陳燕惠 盧洪珠 鄭 杰 章飛霞 林曉霞

（福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院兒科，福州 350001）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)糖皮質激素（glucocorticoid，GC）改變與GC受體（glucocorticoid receptor，GR）表達異常，與行為異常如注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）、情緒改變、認知行為關系密切[1-2]。已有研究表明，GC 能夠通過多種途徑影響五羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）、多巴胺（dopamine，DA）等單胺類神經(jīng)遞質[3-4]。單胺氧化酶A（monoamine oxidase A，MAO A）是單胺類神經(jīng)遞質的關鍵降解酶之—，能夠直接調控5-HT、NE、DA 的水平[5-8]。GC-GR 復合物能夠與MAO A 啟動子中的GC 反應元件（glucocorticoid response elements，GRE）結合，促進MAO A 基因的表達。MAO A 啟動子區(qū)存在Sp 結合位點，能夠與Sp1 Krüppel 樣轉錄因子家族成員結合。GC可增加Krüppel 樣轉錄因子-11（transcription factor Krüppel-like factor 11，KLF11）的mRNA 及蛋白水平，過表達的KLF11 可增加MAO-A 的mRNA 水平及其活性[9-10]。提示GC/GR 可能通過KLF11、Sp1 與MAO A 發(fā)生交互作用。本課題擬探究GR 激動劑、抑制劑對神經(jīng)細胞KLF11、Sp1和MAO A 表達的影響，及GR 與MAO A 交互作用的可能通路，以期為揭示ADHD 的發(fā)病機制和治療新途徑提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

新生48 h 內SD 乳鼠24 只（清潔級，由福州吳氏實驗動物中心提供）。大鼠實驗前均置于潔凈環(huán)境中自由進食飼料和飲用自來水，室溫控制于23℃±2℃，濕度保持在約56%，12 h 間斷照明，24 h 定期進行紫外殺菌消毒和排風，避免強光和強聲刺激。實驗動物的使用嚴格遵循《實驗動物管理條例》相關規(guī)定。

1.2 細胞培養(yǎng)及藥物干預

SD 乳鼠75%乙醇消毒，用乙醚吸入麻醉后斷頸處死，分離出前額葉，于37℃培養(yǎng)箱中消化25 min，接種于1%多聚賴氨酸預包被的6 孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。前額葉神經(jīng)細胞培養(yǎng)48 h 后，觀察其神經(jīng)細胞形態(tài)并拍照。換液后，根據(jù)添加藥物來分組，前額葉神經(jīng)細胞隨機分為DEX 組、米非司酮（mifepristone，RU486）組、對照組3 組。DEX 組將2 μL 100×103nmol/L DEX 溶液加入含2 mL 神經(jīng)元專用培養(yǎng)基的6 孔板中，使DEX 終濃度為100 nmol/L；RU486 組則將20 μL100 μmol/L RU486 溶液加入含2 mL 神經(jīng)元專用培養(yǎng)基的6 孔板各孔中，使RU486 終濃度為1 μmol/L；對照組的各孔加入20 μL 相同溶劑干預。各組神經(jīng)細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 KLF11、Sp1 和MAO A 表達測定

KLF11（北京博奧森生物技術有限公司）單克隆抗體按照1∶500 稀釋，一抗Sp1（Cusabio 公司）和MAO A（美國 Abcam 公司）均1∶100 稀釋，依照邁新KIT 9706 超敏免疫組織化學試劑盒操作說明，孵育一抗及生物素化二抗，DAB 染色3 min，梯度乙醇脫水，中性樹膠封片，呈現(xiàn)棕黃色部分為陽性表達。

1.4 圖像分析

各個組別的玻片于普通光學顯微鏡下觀察，并拍攝結果。先在10 倍×10 倍下定位，每張玻片40倍×10 倍下隨機取5 個不重疊視野，利用 Image-Pro-Plus 6.0 圖像分析軟件分別分析GR 平均積分光密度值（mean optical density，MOD= IOD SUM/AREA SUM），前額葉神經(jīng)細胞KLF11、Sp1和MAO A 免疫細胞化學顯色的累積光密度值，結果取均值。所有組別光密度值的測量均在相同的光學環(huán)境下完成。

1.5 統(tǒng)計學處理

計量資料以±s表示。使用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析和處理，兩組均數(shù)的比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析，其中Sp1和 MAO A累積光密度值符合雙變量正態(tài)分布，相關性分析用Pearson 相關分析，以上分析檢驗水準α=0.05，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。使用軟件GraphPad Prism 6.02進行繪圖。

2 結果

2.1 前額葉神經(jīng)細胞KLF11 表達

與對照組（0.108±0.01）比較，DEX 可明顯提高KLF11 的表達（0.139±0.01）（P<0.05），RU486 對KLF11 的表達（0.124±0.00）也有促進作用（P<0.05），但較DEX 低（P<0.05）（圖1）。

圖1 各組前額葉區(qū)神經(jīng)細胞KLF11 表達結果，免疫細胞化學染色，×200。A：對照組；B：DEX 組；C：RU486 組.

2.2 前額葉神經(jīng)細胞Sp1 和MAO A 表達

結果顯示（表1），Sp1 表達水平DEX 組較對照組明顯增高（P<0.01）；RU486 組Sp1 表達水平較對照組降低（P<0.05）。MAO A 的表達水平DEX 組比對照組顯著增多（P<0.01）；RU486 組較對照組MAO A 表達水平降低（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組前額葉區(qū)神經(jīng)細胞Sp1（A1～C1）和MAO A（A2～C2）表達結果，免疫細胞化學染色，×400。A：對照組；B：DEX 組；C：RU486 組.

表1 前額葉區(qū)各組細胞Sp1 和MAO A累積光密度（IOD）值（n=8，±s）

表1 前額葉區(qū)各組細胞Sp1 和MAO A累積光密度（IOD）值（n=8，±s）

*P<0.05，**P<0.01 vs 對照組

組別Sp1MAO A對照組65 206.02±2 447.9342 667.57±2 335.32 DEX 組84 966.93±3 017.35**74 601.66±3 346.72**RU486 組56 166.81±1 625.73*36 218.07±2 912.10*

2.3 前額葉神經(jīng)細胞Sp1 和MAO A 表達相關性分析

前額葉神經(jīng)細胞Sp1 和MAO A 的累積光密度值統(tǒng)計學資料均符合雙變量正態(tài)分布，相關分析顯示r=0.965，兩者呈正相關（P<0.01）（圖3）。

圖3 前額葉神經(jīng)細胞Sp1 和MAO A 累積光密度值散點圖和相關關系

3 討論

近年研究表明，ADHD 患者存在與下丘腦-垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA 軸）密切相關的應激時GC 反應遲鈍，GC 覺醒反應低下及日間血清GC 水平低下，GC 水平/知覺壓力比率較高等特征[11-12]。單胺類神經(jīng)遞質在ADHD 發(fā)病中發(fā)揮重要作用[13]。

MAO 是單胺類神經(jīng)遞質最主要的降解酶，該基因缺陷導致的Brunner 綜合癥患者存在ADHD 樣表現(xiàn)如沖動、睡眠障礙、低智商等[14-15]。動物實驗表明長期暴露于DEX 可以表現(xiàn)出劑量依賴的前額葉區(qū)MAOA 及MAOB 的活性增加及5-HT 周轉率增加[16]。Manoli 等[17]報道在人類骨骼肌細胞中，GC 能促進MAO A 基因和蛋白的表達，并存在劑量和時間效應，而GR 抑制劑RU486 或Sp1 結合位點的阻滯劑光神霉素會影響MAO A mRNA 的表達。

MAO A 的水平在轉錄及分解代謝等環(huán)節(jié)接受多種途徑的調控。MAO A 的轉錄涉及轉錄因子SP1、KLF11，自噬相關的經(jīng)典通路SIRT1-FOXO1等[18]。其中KLF11 屬于Sp1 Krüppel 樣轉錄因子家族，是一種啟動或關閉基因組其他基因的角色“主要調節(jié)子”，在體內廣泛表達并通過在啟動子區(qū)域綁定不同的序列，觸發(fā)RNA 聚合酶Ⅱ調節(jié)轉錄起始[19]。KLF11 能結合MAO A 啟動子進而促進MAO A 表達，抑郁癥及慢性壓力能夠誘導前額葉KLF11-MAO A 通路的異常，該通路在調節(jié)神經(jīng)細胞的生長、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用[19]。

GR 功能是否受KLF11-MAO A 通路介導而影響MAO A 表達？本研究應用GR 抑制劑觀察其對前額葉原代培養(yǎng)神經(jīng)細胞KLF11 表達的影響，結果顯示RU486 也能提升KLF11 的表達，盡管RU486對KLF11 表達的促進作用較DEX 為低。提示GR抑制劑RU486 對MAOA 表達的影響可能還涉及其他調節(jié)通路。

Sp1 是Sp/KLF 家族26 個成員中的一個轉錄因子，幾乎存在于所有哺乳動物細胞中，和許多蛋白質存在交互作用，包括其他轉錄因子、轉錄起始復合體、調節(jié)因子等，能增強目的基因的調節(jié)功能[20]。Sp1 結合于細胞基因啟動子區(qū)富含GC 序列和Sp1 結合位點處。GR 通過轉錄因子Sp1 間接作用于MAO A 的Sp1 結合位點，4 個Sp1 結合位點結合到Sp1 上對MAO A 的活性和蛋白表達影響不同，第3 個Sp1 結合位點影響最大。過表達的Sp1 可增強MAO A 啟動子的活性，siRNA 介導的Sp1 水平降低抑制內源性MAO A 啟動子活性和表達水平，其機制涉及Sp1 和cAMP 信號傳導途徑，提示GC/GR 可能通過Sp1 與MAO A 有交互作用[21]。本研究結果顯示原代培養(yǎng)前額葉和海馬區(qū)的神經(jīng)細胞予以GR 激動劑DEX、GR 抑制劑RU486 干預后，不論是前額葉還是海馬區(qū)神經(jīng)細胞Sp1 的累積光密度值DEX 組比對照組顯著增多，RU486 組較對照組Sp1表達水平降低，提示GR 激動劑可以提高Sp1 的表達水平。

研究提示GR 和Sp1 對于GC 誘導的MAO A mRNA 的表達是必須的[20]。本實驗結果與該研究結果相似，前額葉神經(jīng)細胞Sp1 和MAO A 累積光密度值的相關性分析均顯示兩者存在正相關，提示GC/GR 與MAO A 之間可能通過Sp1 起交互作用。

綜上所述，GR 功能與前額葉神經(jīng)細胞MAO A 表達水平密切相關，經(jīng)GC 作用后的神經(jīng)細胞，KLF11、Sp1 和MAO A 表達水平均明顯升高，其中Sp1 和MAO A 的表達存在正相關，提示GC/GR與MAO A 之間可能通過KLF11、Sp1 起交互作用。這一機制也有助于解釋如ADHD 等行為障礙患者HPA 軸功能與MAO A 之間的交互作用及機制，為這些行為異常發(fā)生機制和防治提供了新的思路。