吳世陶 劉方 石偉偉 張敏 劉恒方

糖原貯積?、蛐停℅SDⅡ），又稱Pompe病，是罕見的常染色體隱性遺傳性疾病，系GAA基因變異所致［1］。GAA基因變異使酸性α葡糖苷酶（GAA）活性下降或缺失，糖原無(wú)法分解利用而沉積于心肌、骨骼肌、平滑肌和肝臟等細(xì)胞的溶酶體內(nèi)，導(dǎo)致一系列臨床癥狀［2］。根據(jù)發(fā)病年齡和臨床表現(xiàn)分為嬰兒型（1歲以內(nèi)發(fā)病）和晚發(fā)型（1歲以后發(fā)?。?。晚發(fā)型GSDⅡ型主要表現(xiàn)為進(jìn)行性四肢無(wú)力和呼吸困難，易誤診為其他肌肉病，因此，提高早期診斷率十分重要。GSDⅡ型患者具有特征性肌肉組織病理學(xué)表現(xiàn)，明確診斷依靠基因檢測(cè)。近年來(lái)，晚發(fā)型GSDⅡ型的臨床特點(diǎn)和基因變異位點(diǎn)陸續(xù)被報(bào)道，新發(fā)GAA基因變異位點(diǎn)不斷被發(fā)現(xiàn)，但臨床對(duì)該病的認(rèn)識(shí)仍嚴(yán)重不足［3］。本研究回顧總結(jié)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院診斷與治療的5例晚發(fā)型GSDⅡ型患者的臨床、肌肉組織病理學(xué)和分子生物學(xué)特征，旨在進(jìn)一步提高認(rèn)識(shí)、減少漏診和誤診。

臨床資料

一、病例選擇

1.納入與排除標(biāo)準(zhǔn)［3］：（1）發(fā)病年齡 ≥1歲，臨床表現(xiàn)為抬頭無(wú)力、漸進(jìn)性對(duì)稱性四肢近端肌無(wú)力，多伴呼吸肌無(wú)力，肌張力降低。（2）血清GAA酶活性明顯降低。（3）肌肉組織病理學(xué)可見肌纖維顆粒-空泡樣改變，高碘酸-雪夫（PAS）染色呈陽(yáng)性。（4）GAA基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)致病性變異。（5）排除線粒體肌病、脂質(zhì)沉積性肌病和先天性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥等疾病。

2.一般資料 選擇2013年1月至2020年1月在鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的晚發(fā)型GSDⅡ型患者共5例，男性2例，女性3例；發(fā)病年齡6～20歲，平均10.82歲；確診年齡8～31歲，平均15.45歲；病程1～11年，平均4.63年；5例患者均無(wú)家族史且父母非近親婚配。

二、臨床特點(diǎn)

5例患者均存在抬頭無(wú)力、四肢近端肌無(wú)力、肌張力降低、不耐受疲勞，3例（例1、例3、例5）呼吸困難，2例（例2、例4）消瘦，2例（例2、例4）腹瀉，2例（例3、例5）脊柱側(cè)彎，1例（例4）翼狀肩胛和1例（例5）弓形足。3例患者四肢肌力為3～4級(jí)，2例（例3、例4）為4級(jí)。5例患者血清肌酸激酶（CK，正常參考值36～200 U/L）均輕度升高，為988～1872 U/L、平均1405 U/L；干血濾紙片法檢測(cè)GAA酶活性［正常參考值1.46～20.34μmol（/L·h）］均明顯降低，為0.18～0.37μmol（/L·h）、平均0.27μmol（/L·h）。心電圖、心臟和肝臟彩超未見異常；5例患者肌電圖均呈肌源性損害；3例（例1、例3、例5）肺功能檢查提示限制性通氣障礙，多導(dǎo)睡眠圖（PSG）監(jiān)測(cè)顯示夜間低氧血癥。5例晚發(fā)型GSDⅡ型患者的臨床資料參見表1。

三、肌肉組織病理學(xué)特點(diǎn)

1.檢測(cè)方法 5例患者均行左側(cè)肱二頭肌組織活檢術(shù)，切取新鮮肌肉標(biāo)本經(jīng)液氮冷卻的異戊烷迅速冷凍，制備7μm層厚組織切片，行HE染色、改良Gomori三色（MGT）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、細(xì)胞色素C氧化酶（COX）、油紅O（ORO）、PAS和ATP（p H值為4.2和10.6）染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

2.組織病理學(xué)表現(xiàn) 5例患者HE染色均顯示肌纖維大小不等，少量變性、壞死的肌纖維散在分布，多數(shù)肌纖維內(nèi)可見大小不一、數(shù)量不等、形態(tài)不規(guī)則的空泡樣改變，有4例空泡內(nèi)有嗜堿性顆粒沉積（圖1a）。5例患者M(jìn)GT染色均可見空泡內(nèi)大量藍(lán)紫色顆粒沉積（圖1b）。1例（例1）PAS染色顯示空泡內(nèi)糖原成分流失（圖1c），4例可見多數(shù)肌纖維和空泡內(nèi)糖原成分增多（圖1d）；5例患者ORO染色未見明顯脂滴增多。

圖1 晚發(fā)型GSDⅡ型患者肌肉組織病理學(xué)檢查所見 ×200 1a 多數(shù)肌纖維內(nèi)可見大小不一、數(shù)量不等、形態(tài)不規(guī)則的空泡樣改變 HE染色 1b 空泡內(nèi)有大量藍(lán)紫色顆粒沉積 MGT染色 1c 可見空泡內(nèi)糖原成分流失 PAS染色 1d 可見空泡內(nèi)糖原成分增多PAS染色Figure 1 The characteristics of muscular pathology of late-onset GSDⅡ ×200 Optical microscopy showed that vacuoles with different sizes and irregular shapes were found in most muscle fibers(Panel 1a).HE staining Optical microscopy showed that a large number of blue and purple particles were deposited in the vacuoles(Panel 1b).MGT staining Optical microscopy showed the loss of glycogen in vacuoles(Panel 1c).PAS staining Optical microscopy showed glycogen shunting in the vacuoles(Panel 1d).PASstaining

四、分子生物學(xué)特點(diǎn)

1.檢測(cè)方法 分別采集5例患者及4例患者（例1、例2、例4、例5）父母的外周靜脈血各5 ml，送檢北京金準(zhǔn)基因科技有限責(zé)任公司，提取基因組DNA，打斷DNA并制備文庫(kù)，通過(guò)芯片對(duì)GSD相關(guān)基因編碼區(qū)及鄰近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集，采用高通量測(cè)序平臺(tái)行突變位點(diǎn)檢測(cè)。測(cè)序數(shù)據(jù)剔除接頭及低質(zhì)量數(shù)據(jù)，采用GATK軟件（https：//gatk.broadinstitute.org/hc/en-us）分析，找出單核苷酸多態(tài)性（SNP）和Indel突變位點(diǎn)；同時(shí)與人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（HGMD，http：//www.hgmd.org）及千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//browser.1000genomes.org）進(jìn)行比對(duì)，采用SIFT（http：//provean.jcvi.org/index.php）、Human Splicing Finder（http：//www.umd.be/HSF3/HSF.shtml）、Mutation Taster（http：//www.mutationtaster.org/）和Polyphen2（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）等多個(gè)軟件預(yù)測(cè)變異對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響，并參照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)會(huì)（ACMG）指南進(jìn)行判斷，對(duì)可能致病的點(diǎn)突變行Sanger測(cè)序驗(yàn)證，并行家系分析。

2.基因檢測(cè)結(jié)果 Sanger測(cè)序結(jié)果顯示，例1及其父存在GAA基因外顯子8 c.1320_1322delGAT缺失突變（圖2a，2b），導(dǎo)致氨基酸改變p.Met440del（甲硫氨酸缺失），為已知變異；例1及其母存在GAA基因外顯子16 c.2331G＞C同義突變（圖2c，2d），導(dǎo)致氨基酸改變p.Thr777Thr（蘇氨酸突變?yōu)樘K氨酸），HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見收錄。例2及其父存在GAA基因外顯子16 c.2237G＞A無(wú)義突變（圖3a，3b），導(dǎo)致氨基酸改變p.Trp746*（色氨酸突變?yōu)榻K止），為已知變異；例2及其母存在GAA基因外顯子5 c.877G＞A錯(cuò)義突變（圖3c，3d），導(dǎo)致氨基酸改變p.Gly293Arg（甘氨酸突變?yōu)榫彼幔瑸橐阎儺?。?存在GAA基因外顯子16 c.2238G＞C錯(cuò)義突變（圖4a）和外顯子4 c.784G＞A錯(cuò)義突變（圖4b），分別導(dǎo)致氨基酸改變p.Trp746Cys（色氨酸突變?yōu)榘腚装彼幔┖蚿.Glu262Lys（谷氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔?，均為已知變異。?患者存在GAA基因外顯子9 c.1432G＞A純合突變（圖5a），導(dǎo)致氨基酸改變p.Gly478Arg（甘氨酸突變?yōu)榫彼幔黄淠复嬖贕AA基因外顯子9 c.1432G＞A雜合突變（圖5b），為攜帶者，HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見收錄；其父該位點(diǎn)未見變異（圖5c）。例5及其父存在GAA基因外顯子14 c.2014C＞T錯(cuò)義突變（圖6a，6b），導(dǎo)致氨基酸改變p.Arg672Trp（精氨酸突變?yōu)樯彼幔?，為已知變異；?及其母存在GAA基因內(nèi)含子16 c.2332-2A＞G剪切突變，導(dǎo)致氨基酸3’端剪切異常（圖6c，6d），HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未見收錄。

圖2 例1及其父母Sanger測(cè)序結(jié)果 2a，2b 例1及其父存在GAA基因外顯子8 c.1320_1322delGAT缺失突變（紅色圓圈所示）2c，2d 例1及其母存在GAA基因外顯子16 c.2331G＞C雜合突變（紅色圓圈所示）Figure 2 Sanger sequencing results of Case 1 and parents Case 1(Panel 2a)and father(Panel 2b)occurred c.1320_1322delGAT deletion mutation in exon 8 of GAA gene(red circles indicate).Case 1(Panel 2c)and mother(Panel 2d)occurred c.2331G＞C heterozygous mutation in exon 16 of GAA gene(red circles indicate).

圖3 例2及其父母Sanger測(cè)序結(jié)果 3a，3b 例2及其父存在GAA基因外顯子16 c.2237G＞A雜合突變（紅色圓圈所示） 3c，3d例2及其母存在GAA基因外顯子5 c.877G＞A雜合突變（紅色圓圈所示）Figure 3 Sanger sequencing results of Case 2 and parents Case 2(Panel 3a)and father(Panel 3b)occurred c.2237G＞A heterozygous mutation in exon 16 of GAA gene(red circles indicate).Case 2(Panel 3c)and mother(Panel 3d)occurred c.877G＞A heterozygous mutation in exon 5 of GAA gene(red circles indicate).

圖4 例3患兒Sanger測(cè)序結(jié)果 4a 例3存在GAA基因外顯子16 c.2238G＞C雜合突變（紅色圓圈所示） 4b 例3存在GAA基因外顯子4 c.784G＞A雜合突變（紅色圓圈所示） 圖5 例4及其父母Sanger測(cè)序結(jié)果 5a，5b 例4及其母存在GAA基因外顯子9 c.1432G＞A純合突變（紅色圓圈所示） 5c 其父未發(fā)生GAA基因變異（紅色圓圈所示）Figure 4 Sanger sequencing results of Case 3 Case 3 occurred c.2238G＞C heterozygous mutation in exon 16 of GAA gene(red circle indicates,Panel 4a).Case 3 occurred c.784G＞A heterozygous mutation in exon 4 of GAA gene(red circle indicates,Panel 4b).Figure 5 Sanger sequencing results of Case 4 and parents Case 4(Panel 5a)and mother(Panel 5b)occurred c.1432G＞A homozygous mutation in exon 9 of GAA gene(red circles indicate).Father of Case 4 had no mutation in GAA gene(red circle indicates,Panel 5c).

圖6 例5及其父母Sanger測(cè)序結(jié)果 6a，6b 例5及其父存在GAA基因外顯子14 c.2014C＞T雜合突變（紅色圓圈所示） 6c，6d例5及其母存在GAA基因內(nèi)含子16 c.2332-2A＞G剪切突變（紅色圓圈所示）Figure 6 Sanger sequencing results of Case 5 and parents Case 5(Panel 6a)and father(Panel 6b)occurred c.2014C＞T heterozygous mutation in exon 14 of GAA gene(red circles indicate).Case 5(Panel 6c)and mother(Panel 6d)occurred c.2332-2A＞G splicing mutation in intron 16 of GAA gene(red circles indicate).

討 論

GSDⅡ型的發(fā)病年齡、病情嚴(yán)重程度主要與殘留的GAA酶活性相關(guān)，嬰兒型患者GAA酶活性不足正常人的1%，晚發(fā)型患者GAA酶活性不足正常人的30%［4］。本組5例患者GAA酶活性均顯著下降，臨床主要表現(xiàn)為抬頭無(wú)力、對(duì)稱性四肢近端肌無(wú)力、肌張力降低、不耐受疲勞和呼吸困難，部分患者合并腹瀉、消瘦、肌萎縮、脊柱側(cè)彎和弓形足等，與Martínez等［5］的研究結(jié)果基本一致。GSDⅡ型患者主要表現(xiàn)為四肢近端肌無(wú)力，下肢重于上肢，表現(xiàn)為上下樓梯、跑步和蹲起費(fèi)力，腦神經(jīng)支配肌肉較少受累。本組有3例患者存在呼吸困難，肺功能提示限制性通氣障礙，多導(dǎo)睡眠圖監(jiān)測(cè)顯示夜間低氧血癥，予無(wú)創(chuàng)性呼吸機(jī)輔助通氣后靜脈血氧飽和度正常，提示呼吸肌受累。Momosaki等［6］發(fā)現(xiàn)，約50%晚發(fā)型GSDⅡ型患者存在呼吸肌和膈肌無(wú)力，用力肺活量（FVC）低于正常值的60%，肺部感染誘發(fā)呼吸衰竭是致死的主要原因。晚發(fā)型GSDⅡ型患者的呼吸肌無(wú)力可與肢體無(wú)力不平行，部分患者呼吸衰竭前僅有輕至中度肢體無(wú)力［7］。盡早檢測(cè)呼吸功能，及時(shí)予無(wú)創(chuàng)性呼吸機(jī)輔助通氣，可以改善晚發(fā)型GSDⅡ型患者預(yù)后［8］。本組有2例患者自幼腹瀉、消瘦，提示胃腸道平滑肌受累。此外，晚發(fā)型GSDⅡ型還可出現(xiàn)肌肉疼痛、肌肉痙攣、舌肌肥厚、心肌肥厚和基底動(dòng)脈瘤等表現(xiàn)［9］。該病之臨床表現(xiàn)、血清肌酸激酶水平、肌電圖改變與肌肉受累范圍及程度相關(guān)［10］。本組5例晚發(fā)型GSDⅡ型患者血清肌酸激酶水平均輕度升高，與肌纖維變性和壞死相關(guān)。GSDⅡ型肌電圖多呈肌源性損害，部分患者可出現(xiàn)肌強(qiáng)直放電和復(fù)合性重復(fù)放電［11］，本組5例患者肌電圖均呈肌源性損害，未見肌強(qiáng)直放電和復(fù)合性重復(fù)放電，可能與本組病例較少有關(guān)。

GSDⅡ型易誤診為進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、先天性肌病、脂質(zhì)沉積性肌病、線粒體肌病和多發(fā)性肌炎等，肌肉組織病理學(xué)檢測(cè)對(duì)GSDⅡ型的診斷與鑒別診斷具有重要價(jià)值。本組5例患者HE染色顯示多數(shù)肌纖維內(nèi)可見大小不一、數(shù)量不等、形態(tài)不規(guī)則的空泡樣改變，空泡內(nèi)沉積嗜堿性顆粒；MGT染色顯示空泡內(nèi)有大量藍(lán)紫色顆粒沉積；4例PAS染色顯示多數(shù)肌纖維和空泡內(nèi)糖原成分增多；上述均為GSDⅡ型典型肌肉組織病理改變。此外，1例（例1）可見肌纖維內(nèi)糖原大量流失，PAS染色呈空泡狀，這也是少數(shù)GSDⅡ型患者的肌肉組織病理改變特點(diǎn)，應(yīng)注意與脂質(zhì)沉積性肌病相鑒別。GSDⅡ型臨床表現(xiàn)的嚴(yán)重程度與肌肉組織病理空泡樣變性部位和程度相關(guān)［12］。部分患者呼吸衰竭前僅有輕度四肢肌無(wú)力，肋間肌組織病理學(xué)檢查顯示，約90%的肌纖維發(fā)生空泡樣變性，而肱二頭肌僅約5%的肌纖維發(fā)生空泡樣變性［13］。GSDⅡ型患者不同取材部位的病理改變差異較大，肌肉病理正常者亦不能排除診斷。此外，線粒體肌病、脂質(zhì)沉積性肌病和先天性肌病也可見少量糖原沉積，需結(jié)合臨床資料、多種染色方法和基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行鑒別診斷。

GSDⅡ型系GAA基因變異導(dǎo)致的一種罕見的代謝性肌病，呈常染色體隱性遺傳，理論上必須為兩條等位染色體同時(shí)發(fā)生致病性變異（復(fù)合雜合突變或純合突變）才可能致病。GAA基因定位于常染色體17q25.2～25.3，相對(duì)分子質(zhì)量為110×103，包含19個(gè)內(nèi)含子和20個(gè)外顯子，編碼952個(gè)氨基酸，目前已發(fā)現(xiàn)約400余種變異類型［14］。本組例1為c.1320_1322delGAT和c.2331G＞C復(fù)合雜合突變，其中，c.1320_1322delGAT缺失突變?yōu)橐阎儺悾?5］，而c.2331G＞C同義突變未收錄在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中，為新發(fā)變異，系國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道，該變異導(dǎo)致氨基酸改變p.Thr777Thr（蘇氨酸突變?yōu)樘K氨酸），蛋白剪切預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)可能影響蛋白剪切而致病，根據(jù)ACMG指南評(píng)定為致病性變異。本組例4為c.1432G＞A純合突變，導(dǎo)致氨基酸改變p.Gly478Arg（甘氨酸突變?yōu)榫彼幔淠敢啻嬖谠撐稽c(diǎn)的雜合突變，亦未收錄于HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中，為新發(fā)變異，系國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道，蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)為致病位點(diǎn)，根據(jù)ACMG指南評(píng)定為可能致病性變異。本研究例5為c.2014C＞T和c.2332-2A＞G復(fù)合雜合突變，其中，c.2014C＞T錯(cuò)義突變?yōu)橐阎儺悾?6］，而c.2332-2A＞G剪切突變未收錄于HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)中，該位點(diǎn)人群攜帶率極低，為新發(fā)的剪切突變，系國(guó)內(nèi)外首次報(bào)道，該突變導(dǎo)致氨基酸3’端剪切突變，對(duì)蛋白功能的影響較大，根據(jù)ACMG指南評(píng)定為致病性變異。本組5例患者共檢出9個(gè)GAA基因變異位點(diǎn)，分別位于外顯子4、5、8、9、14、16和內(nèi)含子16，其中3個(gè)變異位點(diǎn)位于外顯子16，與既往報(bào)道的GAA基因變異主要集中于外顯子2、10、11和14不同［17-18］。本研究發(fā)現(xiàn)c.2331G＞C、c.1432G＞A和c.2332-2A＞G共3個(gè)新發(fā)變異，擴(kuò)展了GAA基因變異譜。此外，文獻(xiàn)報(bào)道亞洲人群GAA基因c.1726G＞A和c.2065G＞A為假缺陷等位基因，可以降低正常人血清GAA酶活性，但并不致病，不能單獨(dú)作為診斷GSDⅡ型的依據(jù)［19］。目前，基因變異位點(diǎn)與GAA酶活性、臨床表型和肌肉組織病理學(xué)之間的關(guān)系尚不明確，尚待進(jìn)行大宗病例總結(jié)。

綜上所述，晚發(fā)型GSDⅡ型主要表現(xiàn)為四肢肌無(wú)力和呼吸困難，血清GAA酶活性明顯下降，肌肉組織病理學(xué)具有一定特征性。GAA基因變異主要為復(fù)合雜合突變，本研究發(fā)現(xiàn)c.2331G＞C、c.1432G＞A和c.2332-2A＞G共3個(gè)新發(fā)變異，擴(kuò)展了我國(guó)GAA基因變異譜。目前，國(guó)內(nèi)外研究顯示GAA酶早期替代治療可以顯著改善預(yù)后，基因治療尚在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段［20-21］。本研究有助于加深對(duì)晚發(fā)型GSDⅡ型的認(rèn)識(shí)，提高早期診治率，也為產(chǎn)前咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。

利益沖突無(wú)