韓樹梅,周 亮,王普升

光暴露所產(chǎn)生的光化學(xué)性損害導(dǎo)致視網(wǎng)膜組織學(xué)改變與視網(wǎng)膜變性類疾病中的萎縮性改變相似[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物視網(wǎng)膜進(jìn)行一定程度的連續(xù)光照射能夠引起視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞損傷。視網(wǎng)膜光損傷模型是研究視網(wǎng)膜變性類疾病的良好動(dòng)物模型[2-3]。本研究通過建立大鼠光損傷動(dòng)物模型，應(yīng)用枸杞多糖在不同時(shí)間段給大鼠進(jìn)行灌胃治療，通過記錄各組大鼠閃光視網(wǎng)膜電圖(F-ERG)，取材HE染色后應(yīng)用光鏡觀察各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)的改變，測(cè)量視網(wǎng)膜外核層(ONL)厚度并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討枸杞多糖對(duì)大鼠視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)理，從而為視網(wǎng)膜變性類疾病的預(yù)防和治療提供更多依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:2020年11月-2021年4月在寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心選擇清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley 大鼠48只，7～8周齡，體重200～250 g。隨機(jī)分為 4 組:正常對(duì)照組、模型組、模型+LBP治療(MLT)組、模型+LBP保護(hù)(MLP)組，NC組、M組每組6只大鼠，MLT組、MLP組每組18只大鼠。光損傷模型造模前均行眼前節(jié)檢查,排除眼部器質(zhì)性病變。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料:采用RETIport(Roland Consult，德國(guó))視覺電生理系統(tǒng)。

1.3 模型制備:自制光損傷箱,自制6面均裝有日光燈管的長(zhǎng)、寬、高為1.5 m的光照箱，箱內(nèi)照度經(jīng)數(shù)字式光度計(jì)(上海師范大學(xué))測(cè)定為4 180勒克斯,箱內(nèi)溫度控制在22～25 ℃。所有實(shí)驗(yàn)用大鼠造模前均在循環(huán)光環(huán)境下(12 h明以及12 h暗)適應(yīng)7 d,對(duì)照組暗適應(yīng)36 h[4]。實(shí)驗(yàn)組在光照前暗適應(yīng)36 h后,3%戊巴比妥溶液腹腔麻醉,以1%阿托品眼用凝膠滴眼散瞳，縫線開瞼,3只放入一個(gè)鼠籠(置有飲水設(shè)施)，待大白鼠清醒后,將鼠籠放入光照箱內(nèi),一個(gè)光照箱內(nèi)可放入4只鼠籠，接受12 h持續(xù)光照射。光照射完畢后立即拆除眼瞼縫線后并送回暗環(huán)境下的飼養(yǎng)籠中飼養(yǎng)24 h后,重復(fù)以上模型制作過程,總計(jì)3次,光照射時(shí)間為36 h。

1.4 給藥方法

1.4.1 正常對(duì)照組：等量生理鹽水連續(xù)灌胃60 d。

1.4.2 模型組：造模成功后，等量生理鹽水連續(xù)灌胃60 d。

1.4.3 MLT組：造模成功后，立即給予不同劑量的枸杞多糖[400、600、800 mg/(kg·d )]連續(xù)灌胃60 d。

1.4.4 MLP組：在光損傷造模前，應(yīng)用不同濃度的枸杞多糖溶液[400、600、800 mg/(kg·d)]連續(xù)灌胃60 d，在光損傷造模后，立即給予不同濃度的枸杞多糖溶液[400、600、800 mg/(kg·d)]連續(xù)灌胃60 d。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 閃光視網(wǎng)膜電圖記錄：光損傷模型造模成功后不同濃度的枸杞多糖溶液連續(xù)灌胃60 d后，對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠按照常規(guī)方法記錄閃光視網(wǎng)膜電圖ERG 5項(xiàng)基本反應(yīng)。

1.5.1.1 記錄參數(shù)：暗適應(yīng)(Photopic)10.0反應(yīng)、Photopic 0.01反應(yīng)及Photopic 3.0反應(yīng)；明適應(yīng)3.0反應(yīng)及明適應(yīng)3.0 flicker 反應(yīng)；閃光刺激光強(qiáng)為-25 dB(0.009 5 cds/m2),0.476 Hz;通頻帶 +/-1mV 1～300 Hz。

1.5.1.2 記錄方法：取暗適應(yīng)12 h 的大鼠，稱重后使用3%戊巴比妥溶液予以腹腔麻醉，給予復(fù)方托吡卡胺滴眼液(美多麗)散瞳，5 min 1次，點(diǎn)3次，鹽酸奧布卡因滴眼液(丙美卡因)進(jìn)行角膜表面麻醉。記錄電極為自制的直徑為3 mm的環(huán)形銀電極，固定于左眼角膜緣，應(yīng)用1.5號(hào)針灸針制作的參考電極及接地電極，分別置于大鼠尾部皮下及被檢測(cè)眼的同側(cè)頰部。同法做右眼。進(jìn)行暗適應(yīng)ERG記錄。暗適應(yīng) ERG做完后，將實(shí)驗(yàn)大鼠明適應(yīng)10 min以后，再進(jìn)行明適應(yīng)3.0反應(yīng)及明適應(yīng)3.0 flicker 反應(yīng)ERG的記錄[5]。

1.5.2 視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)觀察：ERG記錄后即摘取各組小鼠的右眼球,NC組、M組各6只，MLP組、MLT組各18只，每眼于角膜12：00角鞏膜緣處縫線定位標(biāo)記,沿角膜緣環(huán)形切開眼球，去除玻璃體，甲醛固定帶有視網(wǎng)膜組織的這一部分眼球、逐級(jí)酒精脫水、石蠟包埋,平行于標(biāo)記處至6點(diǎn)位的平面進(jìn)行切片，固定距離視神經(jīng)200 μm截面的切片進(jìn)行 HE 染色，切片厚度約為5 μm,HE染色后應(yīng)用光鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。每個(gè)蠟塊的1個(gè)眼球從視神經(jīng)向兩側(cè)每間隔20 μm做1次切片，每個(gè)蠟塊取3張切片的測(cè)量平均值作為1個(gè)樣本。測(cè)量視網(wǎng)膜外核層(ONL)的厚度[6]。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠閃光視網(wǎng)膜電圖:造模組、MLT組、MLP組暗適應(yīng)10.0的a波、b波的幅值較正常對(duì)照組均明顯降低，b波幅值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MLT組、MLP組b波幅值與模型組相比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；暗適應(yīng)10.0 MLT組的b波幅值與MLP組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；暗適應(yīng)0.01造模組、MLT組、MLP組b波的幅值較正常對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MLT組、MLP組b波幅值與模型組相比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);暗適應(yīng)0.01 MLT組的b波幅值與MLP組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。暗適應(yīng)3.0反應(yīng)，M組、MLT組、MLP組的b波波峰延遲出現(xiàn)，b波幅值與正常對(duì)照組對(duì)比均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MLT組、MLP組b波幅值與模型組比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MLP組的b波幅值與MLT組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模組明適應(yīng)3.0反應(yīng)及3.0 flicker 反應(yīng)波形未能完全引出，MLT組、MLP組明適應(yīng)3.0反應(yīng)的a波及b波幅值降低，b波幅值較正常對(duì)照組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MLP組b波幅值與MLT組相比較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MLT組、MLP組3.0 flicker 反應(yīng)的P1波幅值較正常對(duì)照組降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MLT組3.0 flickerP1波幅值與MLP組相比較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 4組大鼠暗適應(yīng)10.0、0.01、3.0 、明適應(yīng)3.0 b波及3.0 flicker p1波幅值比較

2.2 視網(wǎng)膜組織學(xué)改變:光鏡下正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜 HE 染色后各層組織結(jié)構(gòu)清晰、完整，染色均勻，清晰可見由內(nèi)向外依次為神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)、內(nèi)叢狀層(IPL)、內(nèi)核層(INL)以及外核層(ONL)，在內(nèi)核層和外核層之間的一淡粉色著色的窄帶是外叢狀層(OPL)。神經(jīng)節(jié)細(xì)胞呈單層排列，呈圓形或橢圓形，細(xì)胞大小不一；內(nèi)核層及外核層的細(xì)胞呈多層分布，細(xì)胞核密集分布，外核層的細(xì)胞核層更多、更密集 。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，光損傷誘導(dǎo)光感受器細(xì)胞變性凋亡、視網(wǎng)膜萎縮的情況，我們成功制成大鼠光損傷視網(wǎng)膜變性模型，取材固定、包埋HE染色后，從形態(tài)學(xué)角度分析光感受器細(xì)胞(視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞)的存活情況，光鏡下觀察視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)，分析視網(wǎng)膜內(nèi)層、外層結(jié)構(gòu)層次的變化，可見造模組光感受器細(xì)胞減少，外核層變薄，且視細(xì)胞內(nèi)節(jié)(IS)和外節(jié)(OS)結(jié)構(gòu)紊亂，IS/OS層變薄。模型組GCL減少，部分細(xì)胞核結(jié)構(gòu)未見，核固縮濃染，以內(nèi)核層和外核層損傷最為明顯，內(nèi)核層和外核層明顯變薄，內(nèi)核層是由水平細(xì)胞，無長(zhǎng)突細(xì)胞，雙極細(xì)胞的細(xì)胞核構(gòu)成，MLP、MLT組ONL損傷較模型組有所好轉(zhuǎn)，見圖1(目錄后)。

2.3 各組大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度的柱形圖分析與比較:模型組、MLT組、MLP組較正常對(duì)照組的視網(wǎng)膜外核層厚度均明顯變薄，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MLT組、MLP組與模型組比較，視網(wǎng)膜外核層厚度大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);MLP組與MLT組比較，視網(wǎng)膜外核層厚度大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.56，P<0.05)，見表2。

表2 4組大鼠視網(wǎng)膜ONL厚度比較

3 討論

由光污染造成的視網(wǎng)膜光損傷也越來越普遍，如激光損傷黃斑區(qū)光感受器、電焊工人的視網(wǎng)膜受損以及長(zhǎng)時(shí)間熬夜玩手機(jī)等均可引起視力下降。光損傷會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜光感器細(xì)胞不同程度的受損，形成視網(wǎng)膜光損傷，臨床表現(xiàn)為在黃斑OCT可見中心凹處IS/OS光帶的結(jié)構(gòu)紊亂、水腫，甚至是斷裂；光感受器細(xì)胞(視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞)的內(nèi)側(cè)部分核周體形成外核層，外側(cè)部分核周體構(gòu)成視錐細(xì)胞和視桿細(xì)胞的內(nèi)節(jié)(IS)和外節(jié)(OS)[7]。2018年全國(guó)愛眼日的主題是“關(guān)注眼健康，預(yù)防光污染”，目前各類電子產(chǎn)品的大量使用，不同波長(zhǎng)的激光廣泛應(yīng)用于科學(xué)領(lǐng)域，家庭中各類裝飾燈具以及商場(chǎng)中的各式各樣的燈具都是光污染的來源，這一問題不僅是醫(yī)學(xué)界的難題，也成為嚴(yán)峻的社會(huì)問題，光污染這個(gè)話題越來越受到眼科醫(yī)生的重視。

枸杞多糖是從寧夏的特色植物枸杞中分離出的主要多糖之一。大量文獻(xiàn)報(bào)道，枸杞多糖具有抗輻射、防衰老、抗氧化等多種生物學(xué)活性，尤其是急性高眼壓對(duì)視網(wǎng)膜的損傷、糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病具有保護(hù)作用[8-9]。在《本草綱目》里枸杞有明目的記載，但其機(jī)制尚不清楚。本研究通過建立大鼠光損傷動(dòng)物模型來研究枸杞多糖對(duì)視網(wǎng)膜光損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠視網(wǎng)膜通過長(zhǎng)時(shí)間的日光燈照射后，視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞層薄變，部分神經(jīng)細(xì)胞胞漿空泡狀、液化，部分細(xì)胞核固縮、溶解，視網(wǎng)膜的內(nèi)核層變薄，外層視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)當(dāng)中的外核層及IS/OS層均有不同程度的薄變；視電生理的結(jié)果顯示，光損傷模型后，造模組暗適應(yīng)10.0、0.01、3.0反應(yīng)中的b波幅值較正常對(duì)照組均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用枸杞多糖進(jìn)行干預(yù)后MLT組及MLP組暗適應(yīng)10.0、0.01、3.0反應(yīng)中的b波幅值較正常對(duì)照組是降低的，但較造模組有好轉(zhuǎn)；明適應(yīng)3.0反應(yīng)及3.0 flicker反應(yīng)波形造模組未能完全引出，MLT組、MLP組明適應(yīng)3.0反應(yīng)的a波及b波幅值降低，波峰延遲出現(xiàn)，3.0 flicker 反應(yīng)的N1及P1波幅值降低，與正常對(duì)照組比較b波幅值高，差異具有顯著性，說明視網(wǎng)膜光損傷后應(yīng)用枸杞多糖治療有效，視網(wǎng)膜功能有不同程度的恢復(fù)。造模組、MLT組、MLP組3組視網(wǎng)膜電圖暗適應(yīng)10.0、0.01、3.0反應(yīng)中反應(yīng)波幅值均降低，波峰延遲出現(xiàn)；造模組明適應(yīng)3.0反應(yīng)及3.0 flicker 反應(yīng)波形未能完全引出，這表明了光損傷模型的成功及視網(wǎng)膜光損傷的確定性。視電生理的各項(xiàng)視網(wǎng)膜電圖作為評(píng)判視網(wǎng)膜功能的主要檢查手段[5]，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，從此項(xiàng)研究視網(wǎng)膜電圖的結(jié)果分析可發(fā)現(xiàn)在大鼠視網(wǎng)膜光損傷模型中，大鼠的視網(wǎng)膜功能嚴(yán)重受損，應(yīng)用枸杞多糖干預(yù)治療的MLT組、MLP組的各項(xiàng)閃光視網(wǎng)膜電圖結(jié)果較造模組要好，同時(shí)造模前后均使用枸杞多糖干預(yù)的MLP組在明適應(yīng)3.0及3.0 flicker反應(yīng)波形幅值的降低程度較單純?cè)炷：髴?yīng)用枸杞多糖的MLP組要低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是在暗適應(yīng)10.0、0.01、3.0中未見明顯差異，提示枸杞多糖對(duì)視桿細(xì)胞的修護(hù)作用強(qiáng)于視錐細(xì)胞，還需要進(jìn)一步研究。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，MLT組、MLP組視網(wǎng)膜外核層的厚度較正常對(duì)照組依然是下降的，但較造模組要高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)。MLP組視網(wǎng)膜外核層的厚度較MLT組明顯增高的，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，這與視電生理檢查結(jié)果相符，表明同時(shí)在光損傷前提早進(jìn)行枸杞多糖干預(yù)治療，更有利于預(yù)防、保護(hù)視網(wǎng)膜受損以及加強(qiáng)視網(wǎng)膜受損傷后的修護(hù)。

本研究結(jié)果提示，光污染會(huì)嚴(yán)重影響視網(wǎng)膜的代謝，可造成視網(wǎng)膜IS/OS帶結(jié)構(gòu)的紊亂、水腫，甚至是斷裂，嚴(yán)重影響視力。具有一定強(qiáng)度的可見光長(zhǎng)時(shí)間的照射眼睛，依然會(huì)影響到視網(wǎng)膜的代謝，視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞凋亡，視網(wǎng)膜外層甚至是全層的變??；而枸杞多糖可以保護(hù)和治療視網(wǎng)膜光損傷，減少視網(wǎng)膜光感受器的凋亡，在視網(wǎng)膜光損傷前，提早用枸杞多糖的干預(yù)比單純光損傷后的應(yīng)用效果更好，這就為視網(wǎng)膜光損傷以及視網(wǎng)膜變性類疾病的治療提供了一定依據(jù)。