所論“藿香－佩蘭－大黃”是郭老治療CRF常用角藥，臨床效果顯著?！敖撬帯笔侨吨兴巺f(xié)同應(yīng)用，源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》“一君二臣，奇之制也”的理論，始見于《傷寒雜病論》[5]。通過分析中藥特性，將三味中藥合理地配伍，功效變化無窮，如三足鼎立，互為犄角[6]。

“藿香－佩蘭－大黃”作為郭恩綿教授治療CRF常用角藥，可有效改善CRF的癥狀，臨床應(yīng)用非常廣泛，但缺少細(xì)胞和分子水平闡述。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門綜合學(xué)科，能夠揭示各類藥物對機體的調(diào)控原理[7]。本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探析“藿香－佩蘭－大黃”角藥治療CRF的核心成分、核心靶點、關(guān)鍵通路及其作用機制，為后續(xù)實驗研究提供依據(jù)與思路。

1 資料與方法

1.1 收集篩選“藿香－佩蘭－大黃”活性成分及其作用靶點通過中醫(yī)藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP)尋找三味中藥化學(xué)組成成分，本文所論藿香為廣藿香。以口服利用度≥30%且類藥性≥0.18對藥物活性成分進行ADME屬性篩選以獲得活性化合物。篩選出的活性成分，進一步在TCMSP平臺篩選其相關(guān)作用靶點。查詢Uniprot數(shù)據(jù)庫，明確各靶點蛋白相對應(yīng)的基因名稱。

1.2 收集篩選CRF靶點基因以“chronic renal failure”“慢性腎衰竭”為關(guān)鍵詞，分別在Genecards數(shù)據(jù)庫、Drugbank數(shù)據(jù)庫、TTD數(shù)據(jù)庫收集與CRF有關(guān)的靶點基因。Genecards數(shù)據(jù)庫有Relevance score值表示靶點與疾病關(guān)聯(lián)程度。Genecards數(shù)據(jù)庫得到疾病靶點過多，篩選Relevance score＞中位數(shù)的疾病靶點納入分析，若還是過多，再次用此法篩選，最后將3個數(shù)據(jù)庫的靶點基因合并去重。

1.3 獲取藥物與疾病的共同靶點將得到的“藿香－佩蘭－大黃”活性成分靶點基因和CRF靶點基因輸入Venny平臺，得到交集靶點，構(gòu)建韋恩圖。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)將1.3獲取其交集靶點基因提交STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建初步蛋白質(zhì)相互作用模型，下載tsv文件，利用Cytoscape對PPI網(wǎng)絡(luò)進一步分析構(gòu)圖，得到高級PPI網(wǎng)絡(luò)，再通過Metascape平臺得到潛在蛋白質(zhì)功能模塊。

1.5 GO功能、KEGG通路富集分析將交集靶點提交Metascape平臺，進行GO和KEGG富集分析。GO包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細(xì)胞組成(CC)。各篩選前20個結(jié)果，用Bioinformatics作氣泡圖。

1.6 構(gòu)建“藥物活性成分－疾病靶點－通路”網(wǎng)絡(luò)篩選與93個交集靶點有關(guān)系的活性成分，藿香－佩蘭－大黃初步納入的19個活性成分中排除表1中的DH4。錄入角藥活性成分、交集靶點、20條KEGG富集通路，在cytoscape 3.7.1中，繪制“藥物活性成分－靶點－通路”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7 分子對接驗證在Pubchem數(shù)據(jù)庫檢索核心成分結(jié)構(gòu)，保存mol格式。利用PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，查詢并下載核心靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu)，保存PDB格式。使用PyMol軟件去掉蛋白結(jié)構(gòu)的水分子和小分子配體，然后導(dǎo)入AutoDockTools進行加氫處理，將有效成分和核心蛋白均轉(zhuǎn)成pdbqt格式文件。運行AutoDockTools對核心成分和核心靶點分別進行對接，記錄最低結(jié)合能數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 藥物活性成分及靶點篩選在TCMSP初步收集藿香化學(xué)成分94種，佩蘭化學(xué)成分60種，大黃化學(xué)成分92種，ADME篩選之后得到藿香化學(xué)成分11種，佩蘭化學(xué)成分7種，大黃化學(xué)成分10種。再次經(jīng)過對相關(guān)文獻及數(shù)據(jù)庫的查詢，最終納入化學(xué)成分藿香8種，佩蘭7種，大黃7種，藿香成分靶點165個，見表1。佩蘭成分靶點84個，大黃成分靶點64個，去掉3者重復(fù)值，角藥成分靶點共204個。

表1 “藿香－佩蘭－大黃”角藥活性成分

2.2 藥物與疾病交集靶點的獲取Genecards數(shù)據(jù)庫收集疾病靶點基因8 258個，數(shù)目過多，將score從大到小排列，取中位數(shù)，按照Relevance score＞中位數(shù)加以篩選，反復(fù)3次，獲得CRF靶點基因1035個，合并Drugbank、TTD數(shù)據(jù)庫去重，共獲1 064個靶點基因。利用Venny平臺，獲取成分和疾病交集靶點，有93個，見圖1。

圖1 藥物－疾病靶點韋恩圖

2.3 藥物治療CRF的PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建角藥與CRF交集靶點共93個，在STRING平臺得到初級PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)。下載tsv數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1，構(gòu)建更加清晰的高級PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。此PPI網(wǎng)絡(luò)由93個節(jié)點和1801條連線構(gòu)成，節(jié)點面積越大，顏色越深，則越重要。Degree值排名前7的節(jié)點為AKT1、IL6、TNF、VEGFA、TP53、CASP3、MAPK1，分別是81、75、75、75、73、72、70，這些靶點可能是藥物治療CRF的關(guān)鍵靶點。

圖2 初級PPI圖

圖3 高級PPI圖

通過Metascape平臺分子復(fù)合物檢測算法(MCODE)識別其內(nèi)在module，見圖4。根據(jù)Log10(P)值，各保留3個最佳生物學(xué)進程，見表2。

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)module功能描述

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)的module

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析Metascape作GO功能分析，其中CC427個，MF611個，BP5292個；KEGG富集412條通路。分別取前20個，在Bioinformatics平臺繪制GO、KEGG氣泡圖，見圖5。圖左側(cè)為富集名稱，氣泡顏色由紅到綠代表P值由大到小，氣泡越大代表該通路的基因計數(shù)越多，橫軸代表輸入基因占該通路基因的比率。

圖5 GO、KEGG氣泡圖

GO富集分析結(jié)果:BP主要集中在對無機物的反應(yīng)、凋亡信號通路、細(xì)胞遷移的正向調(diào)控等；CC主要膜筏、囊泡腔、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)域等；MF主要在激酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白域特異性結(jié)合。

KEGG富集分析結(jié)果顯示:PI3K－Akt信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE－RAGE信號通路、乙型肝炎、癌癥途徑等。

2.5 “藥物活性成分－疾病靶點－通路”網(wǎng)絡(luò)圖將“藿香－佩蘭－大黃”藥物活性成分、交集靶點基因、20條KEGG富集通路，上傳到Cytoscape，繪制網(wǎng)絡(luò)圖，見圖6。其中方形表示關(guān)鍵靶點基因，V形表示通路，圓形表示活性成分。網(wǎng)絡(luò)圖反映出角藥治療CRF有“多成分、多靶點、多通路”的機制。

圖6 藥物－疾病靶點－通路網(wǎng)絡(luò)圖

通過Cytoscape內(nèi)置的NetworkAnalyzer插件分析角藥治療CRF的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)，獲取核心成分及靶點。槲皮素、木犀草素為核心成分，Degree值分別為76、35。尼泊爾鳶尾異黃酮、β－谷甾醇、豆甾醇、蘆薈大黃素為重要成分，Degree值分別為15、13、8、8。PTGS2、RELA、TNF為核心靶點，Degree值為28、17、17。MAPK1、JUN、AKT1、RXRA、IL6為重要靶點，Degree值分別為16、16、16、15、15。

2.6 分子對接根據(jù)2.5中獲得的核心成分及核心靶點，選擇核心成分槲皮素、木犀草素與前3名靶點蛋白進行分子對接，驗證作用機制。兩者結(jié)合自由能越小，表明親和力越大，越穩(wěn)定，見表3。

表3 核心成分與靶點蛋白最低結(jié)合能

將核心成分與各靶點蛋白結(jié)合的化合物，可視化處理，見圖7、圖8、圖9。以上分子對接結(jié)合能數(shù)值＜－7.0，說明核心成分和靶點蛋白結(jié)合很穩(wěn)定，驗證了研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。

圖7 槲皮素、木犀草素與PTGS2的分子對接

圖8 槲皮素、木犀草素與RELA的分子對接

圖9 槲皮素、木犀草素與TNF的分子對接

3 討論

中醫(yī)并無CRF的直接記載，目前都是依據(jù)臨床表現(xiàn)，將其歸于“癃閉”“關(guān)格”“腰痛”“虛勞”等范疇[8]。CRF是腎臟疾病發(fā)展的最終結(jié)局，表現(xiàn)為五臟皆虛，氣血陰陽不足，其中元氣虛衰為核心。水氣病，首見于《金匱要略·水氣病脈證并治》，多指水液代謝類的疾患，以水腫為主要表現(xiàn)[9]。郭老認(rèn)為CRF源于水氣病，又有虛勞之本質(zhì)，獨創(chuàng)將其命名為“虛勞水氣病”[3]。認(rèn)為關(guān)鍵病機是腎虛毒蘊，治療上以甘溫扶陽、補益脾腎為本，再針對濁毒、瘀毒、水毒、濕毒的不同來用藥，泄?jié)峤舛臼腔局畏āＥR床常用藿香、佩蘭配伍大黃芳香化濁、通腑泄毒。藿香振奮脾胃之氣，佩蘭重在行氣，大黃入血分可泄血中之熱，化血中之瘀毒；入氣分則燥濕攻積，瀉火解毒，如此“溺毒”可從血中解，從胃腸中除。三藥協(xié)作，祛中焦?jié)駳?，振脾胃陽氣，使邪有所出，體現(xiàn)“魄門亦為五臟使”的理論[10]。

“藿香－佩蘭－大黃”角藥治療CRF有效成分中核心成分是槲皮素、木犀草素，核心靶點是PTGS2、RELA、TNF。有研究發(fā)現(xiàn)槲皮素可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和iNOs/p38MAPK通路對腺嘌呤誘導(dǎo)的CRF衰竭大鼠有緩解作用[11]，還可降低CRF大鼠腎組織及血清EPO值，改善其鐵代謝紊亂[12－13]；抑制CRF大鼠腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤[14]；防治泌尿功能衰竭[15]。木犀草素目前沒有直接對CRF的相關(guān)研究，但是CRF與糖尿病腎病有一定聯(lián)系。木犀草素有抗氧化作用，研究顯示[16－17]通過降低腎組織內(nèi)PAI－1、TGF－β1等表達；上調(diào)Nrf2激活抗氧化酶HO－1、SOD、γ－GCS的表達，保護STZ引發(fā)的糖尿病大鼠的腎臟功能。尼泊爾鳶尾異黃酮、β－谷甾醇、豆甾醇、蘆薈大黃素等重要成分都有抗氧化、抗炎作用。PTGS2又叫做環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase－2，COX－2)，在血管、腎小球、腎小管等表達。有研究顯示[18]COX－2在腎血流動力學(xué)和電解質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，與腎小球硬化以及腎功能惡化有關(guān)。抑制COX－2的過度表達是預(yù)防和治療CRF的有效途徑之一[19]。

富集分析顯示PI3K－AKT通路、IL－17通路、AGE－RAGE通路、NF－κB通路等。IL－17信號通路在急慢性炎癥中發(fā)揮著重要作用，有效靶點TNF、PTGS2富集在IL－17信號通路上。有研究顯示[20－21]螺內(nèi)酯和有氧運動都可抑制AGE－RAGE信號通路，減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。RELA是NF－κB家族重要成員，通過乙?；?、甲基化等形式來調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)基因表達，涉及腫瘤、炎癥、免疫反應(yīng)等眾多生理和病理活動[22]，可調(diào)控NF－κB通路抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[23]。AKT位于PI3K－AKT通路上，激活后介導(dǎo)多種生物學(xué)效應(yīng)。CRF主要病理改變便是腎臟纖維化，多個研究[24－26]表明土茯苓、抗纖靈水煎劑可以通過抑制PI3K－AKT通路來抑制腎間質(zhì)纖維化。分子對接結(jié)果顯示兩個核心成分槲皮素、木犀草素與PTGS2、RELA、TNF親和力很好，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，“藿香－佩蘭－大黃”角藥治療CRF通過槲皮素、木犀草素等多個成分，作用于PTGS2、RELA等多個靶點，調(diào)控PI3K－AKT通路、IL－17通路等多個信號通路，調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)、減少氧化應(yīng)激、改善細(xì)胞異常增殖及凋亡，延緩腎纖維化進程，起到保護腎臟作用。對于臨床用藥提供了理論支持，后期會進一步實驗驗證。