呂國慶，魏秀麗，吳隼

(1.a.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 血液科；b.生命科學中心，河南 新鄉(xiāng) 453100；2.新鄉(xiāng)市白血病分子診療重點實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453100；3.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第五附屬醫(yī)院/新鄉(xiāng)市第一人民醫(yī)院 血液科，河南 新鄉(xiāng) 453000)

急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)是造血系統(tǒng)的一種常見惡性腫瘤，其特征是未成熟的異常原始細胞不受控制地惡性增殖和正常血細胞的生長抑制。目前造血干細胞移植和化療是AML的常規(guī)治療方法，雖然造血干細胞移植是根治AML的方法，但是由于平均年齡(多數(shù)患者年齡在60歲以上)、移植配型、經(jīng)濟狀況和個人意愿等原因，多數(shù)患者失去造血干細胞移植機會，因此AML患者整體預后仍較差[1-3]。目前AML的分子機制仍不清楚，所以研究AML的分子機制，開發(fā)新型、高效、低毒的靶向治療藥物對提高AML的治療效果具有重要的臨床意義。Rho GTP酶激活蛋白9(Rho GTPase activating protein 9，ARHGAP9)是Rho GTP酶激活蛋白(Rho GTPase activating protein，Rho GAP)家族的成員，Rho GAP促進與GTP結合的Rho GTPases的水解，從而使Rho GTPases轉化為非活性的GDP結合狀態(tài)，并抑制多種細胞過程，例如基因轉錄、細胞骨架重構、細胞增殖、遷移和侵襲[4-8]。本研究旨在探討ARHGAP9基因在AML患者中的表達及其對預后的影響，用基因集富集分析方法探討其在AML中的分子機制，探討其生物學功能和分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本選擇2016年1月至2018年12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院初診的52例AML患者作為研究對象。AML的診斷根據(jù)AML的相關指南和診療規(guī)范進行[9-12]。留取患者的骨髓液或者外周血樣本。選擇48例健康者骨髓液或者外周血樣本作為對照組。用人外周血淋巴細胞分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)分離AML患者及健康者骨髓液或外周血細胞，按照標準操作規(guī)程進行。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準通過?；颊吆炇鹬橥鈺?。

1.2 細胞系和細胞培養(yǎng)AML細胞系SKNO-1、Kassumi-1細胞培養(yǎng)方法：兩種細胞均是懸浮細胞，使用內含青鏈霉素混合液、10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、濕度飽和、含5%(體積分數(shù))CO2的恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代。

1.3 癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)分析對癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫中的AML和其他腫瘤的基因表達數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)進行分析，對ARHGAP9基因的表達進行分析, 同時下載臨床資料數(shù)據(jù), 進行臨床參數(shù)及預后分析。

1.4 RNA提取和轉錄逆轉錄、定量反轉錄聚合酶鏈式反應(quantitative reverse transcriptase-mediated polymerase chain reaction，qRT-PCR)試劑盒、qPCR試劑盒購自Promega公司。使用Trizol(Invitrogen公司)提取總RNA。加入TRIzo、氯仿，4 ℃下，11 000×g離心15 min。把水相轉移到新管中，加入異丙醇，沉淀水相中的總RNA，4 ℃下，11 000×g離心10 min，棄上清。用體積分數(shù)為75%的乙醇溶液洗滌RNA沉淀。加入25 μL無RNase水，充分溶解RNA沉淀。用RT-PCR試劑盒合成cDNA。用實時定量PCR試劑盒、ABI 7300系統(tǒng)(ABI公司)對ARHGAP9基因進行PCR定量檢測。qPCR引物：上游引物為5’-TGAGAATTCTGGCTACATGCAGCCG-3’；下游引物為5’-CCACTCGAGATGACCGGAAATATGTTTCTC-3’；看家基因GAPDH上游引物為5’-CTCCCATCTGGCAGGTAAC-3’；下游引物5’-CCACCTGTTGCTGTAG-3’。PCR 反應條件如下。第一步，預變性：95 ℃，15 min。第二步，PCR反應：95 ℃，10 s；60 ℃，30 s，40個循環(huán)。第三步，溶解曲線分析。ARHGAP9mRNA定量用2-ΔΔCt方法進行計算(△Ct為目的基因Ct值與看家基因Ct值之差；△△Ct值為實驗樣品△Ct與對照樣品△Ct之差)。所有數(shù)據(jù)設置5個平行重復。

1.5 小干擾RNA轉染將AML細胞系SKNO-1、Kassumi-1細胞接種到6孔板上，密度為每孔3×105個細胞。ARHGAP9小干擾RNA(siRNA)5’-GGAACAATGATGTCCTGCAACCTCA-3’或對照siRNA(NC)(上海吉瑪制藥技術有限公司)，在細胞進入對數(shù)生長期時，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)進行siRNA轉染，轉染48 h后，收集細胞，為后續(xù)實驗收集和處理。

1.6 細胞增殖實驗ARHGAP9siRNA或對照siRNA(NC)轉染AML細胞系SKNO-1、Kassumi-1細胞48 h后，按照每孔1×103個細胞接種至96孔細胞培養(yǎng)板。在第0、24、48、72 h用CCK-8細胞增殖檢測試劑盒檢測細胞增殖情況。

1.7 基因集富集分析采用基因集富集分析4.0.3軟件對TCGA中AML的RNA-seq表達數(shù)據(jù)進行基因集富集分析。參照基因集來源于分子標簽數(shù)據(jù)庫(molecular signatures database, MsigDB)[13]。

1.8 統(tǒng)計學方法采用R 3.5.0、SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0軟件處理數(shù)據(jù)。 骨髓液或外周血細胞中ARHGAP9的mRNA水平比較采用t檢驗，采用log-rank檢驗進行Kaplan-Meier生存分析。采用描述性統(tǒng)計方法對患者的臨床資料進行分析，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗、t檢驗和卡方檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1ARHGAP9基因在AML中的表達水平通過對TCGA數(shù)據(jù)庫中AML的基因表達數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)AML患者體內ARHGAP9基因的表達水平高于健康者(P<0.05)。采用人外周血淋巴細胞分離液分離AML患者和健康者的骨髓液或外周血細胞，提取總RNA，qRT-PCR檢測AML細胞中ARHGAP9基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)AML樣本中ARHGAP9基因的表達水平高于健康者(P<0.05)。見圖1。

ARHGAP9為Rho GTP酶激活蛋白9；AML為急性髓細胞白血病。

2.2ARHGAP9基因與AML患者臨床預后的關系對TCGA數(shù)據(jù)庫中AML的RNA-seq表達數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)在AML中ARHGAP9基因的高表達與患者的低生存率相關。見圖2。

2.3ARHGAP9基因表達與AML患者臨床各參數(shù)及分子特征的關系按照ARHGAP9基因表達中位數(shù)將TCGA數(shù)據(jù)庫中AML的基因表達數(shù)據(jù)分為高、低表達兩組，分析ARHGAP9基因表達高低與AML患者臨床各參數(shù)及分子特征的關系。結果發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因表達高低與年齡、性別、白細胞數(shù)量、骨髓中原始細胞比率、外周血原始細胞比率無關；ARHGAP9基因的低表達與FAB-M3、FAB-M5亞型相關(P<0.001，P=0.029)；ARHGAP9基因的高表達與FAB-M1亞型相關(P=0.047)。在細胞遺傳學方面，ARHGAP9基因的高表達與正常核型及復雜核型相關(P=0.045，P=0.038)，ARHGAP9基因的低表達與FAB-M3中常見的染色體異常t(15；17)相關(P<0.001)。ARHGAP9基因表達與其他FAB亞型無相關性，與inv(16)/CBFβ-MYH11、t(8；21)/RUNX1-RUNX1T1無相關性。此外，ARHGAP9基因的低表達與AML的良好預后相關，而ARHGAP9基因的高表達與AML的中等預后相關。在AML的突變基因中，ARHGAP9基因的表達與常見的突變類型如FLT3、NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、TP53I無相關性。見表1。

表1 ARHGAP9基因表達與AML臨床參數(shù)的關系

2.4ARHGAP9基因表達與其他腫瘤生存預后的關系對TCGA數(shù)據(jù)庫中多種腫瘤的基因表達數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)進行分析，發(fā)現(xiàn)除AML之外，在其他多種腫瘤如多形性膠質母細胞瘤、腦膠質瘤、腎嫌色細胞癌和葡萄膜黑色素瘤中ARHGAP9基因的高表達與患者的低生存率相關。見圖3。

2.5ARHGAP9基因對AML細胞增殖的影響將處于對數(shù)生長期的AML細胞系SKNO-1、Kassumi-1細胞用ARHGAP9siRNA或對照siRNA(NC)轉染48 h后，收集細胞，提取總RNA，逆轉錄，檢測ARHGAP9siRNA的干擾效果，結果發(fā)現(xiàn)在AML細胞系SKNO-1、Kassumi-1細胞中，干擾效果分別約75%和60%，可用于下一步實驗。在ARHGAP9siRNA作用0、24、48、72 h后，AMLSKNO-1、Kassumi-1細胞系細胞的增殖減弱，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明ARHGAP9siRNA處理后，AMLSKNO-1、Kassumi-1細胞系細胞的增殖受到抑制。見圖4。

2.6ARHGAP9基因在AML中的生物學功能對TCGA數(shù)據(jù)庫中AML的基因表達數(shù)據(jù)進行基因集富集分析，發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因與細胞黏附、白細胞增殖、移動、分化等生物學功能呈正相關。見表2和圖5。

ARHGAP9為RhoGTP酶激活蛋白9；AML為急性髓細胞白血病。

A為多形性膠質母細胞瘤；B為腦膠質瘤；C為腎嫌色細胞癌；D為葡萄膜黑色素瘤；ARHGAP9為Rho GTP酶活性蛋白9。

A為ARHGAP9 siRNA在Kassumi-1細胞中的敲降效果；B為ARHGAP9 siRNA對Kassumi-1細胞增殖的影響；C為ARHGAP9 siRNA在SKNO-1細胞中的敲降效果；D為ARHGAP9 siRNA對SKNO-1細胞增殖的影響。

表2 ARHGAP9基因與AML的生物學功能

2.7ARHGAP9基因與AML相關信號通路的關系用基因集富集分析對TCGA中的AML數(shù)據(jù)進行分析，研究ARHGAP9相關的KEGG信號通路，發(fā)現(xiàn)ARHGAP9與MAPK、VEGF、NOTCH、JAK-STAT信號通路呈正相關。見表3和圖6。

表3 ARHGAP9基因與AML相關信號通路的關系

A中ES=0.45，NES=2.46，P<0.001；B中ES=0.47，NES=2.39，P<0.001；C中ES=0.47，NES=2.28，P<0.001；D中ES=0.38，NES=2.14，P<0.001；ES為富集分數(shù)；NES為歸一化富集分數(shù)；ARHGAP9為Rho GTP酶激活蛋白9；AML為急性髓細胞白血病。

2.8ARHGAP9基因的相互作用蛋白用蛋白質相互作用在線分析軟件STRING(https://string-db.org/)對ARHGAP9基因進行相互作用蛋白分析，發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因與眾多Rho GTPase酶家族成員可發(fā)生相互作用，如：RAC1、RAC2、RAC3、CDC42、RHOA、RHOB、RHOC、RHOG、RHOH、RHOU等。提示ARHGAP9基因可以作用于眾多小G蛋白，從而發(fā)揮廣泛的生物學作用。見圖7。

A中ES=0.32，NES=1.72，P<0.001；B中ES=0.39，NES=1.68，P=0.003；C中ES=0.42，NES=1.68，P<0.001；D中ES=0.33，NES=1.65，P<0.001；ES為富集分數(shù)；NES為歸一化富集分數(shù)；ARHGAP9為Rho GTP酶激活蛋白9；AML急性髓細胞白血病。

RAC2為RAC家族小G蛋白酶2；RAC1為RAC家族小G蛋白酶1；RHOA為Ras同源基因家族成員A；CDC42為細胞分裂控制蛋白42；RAC3為RAC家族小G蛋白酶3；RHOB為Rho相關GTP結合蛋白RHOB；RHOC為Rho相關GTP結合蛋白RHOC；RHOU為Rho相關GTP結合蛋白RHOU；RHOG為Rho相關GTP結合蛋白RHOG；RHOH為Rho相關GTP結合蛋白RHOH；ARHGAP9為Rho GTP酶激活蛋白9。

3 討論

AML是血液系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，異質性強，總體預后不良，其分子機制不完全清楚，篩查與AML發(fā)生和發(fā)展有關的相關基因和標志物具有重要價值。本研究發(fā)現(xiàn)AML患者ARHGAP9基因表達水平較健康者升高，而且其高表達與不良預后相關。在其他多種腫瘤如多形性膠質母細胞瘤、腦膠質瘤、腎嫌色細胞癌和葡萄膜黑色素瘤中ARHGAP9基因的高表達與患者的低生存率相關。在新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院AML臨床樣本中也發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因表達水平高于健康者。有研究表明在乳腺癌、胃癌患者中ARHGAP9基因表達水平升高，而且與不良預后相關[6-7]。這些研究結果提示，ARHGAP9基因是癌癥的不良預后基因，與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關。

體外實驗將ARHGAP9siRNA轉染AML細胞系SKNO-1、Kassumi-1細胞后，細胞中ARHGAP9基因表達水平下降，細胞增殖受抑制。有研究發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因 mRNA在乳腺癌中高表達，而且ARHGAP9基因 mRNA的高表達與患者低存活率、臨床分期、腫瘤大小和腫瘤分化有關。敲低人乳腺癌細胞中的ARHGAP9基因可抑制MCF-7和MDA-MB-231細胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進細胞周期阻滯和細胞凋亡[6]。敲降胃癌細胞系SGC7901中的ARHGAP9可抑制胃癌細胞增殖、行動、侵襲能力和上皮間質轉化，ARHGAP9敲降可通過Akt、p38信號通路抑制基質金屬蛋白酶2和基質金屬蛋白酶9發(fā)揮作用[7]。ARHGAP9基因表達與年齡、性別、白細胞數(shù)量、骨髓中原始細胞比率、外周血原始細胞比率無關，但是外周血細胞數(shù)量與AML生存的關系呈現(xiàn)雙相性，低白細胞及高白細胞時預后均不良，中等數(shù)量白細胞時患者預后較好，ARHGAP9基因表達與不同數(shù)量白細胞分層的研究正在進行中，研究有待發(fā)表。ARHGAP9基因的低表達與FAB-M3、FAB-M5相關；FAB-M3是AML中預后最好的類型，長期生存可達正常健康人的水平，在該類型中，ARHGAP9基因均低表達，可能與該類型的發(fā)病機制相關；ARHGAP9基因的高表達與FAB-M1相關。在細胞遺傳學方面，ARHGAP9的高表達與正常核型及復雜核型相關。預后分層研究發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因的低表達與AML良好預后相關，而ARHGAP9基因的高表達與AML中等預后相關。預后分層的結果與FAB-M1亞型及復雜核型患者的不良預后結果一致。在AML的突變基因中，ARHGAP9的表達與常見的突變類型如FLT3、NPM1、DNMT3A、IDH1、IDH2、TP53I不相關。但是因為基因突變的數(shù)據(jù)較少，可能對結果產(chǎn)生影響，需要更多的數(shù)據(jù)進行驗證。

本課題通過基因集富集分析發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因與AML患者的細胞與細胞黏附、白細胞增殖、移動、分化等生物學功能呈正相關，與MAPK、VEGF、NOTCH、JAK-STAT信號通路呈正相關。有研究表明ARHGAP9對Cdc42和Rac1具有GAP活性，而對RHOA無此作用，蛋白質相互作用分析表明ARHGAP9與Cdc42、Rac1及RHOA有相互作用，說明ARHGAP9可以通過RHOA發(fā)揮作用。除了充當RhoGAP發(fā)揮小G蛋白活化酶的作用外，ARHGAP9還可以通過WW域與絲裂原激活的蛋白激酶相互作用[5]。這與本研究結果一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)ARHGAP9基因在AML患者體內表達水平較高，而且其高表達可導致不良預后。所以推測ARHGAP9基因可通過MAPK、VEGF、NOTCH、JAK-STAT等信號通路發(fā)揮促進細胞黏附和白細胞增殖、移動、分化等生物學功能，最終導致AML不良預后。提示ARHGAP9基因可能是AML的診斷和預后標志物，可以作為AML靶向治療的潛在靶點。