閆有圣，劉春蓮，譚亞，楊鍇，王一鵬，劉妍，陰赪宏*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，北京 100026；2.北京婦幼保健院，北京 100026；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，銀川 750004；4.北京大學(xué)國際醫(yī)院婦產(chǎn)科部，北京 102206)

葡萄胎(Hydatidiform Mole，HM)是一種良性的妊娠滋養(yǎng)層疾病，表現(xiàn)為絨毛腫脹和滋養(yǎng)層過度增生，沒有正常的胚胎發(fā)育。在西方國家HM的發(fā)生率為0.03%～0.10%，而在中國和日本HM的發(fā)生率為0.20%[1-2]。HM通常是散發(fā)的，初次發(fā)生HM后，HM再發(fā)風(fēng)險為1%～6%，既往有2次HM妊娠史的孕婦再次妊娠時會有10%左右再次發(fā)生HM[3]。復(fù)發(fā)性葡萄胎(Recurrent Hydatidiform Moles，RHMs)也偶爾發(fā)生在家庭多個女性成員中，表現(xiàn)為家族中多個女性成員反復(fù)出現(xiàn)HM，也伴多次自然流產(chǎn)、死胎等，被稱為家族性復(fù)發(fā)性葡萄胎(Family Recurrent Hydatidiform Moles，F(xiàn)RHM)[4]。

FRHM是一種常染色體隱性遺傳疾病，其病理類型主要表現(xiàn)為完全葡萄胎(Complete Hydatidiform Mole，CHM)。散發(fā)性CHM是孤雄來源或者雙雄受精的結(jié)果，但是家族性復(fù)發(fā)性的CHM通常是雙親來源CHM(Biparental CHMs，BiCHMs)，即胚胎包含有父源和母源的基因組[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，RHMs患者中48%～80%存在NLRP7突變，在未檢測到NLRP7突變的RHMs患者中有10%～14%檢測到KHDC3L突變[6]。為了進一步證實FRHM的遺傳學(xué)因素，并探索新的NLRP7和KHDC3L突變，本研究對我國北方1個近親結(jié)婚的FRHM家系進行了相關(guān)遺傳學(xué)分析。

資料和方法

一、研究對象

先證者，35歲，女性，回族，因RHMs于2019年8月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖中心，孕10產(chǎn)0，3次流產(chǎn)物經(jīng)病理確認為CHM。先證者父母為姑舅親近親婚配，共生育7人，其中3女4男。先證者妹妹，28歲，自然流產(chǎn)3次，第3次流產(chǎn)物病理確認為CHM；先證者姐姐，41歲，正常生育2男1女，表現(xiàn)正常；先證者3個哥哥和1個弟弟均正常生育，表現(xiàn)正常，該FRHM家系圖譜見圖1。該研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心倫理委員會批準，先證者及家系成員均簽署知情同意書。

Hom：純合突變(箭頭為先證者)；WT：野生型；Het：雜合突變

二、標(biāo)本采集及DNA提取

采集先證者及其丈夫、父母、妹妹外周血5 ml，采用乙二胺四乙酸(EDTA)進行抗凝處理。先證者姐姐、哥哥和弟弟采用唾液采集器(廈門致善生物科技)收集口腔脫落細胞。血液標(biāo)本和口腔脫落細胞均采用血液/細胞基因組DNA提取試劑盒(天根生化)提取基因組DNA，采用NanoDrop2 000(Thermo，美國)進行核酸定量和純度分析。

三、全外顯子組測序分析

采用SureSelect Human All Exon V6試劑盒(Agilent，美國)、Illumina Cluster試劑盒(Illumina，美國)和SBS試劑盒(Illumina，美國)進行全外顯子組捕獲和建庫，在Illumina×10高通量測序平臺(Illumina，美國)進行全外顯子組測序。全外顯子組測序由諾禾致遠生物科技公司完成。

四、測序數(shù)據(jù)分析

測序片段通過BWA軟件(V 0.7.9a)與參考基因組(GRCh37/hg19)進行比對，比對結(jié)果采用Picard1.115軟件去除PCR重復(fù)序列，然后進行下游的數(shù)據(jù)分析。采用 Genome Analysis Toolkit(GATKv3.2)軟件進行單堿基變異(SNVs)和插入缺失(InDels)變異分析。采用Ensembl Variant Effect Predictor軟件(VEP73)進行變異注釋。參考我們前期研究中的生物信息學(xué)分析流程進行變異篩選[7]，重點關(guān)注與FRHM相關(guān)的致病基因：NLRP7、KHDC3L、MEI1和C11ORF80。采用ClinVar、OMIM 和HGMD數(shù)據(jù)庫，用于篩選已知的致病變異，同時采用多種工具預(yù)測錯義變異的功能以及非編碼調(diào)控序列的注釋，正常人群中的變異頻率參考GnomAD數(shù)據(jù)庫[8]。依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準和指南》[9-10]將變異分為5類：致病性、可能致病性、意義不明確、可能良性和良性。序列變異使用人類基因變異國際命名系統(tǒng)(HGVS)進行變異命名和注釋[11]。

五、Sanger測序驗證

生物信息學(xué)分析獲得的候選致病基因NLRP7變異位點c.1374_1375del，在其上下游1kb范圍內(nèi)設(shè)計擴增引物，以先證者及其父母的基因組DNA為模板進行聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，獲得PCR產(chǎn)物采用BigDye3.1測序試劑盒(ABI，美國)進行測序反應(yīng)，分別使用上游引物：5′-GTGGGCGCAGATGTCCGTGTTC-3′；下游引物：5′-CCTAATTGCCAAGTCGTGTCTCC-3′進行雙向測序，產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀法純化后在ABI 3500DX測序儀(ABI，美國)上進行序列分析。用Chromas2.0和SeqMan7.1軟件查看和對比測序結(jié)果。

結(jié) 果

一、全外顯子組測序結(jié)果

全外顯子組測序產(chǎn)出原始數(shù)據(jù)為10.9 G，目標(biāo)捕獲區(qū)平均測序深度為98×，其中≥1×測序深度下的覆蓋度為96.8%，≥4×測序深度下的覆蓋度為95.47%，≥10×測序深度下的覆蓋度為92.99%，≥20×測序深度下的覆蓋度為87.46%，數(shù)據(jù)量符合實驗設(shè)計要求。

測序數(shù)據(jù)經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，先證者NLRP7基因(NM_001127255.1)在19號染色體發(fā)現(xiàn)了純合的缺失變異，c.1374_1375delAG，p.Arg458SerfsTer69。在cDNA序列1 374和1 375處連續(xù)缺失了2個核苷酸(AG)，導(dǎo)致密碼子發(fā)生框移，產(chǎn)生了截短無功能的蛋白。變異位點c.1374_1375del位于NLRP7突變熱點區(qū)域，處于NRPL7蛋白的關(guān)鍵功能域-熱蛋白結(jié)構(gòu)域和中央核苷酸結(jié)合和寡聚化結(jié)構(gòu)域(NACHT)。該變異在Clinvar和OMIM數(shù)據(jù)庫中未見記錄，在HGMD數(shù)據(jù)庫擴展版中檢索到該變異致病記錄的編號為CD1611720，GnomAD數(shù)據(jù)庫中頻率極低為1/6 132。依據(jù)ACMG《序列變異解讀標(biāo)準和指南》[9-10]分析發(fā)現(xiàn)，該位點的致病性分類為致病性。

二、家系成員突變Sanger測序驗證

Sanger測序結(jié)果表明，先證者NLRP7基因的變異位點c.1374_1375del為純合變異，與全外顯子組測序分析結(jié)果一致。家系成員Sanger測序驗證結(jié)果表明，先證者妹妹(IV7)和哥哥(IV1)為純合變異，姐姐(IV2)為野生型，2個哥哥(IV3)和弟弟(IV6)為雜合變異，父母均為雜合變異攜帶者，符合近親結(jié)婚所致常染色體隱性遺傳病的遺傳方式(圖1、圖2)。

Ⅲ1：先證者父親；Ⅲ2：先證者母親；Ⅳ5：先證者；Ⅳ1、Ⅳ3和Ⅳ4：先證者哥哥；Ⅳ2：先證者姐姐；Ⅳ6：先證者弟弟；Ⅳ7：先證者妹妹；紅色箭頭示變異位點所在的堿基

討 論

FRHM是一種特殊類型的HM，往往呈現(xiàn)為家族性發(fā)病、反復(fù)流產(chǎn)、死胎或HM，患者一生中幾乎無正常妊娠[12]。FRHM屬于孟德爾常染色體隱性遺傳，即患者父母是正常表型，女性同胞中可以出現(xiàn)相同的患者，但是該病并不累及患者兄弟的配偶，且FRHM家族中男性均可以正常生育。研究顯示，F(xiàn)RHM患者的流產(chǎn)組織染色體是雙親來源的，而且同一患者與不同男性結(jié)婚后仍然會再發(fā)HM，提示FRHM發(fā)病原因并非HM本身的染色體異?；蛘呋蛲蛔儗?dǎo)致，而可能是由于患者的某些基因缺陷累及受精卵及胚胎[13]。因此在臨床上對于RHMs的患者應(yīng)考慮進行孕婦致病基因的篩查。

本研究中募集了1個近親結(jié)婚的FRHM家系，遺傳方式符合常染色體隱性遺傳方式。先證者發(fā)生10次流產(chǎn)和胚胎停育，其中3次經(jīng)病理證實的流產(chǎn)均為CHM。先證者父母為姑表親結(jié)婚，生育4男3女，其中先證者和其妹妹均表現(xiàn)為RHMs，該家系符合典型的FRHM。

Murdoch等[14]研究了2個FRHM家系，將致病基因定位在19q13.3～13.4范圍的0.65 MB區(qū)域內(nèi)，并在該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了NLRP7基因突變，并證實家系中存在NLRP7基因突變的女性均為HM患者。有研究進一步證實，NLRP7基因突變是導(dǎo)致FRHM的重要遺傳因素[6]。NLRP7屬于核苷酸結(jié)合域-富含亮氨酸重復(fù)序列(NLRP)蛋白家族，包括有3個保守的功能結(jié)構(gòu)域，分別是N端的嘧啶結(jié)構(gòu)域、C端配體結(jié)合富含亮氨酸的重復(fù)結(jié)構(gòu)域(LRR)和NACHT[15]。已經(jīng)報道的NLRP7基因致病性變異約有40余種，其中65%致病性變異是蛋白截短突變，其余35%致病性變異是錯義突變[16]。在FRHM病例中主要以純合突變和復(fù)合雜合突變?yōu)橹?，在部分散發(fā)的RHM病例中也發(fā)現(xiàn)了NPRP7基因的單等位基因的雜合突變[17]。

本研究中采用全外顯子組測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，先證者存在NLRP7基因純合變異c.1374_1375del，p.Arg458SerfsTer69，并通過Sanger測序進行驗證了先證者和其同患RHM的妹妹為純合突變，其父母為相同位點雜合突變攜帶者，進一步明確其父母近親婚配造成了NLRP7基因(c.1374_1375del)純合致病變異是導(dǎo)致該家系發(fā)生FRHM的病因。Reddy等[18]在1例RHM患者中檢測到NLRP7基因c.1374_1375del純合變異，該患者發(fā)生了3次HM，并且多次輔助生殖技術(shù)助孕均失敗。

有研究顯示，NLRP7基因突變導(dǎo)致受精卵有絲分裂抑制因子(p57)的異常表達，表現(xiàn)出類似于三倍染色體所致的部分性HM特征[19]。表觀遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，卵母細胞NLRP7基因突變與受精卵早期DNA甲基化和印記基因表達存在密切而復(fù)雜的關(guān)系，卵母細胞中p57可能驅(qū)動了絨毛細胞向HM的轉(zhuǎn)化[20-21]。NLRP7基因純合突變的女性，通過IVF-ET、卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(PGD)等輔助生殖技術(shù)均無法成功受孕，卵母細胞捐獻是目前可獲得正常妊娠的重要途徑。隨著基因治療技術(shù)的發(fā)展，未來患者有可能通過基因編輯技術(shù)而獲得有血緣關(guān)系的后代[5]。本研究的FRHM家系中，先證者與其妹妹均為NLRP7基因純合突變，自然受孕再發(fā)HM風(fēng)險高，建議可通過捐卵獲得后代。

NLRP7基因在卵母細胞中高表達，在早期人類胚胎發(fā)育過程中可以通過調(diào)控p57的表達來調(diào)節(jié)組織分化和增殖之間的平衡，且不影響精子的發(fā)生過程，因此，NLRP7基因純合變異男性具有正常的生育功能[22]。本研究中的先證者哥哥Ⅳ1經(jīng)Sanger測序驗證為NLRP7基因純合突變，但其可以正常生育后代，進一步證明NLRP7只會導(dǎo)致女性RHM，對于男性沒有影響。

本研究通過對1個罕見的近親結(jié)婚FRHM家系進行遺傳學(xué)分析，進一步證實NLRP7基因突變是導(dǎo)致FRHM的遺傳學(xué)因素，并為患者家庭的生育提供指導(dǎo)。