章武，楊錦玉，盧翔，林金梅，牛學(xué)禮

（嶺南師范學(xué)院，廣東 湛江524048）

最近幾十年，植物病原菌多樣性和致病性均呈現(xiàn)不斷增加的趨勢(shì)，其原因不僅與氣候變化引起的極端天氣有關(guān)［1－2］，還與大量除草劑、殺菌劑等農(nóng)藥的長(zhǎng)期廣泛使用有關(guān)，嚴(yán)重地影響著植物的生長(zhǎng)、產(chǎn)量以及環(huán)境和生態(tài)安全。因此，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外利用拮抗微生物防治植物病害的發(fā)生和危害已成為目前研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一［3－4］。

木霉菌（Trichodermaspp.）是真菌界，半知菌類(lèi)，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，木霉屬真菌［5］。它是自然界中普遍存在，且資源豐富的拮抗微生物［6－7］，通過(guò)產(chǎn)生抗生素、細(xì)胞壁分解酵素等生物活性物質(zhì)［8－9］或通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、寄生［10］以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性［11－14］等途徑對(duì)植物病原真菌和細(xì)菌產(chǎn)生拮抗作用，從而達(dá)到預(yù)防和治理植物病害的效果。自Weindling［14］于20世紀(jì)30年代首次發(fā)現(xiàn)木霉菌對(duì)植物病原菌具有拮抗作用以來(lái)，木霉菌作為生防因子逐漸被越來(lái)越廣泛應(yīng)用于植物病原菌的生物防治，如利用哈茨木霉（Trichoderma harzianum）防治大豆核盤(pán)菌（Sclerotinia sclerotiorum）［15］，深綠木霉（Trichoderma atroviride）防治番茄根腐病菌（Phytophthora cinnamomi）［16］等。現(xiàn)已有多種木霉菌生防產(chǎn)品登記注冊(cè)，在國(guó)際上，如美國(guó)的T22（哈茨木霉）［17］和以色列的T39（哈茨木霉）［18］等，中國(guó)也已研制出T4（哈茨木霉）［19］和T6（長(zhǎng)枝木霉）水分散粒劑［20］，L24（綠色木霉）分生孢子［21］和特力克木霉可濕性粉劑［22］等，這些制劑在植物病害防治中均取得較好防效。因此，木霉菌在植物病害的生物防治和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域展現(xiàn)了巨大的應(yīng)用前景。

目前以化學(xué)防治方法為主的草坪病害管理和防治措施是限制其健康發(fā)展的主要因素之一［26］。草坪草病害的生物防治是當(dāng)今草坪管理技術(shù)的研究熱點(diǎn)，以菌治病其優(yōu)越性在于資源豐富、選擇性強(qiáng)、無(wú)殘留、無(wú)污染、成本低、兼防兼治、對(duì)保持生態(tài)平衡起到長(zhǎng)效的作用，但國(guó)內(nèi)外研究木霉菌在草坪草病害防治方面的研究相對(duì)較少［27－31］，因此，繼續(xù)挖掘與探索木霉菌資源對(duì)草坪草病害病原菌生防效果及其機(jī)理仍是該領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。

本研究從海南省高爾夫球場(chǎng)土壤中篩選獲得的多株木霉菌菌株中選取生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)孢量較大的4株菌株，研究其對(duì)草坪草病原菌抑制作用及其作用機(jī)理，以期為新型、高效的微生物殺菌劑的研制、開(kāi)發(fā)和合理應(yīng)用提供理論依據(jù)和科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試4株木霉菌株編號(hào)為：SQ-1Q-18（海南，三亞，神泉國(guó)際高爾夫球場(chǎng)）、SQ-1Q-15（海南，三亞，神泉國(guó)際高爾夫球場(chǎng)）、BD-1F-1（海南，萬(wàn)寧，神州半島高爾夫球場(chǎng)）、BD-2Q-12（海南，萬(wàn)寧，神州半島高爾夫球場(chǎng)）。供試的14種草坪草病原菌是筆者收集的常見(jiàn)草坪草病原菌（表1），均為實(shí)驗(yàn)室保存菌種。

表1 供試草坪草病原菌信息Table 1 Information of turfgrass pathogens tested in current study

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 2018年4月，將4℃低溫保存于斜面的4株木霉菌和14株草坪草病原菌分別接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基進(jìn)行活化，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后備用。

1.2.2 對(duì)峙培養(yǎng)法測(cè)定抑菌活性 用記號(hào)筆在PDA培養(yǎng)基平板背面分別標(biāo)記對(duì)峙培養(yǎng)木霉菌和病原菌所處具體位置（木霉菌和病原菌以培養(yǎng)皿中線(xiàn)相對(duì)稱(chēng)，間隔3 cm），在無(wú)菌條件下，用滅菌打孔器（d=5 mm）對(duì)生長(zhǎng)良好的4株木霉菌和14種病原菌進(jìn)行打孔取樣，用接種針挑取菌餅并分別接種于已標(biāo)示好位置的PDA培養(yǎng)基表面進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，每個(gè)平板上接種一種木霉菌和一種病原菌。對(duì)照只在病原菌位置接種病原菌菌餅，每個(gè)對(duì)峙試驗(yàn)及其對(duì)照均設(shè)4個(gè)重復(fù)。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并記錄木霉菌和病原菌的對(duì)峙生長(zhǎng)情況，并于第3天開(kāi)始采用“十字交叉法”測(cè)量各處理組和對(duì)照菌落半徑并拍照，每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定4 d，根據(jù)生長(zhǎng)抑制率公式［32］計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

式中：d0為對(duì)照菌落半徑（cm），dt為處理菌落半徑（cm）。

740 Expression of microRNA-21 in serum exosomes of patients with different severities of asthma and its diagnostic value

1.2.3 拮抗等級(jí)測(cè)定 根據(jù)張瑾等［33］的方法進(jìn)行拮抗等級(jí)測(cè)定。木霉菌菌落完全占據(jù)整個(gè)培養(yǎng)皿，即占據(jù)面積為100%，等級(jí)為Ⅰ；3/4＜木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積＜1，等級(jí)為Ⅱ；2/3＜木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積＜3/4，等級(jí)為Ⅲ；1/3＜木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積＜2/3，等級(jí)為Ⅳ；0＜木霉菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積＜1/3，等級(jí)為Ⅴ；病原菌菌落占據(jù)培養(yǎng)皿面積為100%，等級(jí)為Ⅵ。

1.2.4 抑菌作用機(jī)理顯微觀察 在無(wú)菌條件下，用移液器吸取1 mL無(wú)菌PDA培養(yǎng)基，均勻涂抹于載玻片上，制成一層PDA培養(yǎng)基薄膜。待載玻片上的培養(yǎng)基凝固后，在載玻片兩端分別接種SQ-1Q-18木霉菌和14種草坪草病原菌，木霉與病原菌相距3 cm，再將載玻片置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，封膜后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱，每處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)3 d后，當(dāng)兩菌落相互交接時(shí)，將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察木霉菌與14種病原菌相互作用后菌落的形態(tài)特征，記錄并拍照。

1.2.5 玻璃紙法測(cè)定抑菌活性 將玻璃紙剪成直徑為9 cm的圓片，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后貼于PDA培養(yǎng)基中央（d=9 cm）。將菌株SQ-1Q-18菌餅接種于含有玻璃紙的培養(yǎng)基中央，25℃黑暗條件下培養(yǎng)。待木霉菌落接近玻璃紙邊緣時(shí)，移除玻璃紙及整個(gè)菌落，并在培養(yǎng)皿中央接種各病原菌的菌餅。將病原菌接種于未經(jīng)處理的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。每個(gè)處理及對(duì)照設(shè)置3次重復(fù)。每天觀察各病原菌的生長(zhǎng)狀況，第3天開(kāi)始測(cè)量病原菌的直徑并拍照，根據(jù)生長(zhǎng)抑制率公式計(jì)算抑菌效果。

1.2.6 木霉菌菌液粗提液測(cè)定抑菌活性 用已滅菌的打孔器（d=5 mm）在活化的PDA平板上取木霉菌餅，用接種針挑取菌餅并接種于含有150 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato glucose liquid medium，PDB）的500 mL三角瓶中，共接種10瓶，置于28℃、150 r·min－1搖床振蕩培養(yǎng)5 d后，用無(wú)菌脫脂棉濾去菌絲，再用無(wú)菌濾紙過(guò)濾。在得到的菌液中加入等體積的乙酸乙酯浸泡24 h后進(jìn)行萃取，每瓶萃取3次后合并萃取液，并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45℃進(jìn)行濃縮，獲得發(fā)酵液粗提物。用丙酮溶解粗提物，制備成溶液（10 mg·mL－1），用移液槍在含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上均勻涂布10 μL粗提取物溶液，然后在培養(yǎng)皿中心接種病原菌菌餅，用相同體積的丙酮溶液作為對(duì)照，置于恒溫培養(yǎng)箱中，25℃黑暗條件下培養(yǎng)，每個(gè)處理重復(fù)3次。每天記錄病原菌菌絲生長(zhǎng)情況，第3天開(kāi)始測(cè)量病原菌的直徑并拍照，根據(jù)生長(zhǎng)抑制率公式計(jì)算抑菌效果。

1.2.7 木霉菌株鑒定 1）形態(tài)學(xué)鑒定。菌株SQ-1Q-18活化后，在25℃條件下培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長(zhǎng)速度、菌落顏色及表面特征等，在顯微鏡下觀察菌絲、產(chǎn)孢細(xì)胞、孢子等菌株的形態(tài)特征。2）分子生物學(xué)鑒定。將菌株SQ-1Q-18活化后于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌載玻片將菌絲刮下，充分研磨，參照Van Burik等［34］的十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取病原菌基因組DNA并保存于－20℃冰箱。利用White等［35］設(shè)計(jì)rDNA－ITS區(qū)通用引物ITS-1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS-4（5′-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3′），以4株木霉菌真菌基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mixture 4 μL，20 μmol·L－1引物各1 μL，5 U·μL－1Taq酶0.25 μL，模板DNA 1 μL，加滅菌雙蒸水至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)熱4 min；94℃30 s，62℃30 s，72℃1 min，共34個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。將所有PCR產(chǎn)物分別加入1.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，于凝膠成像儀檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。將測(cè)得的ITS序列，提交至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得GenBank登錄號(hào)，同時(shí)利用GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastn軟件進(jìn)行比對(duì)和同源性分析。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，從Genbank上下載相似度較高的木霉屬真菌rDNA－ITS片段，通過(guò)https：//mafft.cbrc.jp/alignment在線(xiàn)軟件進(jìn)行序列比對(duì)。以親緣關(guān)系相近真菌Nectira berolinensis為外群，使用Mega 7.0軟件中的最大似然法（maximum likelihood method）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并將分析結(jié)果結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對(duì)木霉菌進(jìn)行鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 22.0的One-Way ANOVA方法，對(duì)平板對(duì)峙培養(yǎng)下4種木霉菌對(duì)14種供試病原真菌的生長(zhǎng)抑制率、木霉菌株SQ-1Q-18的次生代謝產(chǎn)物以及粗提取物對(duì)14種供試病原菌的抑制率進(jìn)行方差分析，LSD法比較均值，置信區(qū)間設(shè)為95%，字母法進(jìn)行顯著性標(biāo)記。用Adobe Photoshop CC 2019和Adobe Illustrator CC 2018組合照片并注解。用R語(yǔ)言（4.0.0版）pheatmap軟件包的pheatmap函數(shù)繪制熱圖，用mat參數(shù)添加標(biāo)準(zhǔn)差及顯著性字母；用ggplot 2軟件包繪制4種木霉菌對(duì)供試病原菌總體抑制率的小提琴圖和木霉菌株SQ-1Q-18的次生代謝產(chǎn)物及關(guān)于粗提取物對(duì)14種供試病原菌抑制率的柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌對(duì)病原菌的拮抗效果

對(duì)峙培養(yǎng)第2天，4株木霉菌菌絲開(kāi)始與病原菌菌絲相互接觸。第5天時(shí)與對(duì)照相比，4株木霉菌株對(duì)14種供試病原真菌均有不同程度的拮抗效果，其中木霉菌SQ-1Q-18菌株的拮抗作用最明顯。4株木霉菌對(duì)地衣?tīng)罘锞↙F）的抑制作用最強(qiáng)，均達(dá)100%；其次是對(duì)玉蜀黍絲核菌（RZ）有較強(qiáng)抑制作用，其中菌株SQ-1Q-18和BD-1F-1對(duì)RZ的抑制率均達(dá)100%（圖1）。

圖1 對(duì)峙培養(yǎng)第5天時(shí)4種木霉菌與14種草坪草病原菌平板生長(zhǎng)狀況Fig.1 The growth status of 4 Trichoderma spp.isolates and 14 turfgrasses pathogens on the 5th day of agar confrontation culture

4株木霉菌對(duì)14種供試病原菌抑制效果明顯，抑制率在40%～100%。與其他3個(gè)木霉菌株相比，菌株SQ-1Q-18對(duì)立枯絲核菌（RS）、地毯草炭疽菌（CH）、雀稗微座孢（MP）、球黑孢霉（NS）和佩立金平臍蠕孢（BP）的抑制作用較強(qiáng)，抑制率分別為95.5%、88.5%、78.0%、61.6%和59.0%；SQ-1Q-15對(duì)草坪草幣斑病病原菌（SH）的抑制作用最強(qiáng)，抑制率為79.4%；BD-1F-1對(duì)草坪草墨斑病菌（CM）、草莖點(diǎn)霉（PH）、新月彎孢霉（CL）的抑制作用較強(qiáng)，抑制率分別為70.0%，55.4%和44.0%；BD-2Q-12對(duì)灰葡萄孢菌（BC）、禾頂囊殼禾谷變種（GG）和木賊鐮刀菌（FE）的抑制作用較強(qiáng)，抑制率分別為92.2%，81.9%和69.2%（圖2）。

圖2 對(duì)峙培養(yǎng)第5天時(shí)4種木霉菌對(duì)14種草坪草病原菌的抑制率Fig.2 The inhibition rate of 4 Trichoderma spp.isolates and 14 turfgrass pathogens on the 5th day of confrontation culture

通過(guò)分析4株木霉菌對(duì)供試14種病原菌的平均抑菌率，發(fā)現(xiàn)木霉菌SQ-1Q-18的平均抑制效果較強(qiáng)，達(dá)72.8%，且均值離散度適中，分布密度相對(duì)均一（圖3），因此選擇木霉菌株SQ-1Q-18進(jìn)一步研究其生防機(jī)理。

2.2 對(duì)峙培養(yǎng)拮抗作用觀察及分析

菌株SQ-1Q-18對(duì)供試的14種草坪草病原菌生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，但SQ-1Q-18對(duì)不同的病原菌拮抗等級(jí)存在較大差異（表2）。對(duì)地衣?tīng)罘锞陀袷袷蚪z核菌的拮抗等級(jí)均為I級(jí)，即拮抗作用最強(qiáng)。對(duì)草坪草墨斑病菌、佩立金平臍蠕孢、立枯絲核菌、地毯草炭疽菌、灰葡萄孢菌、禾頂囊殼禾谷變種、雀稗微座孢的拮抗等級(jí)為Ⅱ級(jí)。對(duì)木賊鐮刀菌和草坪草幣斑病病原菌的拮抗等級(jí)為Ⅲ級(jí)。對(duì)新月彎孢霉、球黑孢霉、草莖點(diǎn)霉的拮抗等級(jí)為Ⅳ級(jí)。

表2 木霉菌SQ-1Q-18對(duì)14種病原菌生長(zhǎng)的拮抗效果及等級(jí)Table 2 Inhibition effect of Trichoderma spp.isolates SQ-1Q-18 on the growth of fourteen pathogens

2.3 抑菌作用機(jī)理的顯微觀察

將載玻片上對(duì)峙生長(zhǎng)的兩菌落交界處置于光學(xué)顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)木霉菌對(duì)14種病原菌的抑制作用方式相似。主要是在兩種真菌相互接觸后，木霉菌迅速侵入病原菌生長(zhǎng)空間，而后木霉菌菌絲通過(guò)纏繞（圖4A）在病原菌菌絲體上，與病原菌交錯(cuò)在一起，使病原菌菌絲變細(xì)、縊縮（圖4B）。嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致病原菌菌絲斷裂（圖4C）；或穿入病原菌菌絲體內(nèi)（圖4D）或寄生在病原菌菌絲表面（圖4E），使病原菌菌絲細(xì)胞原生質(zhì)濃縮，直至最后病原菌菌絲細(xì)胞降解（圖4F）等。

2.4 木霉菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的拮抗效果

將病原菌接種于SQ-1Q-18木霉菌在玻璃紙上生長(zhǎng)過(guò)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，除玉蜀黍絲核菌（RZ）和立枯絲核菌（RS）外的12個(gè)病原菌生長(zhǎng)狀況與對(duì)照相比均有拮抗效果。這表明SQ-1Q-18木霉菌生長(zhǎng)過(guò)程中透過(guò)玻璃紙產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)玉蜀黍絲核菌（RZ）和立枯絲核菌（RS）拮抗作用不明顯，對(duì)其他12種病原菌均有不同程度的抑制作用（圖5A）。

2.5 木霉菌菌液粗提取物對(duì)病原菌的拮抗效果

由乙酸乙酯萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸干得到的SQ-1Q-18木霉菌粗提取物對(duì)14種草坪草病原菌的抑制效果不明顯，抑制率均在50%以下（圖5B），對(duì)各病原菌抑制效果也存在差異，其中，對(duì)草坪草幣斑病病原菌（SH）和佩立金平臍蠕孢（BP）的抑制率相對(duì)較高，分別為43.60%和42.91%；對(duì)新月彎孢霉（CL）、草莖點(diǎn)霉（PH）和球黑孢霉（NS）的抑制率較低，均小于5%；而對(duì)立枯絲核菌（RS）和玉蜀黍絲核菌（RZ）無(wú)抑制效果。

圖5 SQ-1Q-18木霉菌對(duì)14種草坪草病原菌的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of Trichoderma isolate SQ-1Q-18 against 14 turfgrass pathogens

2.6 木霉菌形態(tài)學(xué)特征

菌株SQ-1Q-18在PDA上活化后，氣生菌絲迅速生長(zhǎng)；菌落初期呈白色、氈狀，后期孢子簇大量形成，變?yōu)闇\綠色，致密地平鋪在培養(yǎng)基平板上，背面黃綠色或金黃色；分生孢子梗排列呈典型的金字塔形結(jié)構(gòu)，初級(jí)分枝間隔分布，成對(duì)且大量再分枝；瓶梗細(xì)胞單生或2～5個(gè)輪生，燒瓶形至安瓿形，大?。?.9～）8.6～12.3（～13.6）μm×（2.2～）2.5～2.9（～3.3）μm（圖6A）；分生孢子近球形或橢球形，表面光滑，淡綠色，老熟后呈深綠色，大?。?.5～）3.0～3.3（～3.6）μm×（2.5～）2.8～3.2（～3.5）μm（圖6B），根據(jù)形態(tài)特征初步將木霉菌株SQ-1Q-18鑒定為哈茨木霉。

圖6 哈茨木霉（SQ-1Q-18）的形態(tài)學(xué)特征Fig.6 Morphological characteristics of T.harzianum（SQ-1Q-18）

續(xù)表Continued Table

2.7 木霉菌的分子鑒定

菌株SQ-1Q-18測(cè)序所得ITS片段長(zhǎng)度為595 bp，提交至GenBank獲得登錄號(hào)為MT584872。序列經(jīng)GenBank網(wǎng)站Blastn比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)與已發(fā)表的多個(gè)哈茨木霉序列（MK738145，MN658589，MN602615）相似度均為100%。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知本研究分離的木霉菌SQ-1Q-18與已知哈茨木霉菌株聚在一個(gè)分支，自展支持率為100%（圖7）。因此結(jié)合形態(tài)學(xué)特征進(jìn)一步將其鑒定為哈茨木霉。

圖7 基于木霉屬真菌ITS序列建立的最大似然法系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Phylogenetic tree of Trichoderma spp.resulting from a maximum likelihood analysis of the ITS sequence alignment

3 討論

大量研究證實(shí)木霉菌廣泛存在于多種生境中并與其他生物進(jìn)行各種各樣的相互作用，尤其對(duì)土傳病原真菌有顯著抑制作用，因而具有保護(hù)植物的能力進(jìn)而被成功地應(yīng)用于生物殺菌劑中［36－37］。但不同木霉菌株對(duì)同種病原菌的抑制機(jī)制和效果也有所不同，本試驗(yàn)用海南省高爾夫球場(chǎng)土壤中篩選獲得的4株木霉菌測(cè)定其對(duì)草坪草病原菌的抑菌作用，并對(duì)抑制效果較好的SQ-1Q-18木霉菌抑菌機(jī)理進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)供試木霉菌對(duì)14種草坪草病原菌有不同程度的抑制效果，抑制率為38.3%～100.0%，除地衣?tīng)罘锞猓?株木霉菌對(duì)同一病原菌的抑制程度存在一定的差異。本研究發(fā)現(xiàn)4株木霉菌對(duì)地衣?tīng)罘锞种坡示哌_(dá)100%，說(shuō)明木霉菌對(duì)地衣?tīng)罘锞种菩Ч麡O為顯著，本研究首次報(bào)道了木霉菌具有防治草坪草紅絲病的潛力。另外，菌株SQ-1Q-18和BD-1F-1對(duì)玉蜀黍絲核菌的抑制率也高達(dá)100%，這一結(jié)果說(shuō)明木霉菌對(duì)防治草坪草病害的應(yīng)用有巨大潛力。

已有研究表明木霉菌主要通過(guò)寄生、競(jìng)爭(zhēng)、抗生、溶菌等作用而抑制病原菌，但不同木霉菌的作用機(jī)制和抑菌效果有所不同，同時(shí)也與病原菌本身生長(zhǎng)和免疫特性有關(guān)［38－39］。本研究通過(guò)對(duì)木霉菌SQ-1Q-18菌絲顯微結(jié)構(gòu)拮抗特征觀察發(fā)現(xiàn)木霉菌通過(guò)對(duì)病原菌菌絲進(jìn)行纏繞、縊縮的方式使病原菌菌絲變細(xì)甚至斷裂，或直接穿入或吸附病原菌菌絲的方式寄生，競(jìng)爭(zhēng)病原菌生長(zhǎng)空間，甚至可導(dǎo)致病原菌菌絲細(xì)胞溶解，斷裂。

通過(guò)玻璃紙法研究木霉菌次生代謝產(chǎn)物對(duì)病原菌的抑制試驗(yàn)表明，木霉菌SQ-1Q-18在培養(yǎng)基上產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物對(duì)草坪草幣斑病病原菌、球黑孢霉和地衣?tīng)罘锞囊种坡蔬_(dá)75%以上；由乙酸乙酯萃取、濃縮所得的SQ-1Q-18木霉菌粗提取物對(duì)佩立金平臍蠕孢和草坪草幣斑病病原菌的抑制率在40%以上。這與El-Katatny等［40］的研究結(jié)果相似，其研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉的培養(yǎng)濾液可抑制番茄果腐病病原菌孢子萌發(fā)，表明木霉次生代謝產(chǎn)物或其粗提物對(duì)部分病原菌生長(zhǎng)有抑制作用。已有研究表明木霉菌在其生命過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生多種揮發(fā)性或非揮發(fā)性抗生素［41－44］，本研究中木霉菌分泌了何種抗生性代謝物對(duì)病原菌產(chǎn)生抑制作用仍需深入研究。

通過(guò)分析對(duì)峙培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)受到明顯抑制的地衣?tīng)罘锞?、玉蜀黍絲核菌和立枯絲核菌，發(fā)現(xiàn)盡管在平板對(duì)峙培養(yǎng)中木霉菌株SQ-1Q-18對(duì)三者的抑制率均為100%，但通過(guò)玻璃紙法產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物在第3天后對(duì)玉蜀黍絲核菌和立枯絲核菌無(wú)明顯抑制作用，同時(shí)通過(guò)萃取濃縮獲得的粗提取物對(duì)玉蜀黍絲核菌和立枯絲核菌亦無(wú)抑制作用。但兩種方法獲得的SQ-1Q-18化合物對(duì)地衣?tīng)罘锞囊种坡试?4種病原菌中排名靠前（分別為第3、4位）。以上結(jié)果表明木霉菌SQ-1Q-18對(duì)不同病原菌抑制效果的作用方式不同，對(duì)地衣?tīng)罘锞囊种撇粌H通過(guò)菌絲接觸對(duì)其進(jìn)行抑制，而且通過(guò)產(chǎn)生不利于地衣?tīng)罘锞L(zhǎng)的化合物抑制地衣?tīng)罘锞z的生長(zhǎng)，但對(duì)玉蜀黍絲核菌和立枯絲核菌主要通過(guò)菌絲纏繞、縊縮、入侵和侵占生長(zhǎng)空間等方式進(jìn)行抑制。這種現(xiàn)象可能與3種病原菌菌株培養(yǎng)性狀有緊密聯(lián)系。地衣?tīng)罘锞z緊貼平板表面生長(zhǎng)形成革質(zhì)菌落，病原菌生長(zhǎng)方式使菌絲充分接觸培養(yǎng)基表面化合物，因此受木霉次生代謝產(chǎn)物影響較大。而玉蜀黍絲核菌和立枯絲核菌的菌絲生長(zhǎng)迅速，菌絲疏松、未緊貼平板表面生長(zhǎng)，說(shuō)明即使菌絲與培養(yǎng)基接觸面小也能充分吸收營(yíng)養(yǎng)，因此菌株受培養(yǎng)基表面化合物影響較小。

利用有生防潛質(zhì)木霉菌防治草坪草病害已成為目前研究的新思路，如古麗君等［30］研究深綠木霉T2對(duì)瓜果腐霉的抑菌作用及機(jī)制；姬承東等［45］篩選了木霉菌防治蘑菇圈病原真菌等均取得較好的效果。哈茨木霉作為木霉屬真菌中重要生防真菌之一，已被廣泛運(yùn)用于世界各地的植物病原真菌的防治［17－18］，我國(guó)利用哈茨木霉菌防控草坪草鐮刀菌枯萎病和褐斑病已取得相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)［46－47］。本研究首次證實(shí)哈茨木霉SQ-1Q-18對(duì)地衣?tīng)罘锞陀袷袷蚪z核菌的防治效果最為理想，其次生代謝產(chǎn)物或菌液粗提液對(duì)不同病原菌抑制效果不同，此外木霉菌作為草坪草病害的生防因子的機(jī)理需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果可以為草坪草病害生物防治提供參考，并且為微生物殺菌劑的研發(fā)提供依據(jù)。

4 結(jié)論

1）采用對(duì)峙培養(yǎng)的方法觀測(cè)4株木霉菌株對(duì)14種草坪草病原菌的拮抗作用，結(jié)果表明各木霉菌對(duì)不同病原菌表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用。其中菌株SQ-1Q-18抑菌效果最佳，其對(duì)玉蜀黍絲核菌和地衣?tīng)罘锞囊种坡矢哌_(dá)100%，對(duì)灰葡萄孢菌、地毯草炭疽菌和立枯絲核菌的抑制率大于80%，且對(duì)供試病原菌的平均抑制率高達(dá)72.8%。

2）通過(guò)顯微鏡觀察得知木霉菌菌株SQ-1Q-18可通過(guò)產(chǎn)生抑菌圈侵占病原菌的生長(zhǎng)空間，覆蓋和深入病原菌內(nèi)部與其相互纏繞使得病原菌菌絲變細(xì)、縊縮甚至斷裂，或直接穿入病原菌菌絲內(nèi)部吸取營(yíng)養(yǎng)致使菌絲細(xì)胞溶解。

3）木霉菌菌株SQ-1Q-18能產(chǎn)生對(duì)草坪草病原菌有抑制活性的拮抗化合物，其中玻璃紙法產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)對(duì)草坪草幣斑病病原菌、球黑孢霉及地衣?tīng)罘锞卓棺饔幂^強(qiáng)，接種3 d后，其相對(duì)抑制率分別高達(dá)91.77%、89.80%和79.59%；木霉菌粗提取液對(duì)草坪草幣斑病病原菌和佩立金平臍蠕孢的抑制率相對(duì)較高，分別為43.60%和42.91%。

4）通過(guò)形態(tài)學(xué)特征和ITS rDNA序列將木霉菌株SQ-1Q-18鑒定為哈茨木霉。