黃 松 夏大平， 閆夏彤 劉春蘭 孫長(zhǎng)彥 郭紅玉，3

(1.河南理工大學(xué)能源科學(xué)與工程學(xué)院，454000 河南焦作；2.河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，454000河南焦作；3.中原經(jīng)濟(jì)區(qū)煤層(頁(yè)巖)氣河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，454000 河南焦作)

0 引 言

煤炭開采勢(shì)必會(huì)對(duì)水資源、大氣及土壤等環(huán)境造成不利影響，如何清潔高效地利用煤炭資源，減輕環(huán)境負(fù)擔(dān)已成為當(dāng)今煤炭轉(zhuǎn)型考慮的重中之重。煤制生物氣技術(shù)是在微生物的作用下，將煤定向轉(zhuǎn)化為氫氣、甲烷等有利物質(zhì)的一種新技術(shù)，具有反應(yīng)條件溫和、耗能少等優(yōu)點(diǎn)，必將成為未來煤炭資源清潔高效開采的有效途徑之一[1-2]，而這種技術(shù)的首要環(huán)節(jié)便是高效菌源的獲取。目前，眾多學(xué)者已經(jīng)在菌源選擇上做了許多先導(dǎo)性的工作。在不同地區(qū)、不同煤階的新鮮煤樣中均檢測(cè)有產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷菌群[3-4]，另外，對(duì)煤層水的群落結(jié)構(gòu)研究中也發(fā)現(xiàn)存在互營(yíng)揮發(fā)性脂肪酸代謝產(chǎn)甲烷菌系[5]。對(duì)比不同煤階煤分別在本源菌和外源(如沼液、活性污泥和底泥等)菌作用下產(chǎn)氣效率的差異，發(fā)現(xiàn)外源菌的整體產(chǎn)氣效果要優(yōu)于本源菌的整體產(chǎn)氣效果，而馴化是獲取高效菌更為關(guān)鍵的因素，微生物經(jīng)過逐步馴化可縮減對(duì)煤的適應(yīng)過程，使不同菌源菌群的產(chǎn)氣效率均得到提高[6-8]，這為后續(xù)增產(chǎn)研究提供了思路。通過將馴化后的外源菌群注入到煤層氣產(chǎn)量低、本源微生物活性弱的淺埋煤層，外源菌協(xié)同煤層本源菌共同促進(jìn)煤層生物氣的產(chǎn)出。

氫化酶是一類存在于微生物體內(nèi)的重要的生物酶，它能夠催化伴有氫分子吸收與釋放的氧化還原反應(yīng)[9-11]，并且通過調(diào)控微生物體內(nèi)氫氣的代謝來調(diào)節(jié)其他生理代謝活動(dòng)[12]。氫化酶直接參與了產(chǎn)氫菌及產(chǎn)甲烷菌的物質(zhì)代謝和能量代謝，在煤制生物氣過程中擔(dān)當(dāng)著重要的角色[13-14]。通過測(cè)定H2產(chǎn)率，氫化酶活性可用于評(píng)價(jià)不同厭氧接種物的H2生成潛力[15]。有學(xué)者[14]在煤制生物氣過程中添加鐵鎳離子來探討氫化酶活性的變化，發(fā)現(xiàn)氫化酶活性隨離子濃度的增加呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢(shì)，在產(chǎn)氣達(dá)到穩(wěn)定時(shí)氫化酶活性也出現(xiàn)峰值，但由于菌群并未馴化，即便是添加最佳離子組合的鐵鎳離子，其活性峰值也僅為0.6 mL/(mg·min)[14]。氫化酶活性較低嚴(yán)重制約了菌群的表達(dá)活性，進(jìn)而不利于生物氣的產(chǎn)出，因此，提高菌的氫化酶活性對(duì)于增產(chǎn)生物氣具有極大的現(xiàn)實(shí)意義。

隨著煤化程度的提高，煤分子中易被降解的側(cè)鏈官能團(tuán)發(fā)生脫落，使芳構(gòu)化程度不斷提高[16]，煤樣的發(fā)酵產(chǎn)氣能力與煤的降解率逐步下降[17]，所以低階煤是作為生物產(chǎn)氣底物的最佳選擇。而長(zhǎng)焰煤屬于變質(zhì)程度最低的煙煤，因其揮發(fā)分含量高且富含微生物生長(zhǎng)所必需的一些微量元素，逐漸受到研究人員的青睞。鑒于此，本研究選擇以河南義馬千秋礦長(zhǎng)焰煤為底物，分別選用礦井水、沼液和污泥作為菌源，逐代馴化培養(yǎng)產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌，并針對(duì)目前氫化酶活性的測(cè)定方法普遍存在的檢測(cè)靈敏度低、安全性差等問題[18]優(yōu)化氫化酶活性的檢測(cè)方法，區(qū)分產(chǎn)氫菌與產(chǎn)甲烷菌氫化酶活性的測(cè)試差異，以有助于后續(xù)驗(yàn)證馴化對(duì)氫化酶活性的影響；理清氫化酶活性與產(chǎn)氣量和菌濁的響應(yīng)機(jī)制，以期為進(jìn)一步進(jìn)行氫化酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)的研究提供活性酶體的參考，從而為從酶學(xué)水平上調(diào)控煤厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物氣提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

為盡量減少煤樣運(yùn)輸過程中存在的氧化、有機(jī)質(zhì)損耗等潛在問題，按照就近取樣原則對(duì)河南省義馬千秋礦長(zhǎng)焰煤進(jìn)行采樣。樣品采集后用清水洗滌，實(shí)驗(yàn)前將煤樣用粉碎機(jī)粉碎至粒徑為0.10 mm～0.15 mm，高壓滅菌后于樣品袋中密封保存?zhèn)溆?，煤樣的基本物性參?shù)見表1。實(shí)驗(yàn)所用菌源分別為煤礦礦井水、農(nóng)家沼氣池中的沼液及污水處理廠排泄池中的厭氧污泥。為盡量保證厭氧條件，采集后要迅速密封，并及時(shí)送回實(shí)驗(yàn)室置于4 ℃冰箱低溫冷藏保存，以保證菌種活性。

表1 煤樣的工業(yè)分析和元素分析Table 1 Proximate and ultimate analyses of coal sample

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 不同菌源菌群的富集培養(yǎng)

分別配制產(chǎn)氫培養(yǎng)基及產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基對(duì)采集到的不同菌源菌群進(jìn)行富集培養(yǎng)，培養(yǎng)基及微量元素液的配方如下。

1) 產(chǎn)氫培養(yǎng)基(g/L)：1 L蒸餾水中分別加1.0 g NH4Cl，0.4 g K2HPO4·3H2O，2.0 g NaCl，2.0 g NaHCO3，0.1 g MgCl2·6H2O，1.0 g胰化酪蛋白，1.0 g酵母膏，10 g葡萄糖，0.5 g L-半胱氨酸鹽酸鹽，2.0 gEDTA二鈉，10 mL微量元素液。

2) 產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基(g/L)：1 L蒸餾水中分別加1.0 g NH4Cl，0.1 g MgCl2·6H2O，0.4 g K2HPO4·3H2O，0.2 g KH2PO4，0.1 g胰化酪蛋白，0.1 g酵母膏，2.0 g乙酸鈉，2.0 g甲酸鈉，0.5 g L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.2 g Na2S·9H2O，2.0 g NaHCO3，0.001 g NaHCO3，10 mL微量元素液。

3) 微量元素液(g/L)：1 L蒸餾水中分別加1.5 g氮三乙酸，0.1 g CaCl2，3.0 g MgSO4·7H2O，0.05 g H3BO3，0.1 g FeSO4，1.0 g NaCl，0.1 g CoCl2，0.5 g MnSO4，0.1 g ZnSO4，0.05 g NaMoO4，0.01 g AlK(SO4)2，0.1 g NiCl2，0.01 g CuSO4。

1.2.2 氫化酶活性的測(cè)定

分別對(duì)三種來源的產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌的氫化酶活性進(jìn)行測(cè)定分析。用A1和B1分別代表礦井水中的產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌，A2和B2分別代表沼液中的產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌，A3和B3分別代表污泥中的產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌；用A11，A21，A31，B11，B21，B31分別代表分別添加0.1 mL溶菌酶的礦井水、沼液和污泥中的產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌；用A12，A22，A32，B12，B22，B32分別代表各添加0.1 mL蒸餾水的礦井水、沼液和污泥中的產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌。將滅完菌的25 mL厭氧管放入?yún)捬豕ぷ髡局?0 min后，分別注入1 mL待測(cè)菌液，加入0.1 mL溶菌酶溶液或蒸餾水，向厭氧管中充N210 min后蓋上橡皮塞密封。預(yù)處理后將厭氧管置于40 ℃恒溫水浴鍋中，恒溫培養(yǎng)時(shí)間均為60 min，酶促反應(yīng)10 min后添加0.2 mL 10%的三氯乙酸使反應(yīng)終止，隨后及時(shí)抽取厭氧管中的氣體進(jìn)行氣相色譜分析。

在保證菌源不變的情況下，分別選用甲基紫精和甘氨酸為氫化酶活性測(cè)定時(shí)的電子載體，考察不同電子載體對(duì)氫化酶活性測(cè)定的影響。

采用灼燒減重法對(duì)待測(cè)菌液中揮發(fā)性懸浮固體(mixed liquor volatile suspended solids，MLVSS)的質(zhì)量進(jìn)行測(cè)算，精度為0.01 mg。

氫化酶活性(HPE)的計(jì)算公式為：

(1)

式中：φ為酶促反應(yīng)產(chǎn)生的氫氣的體積分?jǐn)?shù)，%；V為厭氧管中的氣體體積，mL；mMLVSS為每1 mL待測(cè)菌液中揮發(fā)性懸浮固體的質(zhì)量，mg；t為酶促反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，min。

利用優(yōu)化后的氫化酶活性測(cè)定方法分別對(duì)不同馴化周期及不同培養(yǎng)時(shí)間下產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌的氫化酶活性進(jìn)行測(cè)試。

1.2.3 不同菌源菌群的馴化

環(huán)境溫度是影響高效菌馴化的重要因素，一般產(chǎn)氫菌的適宜溫度范圍為26 ℃～39 ℃，中溫產(chǎn)甲烷菌的適宜溫度范圍為30 ℃～45 ℃，而相關(guān)文獻(xiàn)[19-20]對(duì)于溫度條件的優(yōu)選，普遍認(rèn)為35 ℃是煤制生物氫、甲烷中菌群生長(zhǎng)的適宜溫度，因此，選擇35 ℃作為本次馴化的最佳環(huán)境溫度。

產(chǎn)氫菌的一次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無(wú)葡萄糖的產(chǎn)氫培養(yǎng)基、2 mL接種后的菌液和0.2 g煤樣，在35 ℃環(huán)境下馴化培養(yǎng)4 d。二次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無(wú)葡萄糖的產(chǎn)氫培養(yǎng)基、2 mL一次馴化后的發(fā)酵菌液和0.4 g煤樣，繼續(xù)在35 ℃環(huán)境下馴化培養(yǎng)4 d。三次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無(wú)葡萄糖的產(chǎn)氫培養(yǎng)基、2 mL二次馴化后的發(fā)酵菌液和0.6 g煤樣，繼續(xù)在35 ℃環(huán)境下馴化培養(yǎng)4 d。

產(chǎn)甲烷菌的一次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無(wú)乙酸鈉和甲酸鈉的產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基、2 mL接種后的菌液和0.2 g煤樣，在35 ℃環(huán)境下馴化培養(yǎng)4 d。二次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無(wú)乙酸鈉和甲酸鈉的產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基、2 mL一次馴化后的發(fā)酵菌液和0.4 g煤樣，繼續(xù)在35 ℃環(huán)境下馴化培養(yǎng)4 d。三次馴化：在25 mL的厭氧管中分別加入20 mL無(wú)乙酸鈉和甲酸鈉的產(chǎn)甲烷培養(yǎng)基、2 mL二次馴化后的菌液和0.6 g煤樣，在35 ℃環(huán)境下馴化培養(yǎng)4 d。

1.2.4 馴化后產(chǎn)氣量及生物活性的測(cè)定

采用GC-4000A型氣相色譜儀(北京東西分析儀器有限公司)測(cè)定氣體產(chǎn)物的組分和含量。首先使用外標(biāo)法對(duì)氣相色譜進(jìn)行標(biāo)定，測(cè)試氣樣時(shí)依據(jù)其峰面積得到樣品中被測(cè)組分的體積分?jǐn)?shù)(%)，通過總產(chǎn)氣量確定被測(cè)組分的體積(mL)，最后得出單位質(zhì)量煤的產(chǎn)氣量(mL/g)。色譜條件：色譜柱采用填充柱，檢測(cè)器為TCD熱導(dǎo)檢測(cè)器，5A柱，進(jìn)樣器溫度為50 ℃，檢測(cè)器溫度為100 ℃，熱絲溫度為120 ℃，載氣為高純氦氣，進(jìn)樣量為1 mL。采用UV-5200型紫外-可見分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)測(cè)定不同產(chǎn)氫菌及產(chǎn)甲烷菌馴化階段在600 nm處的吸光值，用來表征細(xì)菌的生物活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 氫化酶活性測(cè)定方法的優(yōu)化

2.1.1 溶菌酶對(duì)氫化酶活性測(cè)定的影響

根據(jù)酶促反應(yīng)中產(chǎn)生的氫氣量和菌液中揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)的質(zhì)量，利用式(1)并統(tǒng)一以氣體總體積(V)為22.5 mL，酶促反應(yīng)時(shí)間(t)為10 min對(duì)各來源產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌的氫化酶活性進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如圖1所示。

圖1 溶菌酶對(duì)氫化酶活性測(cè)定的影響Fig.1 Influence of lysozyme on determination of hydrogenase activity

由圖1可以看出，溶菌酶對(duì)產(chǎn)氫菌氫化酶活性的測(cè)試有效果，而對(duì)產(chǎn)甲烷菌氫化酶活性的測(cè)試不起作用。這是由于溶菌酶主要破壞產(chǎn)氫菌菌體細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，胞內(nèi)氫化酶逸出[21]。而已有的研究[22-23]表明，產(chǎn)甲烷菌是典型的革蘭氏陰性菌，而革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁所含的脂質(zhì)比肽聚糖多，肽聚糖層很薄，除少量革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、普通變形菌和副溶血性弧菌等，溶菌酶對(duì)大多數(shù)的革蘭氏陰性菌都不起作用，因而在產(chǎn)甲烷過程氫化酶活性的預(yù)處理時(shí)，溶菌酶可以用等量的蒸餾水來代替。

2.1.2 電子載體對(duì)氫化酶活性測(cè)定的影響

不同電子載體對(duì)氫化酶活性測(cè)定的影響見圖2。由圖2可知，在以甘氨酸為電子載體時(shí)檢測(cè)出的產(chǎn)氫菌氫化酶活性均明顯高于以甲基紫精為電子載體時(shí)檢測(cè)出的產(chǎn)氫菌氫化酶活性。原因可能是甘氨酸作為電子載體，在預(yù)處理及恒溫處理過程中穩(wěn)定性較甲基紫精穩(wěn)定性高，一方面反應(yīng)過程中甲基紫精易受到溫度的影響而發(fā)生部分分解；另一方面在操作過程中可能會(huì)有少量的氧氣混入?yún)捬豕?，而甲基紫精更容易被氧氣氧化，即使添加了還原劑，但在一定程度上仍會(huì)影響其發(fā)揮作用。

圖2 不同電子載體對(duì)氫化酶活性測(cè)定的影響Fig.2 Influence of different electron carriers on determination of hydrogenase activity

在以甘氨酸為電子載體時(shí)檢測(cè)出的礦井水中產(chǎn)甲烷菌氫化酶活性稍低于以甲基紫精為電子載體時(shí)檢測(cè)出的礦井水中產(chǎn)甲烷菌氫化酶活性，而對(duì)于沼液和污泥菌源產(chǎn)甲烷菌來講情況相反。原因可能是礦井水中產(chǎn)甲烷菌以鐵氧還蛋白為電子傳遞體的氫化酶催化反應(yīng)稍微活躍，而甲基紫精的添加可以大大提高氫化酶催化放氫的速率[24]，所以在檢測(cè)礦井水中產(chǎn)甲烷菌的氫化酶活性時(shí)，甲基紫精的效果要稍微優(yōu)于甘氨酸的效果。但總體而言，甘氨酸的作用效果要優(yōu)于甲基紫精的作用效果。

2.2 不同菌源馴化培養(yǎng)菌群的氫化酶活性

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，現(xiàn)用優(yōu)化后的氫化酶活性測(cè)定方法檢測(cè)馴化培養(yǎng)對(duì)不同菌源菌群的氫化酶活性的影響。

通過延長(zhǎng)馴化周期和恒溫培養(yǎng)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)二者的耦合效應(yīng)可以最大程度上優(yōu)選出氫化酶活性最佳的馴化條件，從而有利于后續(xù)產(chǎn)氫產(chǎn)甲烷的進(jìn)行。圖3所示為逐代馴化培養(yǎng)對(duì)不同菌源菌群氫化酶活性的影響。由圖3可以看出，三種菌源菌群在未馴化就直接接種培養(yǎng)時(shí)，對(duì)煤表現(xiàn)出極大的不適應(yīng)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，氫化酶活性逐漸增強(qiáng)，但始終保持在較低的水平。對(duì)菌群馴化能有效提高菌群對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，礦井水中的產(chǎn)氫菌在三次馴化并恒溫培養(yǎng)48 h后氫化酶活性最高，為0.11 mL/(mg·min)；產(chǎn)甲烷菌的氫化酶活性普遍高于產(chǎn)氫菌的氫化酶活性，其中，礦井水中的產(chǎn)甲烷菌在三次馴化并恒溫培養(yǎng)56 h后氫化酶活性達(dá)到最大值2.84 mL/(mg·min)；另外兩種菌源菌群均提前達(dá)到氫化酶活性最高值，其中沼液中產(chǎn)氫菌在二次馴化并恒溫培養(yǎng)48 h后氫化酶活性最大，為0.17 mL/(mg·min)，而沼液中產(chǎn)甲烷菌在二次馴化并恒溫培養(yǎng)64 h后氫化酶活性最大，為2.23 mL/(mg·min)；污泥中產(chǎn)氫菌在二次馴化并恒溫培養(yǎng)56 h后氫化酶活性最大，為0.14 mL/(mg·min)，而污泥中產(chǎn)甲烷菌在二次馴化并恒溫培養(yǎng)80 h后氫化酶活性最大，為2.45 mL/(mg·min)。

圖3 逐代馴化培養(yǎng)對(duì)不同菌源菌群氫化酶活性的影響Fig.3 Influence of successive generation acclimation and cultivation on hydrogenase activity of bacterium from different bacterial sourcesa—A1；b—A2；c—A3；d—B1；e—B2；f—B3

對(duì)以礦井水為菌源的產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行馴化，達(dá)到氫化酶活性峰值的延滯期都要比對(duì)其他兩種菌源產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行馴化達(dá)到氫化酶活性峰值的延滯期長(zhǎng)，分析認(rèn)為，礦井水為采自煤層的地下水，沼液是利用生物有機(jī)質(zhì)厭氧發(fā)酵的液體，而污泥是由微生物群體及吸附的污水中有機(jī)和無(wú)機(jī)物質(zhì)組成，由于其底物及水源的限制，礦井水中菌的數(shù)量和種類較少，所以總體而言，礦井水菌群的氫化酶活性要低于沼液菌群和污泥菌群的氫化酶活性[6]。在馴化時(shí)間較短時(shí)，細(xì)菌剛進(jìn)入延滯期，還未達(dá)到生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，而隨著馴化培養(yǎng)的進(jìn)行，細(xì)菌的數(shù)量逐漸增多，代謝活性也逐漸增強(qiáng)，總的氫化酶活性增大；不同菌源菌群的氫化酶活性隨恒溫培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)基本表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，培養(yǎng)初期，煤表面官能團(tuán)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，較難脫落，導(dǎo)致菌群對(duì)煤的降解不充分；隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，降解產(chǎn)生的氨氮及代謝毒素對(duì)菌群造成不利作用[25]，氫化酶活性也隨之降低。

在對(duì)菌源中的產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌進(jìn)行氫化酶活性測(cè)定時(shí)分別添加了產(chǎn)甲烷菌抑制劑2-溴乙烷磺酸鈉和產(chǎn)氫菌抑制劑盤尼西林-G，從而在對(duì)產(chǎn)氫菌氫化酶活性進(jìn)行測(cè)定時(shí)，由于產(chǎn)甲烷菌的活性受到抑制，無(wú)法利用已產(chǎn)生的氫氣，故厭氧管中的氫分壓難以降低，因此沒有更多的氫氣產(chǎn)生；而在對(duì)產(chǎn)甲烷菌氫化酶活性進(jìn)行測(cè)定時(shí)，馴化培養(yǎng)階段菌液中產(chǎn)生的乙酸、丙酸、丁酸等發(fā)酵產(chǎn)生氫氣，進(jìn)而在測(cè)定氫化酶活性時(shí)被產(chǎn)甲烷菌消耗使得氫分壓降低[26]，菌液中的小分子酸進(jìn)而轉(zhuǎn)化產(chǎn)生氫氣，故產(chǎn)甲烷菌氫化酶活性的測(cè)定值遠(yuǎn)高于產(chǎn)氫菌氫化酶活性的測(cè)定值。

2.3 產(chǎn)氣特征與氫化酶活性的關(guān)系

不同菌源菌群在逐代馴化培養(yǎng)時(shí)的氫化酶活性具有差異，而這種差異就直觀地表現(xiàn)在產(chǎn)氣特征上。圖4所示為逐代馴化培養(yǎng)后不同菌源菌群的產(chǎn)氣特征。

由圖4可以看出，礦井水無(wú)論作為產(chǎn)氫菌源還是產(chǎn)甲烷菌源，菌群的產(chǎn)氣量均隨著馴化代數(shù)的增加而增大，在三次馴化時(shí)均達(dá)到最大值，其中產(chǎn)氫量最大值為10.89 mL/g，產(chǎn)甲烷量最大值為6.54 mL/g。以沼液和污泥為菌源時(shí)，菌群的產(chǎn)氣特征與以礦井水為菌源時(shí)菌群的產(chǎn)氣特征相似，兩者無(wú)論是作為產(chǎn)氫菌源還是產(chǎn)甲烷菌源，菌群的產(chǎn)氣量都呈現(xiàn)出先增后減的變化趨勢(shì)，并且都在二次馴化時(shí)達(dá)到最大值，其中，沼液菌群的產(chǎn)氫量最大值為14.45 mL/g，產(chǎn)甲烷量最大值為4.95 mL/g；污泥菌群的產(chǎn)氫量最大值為11.32 mL/g，產(chǎn)甲烷量最大值為5.51 mL/g。

圖4 逐代馴化培養(yǎng)后不同菌源菌群的產(chǎn)氣特征Fig.4 Gas production characteristics of bacterium fromdifferent bacterial sources after successive generationacclimation and cultivation

不同菌源菌群的產(chǎn)氣效果與各自馴化階段表現(xiàn)出的氫化酶活性高度一致。在未馴化前，由于菌群還未適應(yīng)以煤為底物的環(huán)境，導(dǎo)致初期氫化酶活性較弱，產(chǎn)氣量也較低。其中，由于沼液中可能存在可供微生物利用的生物有機(jī)質(zhì)，導(dǎo)致在馴化前以沼液為菌源的菌群產(chǎn)氣量較大。對(duì)菌群的逐代馴化有效地提高了菌群對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力，氫化酶活性逐漸增強(qiáng)，對(duì)應(yīng)的產(chǎn)氣量也逐漸增大。沼液產(chǎn)氫菌在二次馴化時(shí)氫化酶活性最大，同時(shí)其產(chǎn)氫量也是三種菌源產(chǎn)氫菌產(chǎn)氣量中最大的。同理，礦井水中產(chǎn)甲烷菌在適應(yīng)煤環(huán)境后，在三次馴化時(shí)氫化酶活性和產(chǎn)甲烷量同時(shí)達(dá)到最大值。

對(duì)比文獻(xiàn)[27]研究，煤制生物氫技術(shù)屬于暗發(fā)酵，與傳統(tǒng)的光解水制氫技術(shù)相比，其能量轉(zhuǎn)化效率更高。對(duì)比同樣以河南義馬千秋礦長(zhǎng)焰煤為底物，以礦井水為菌源的產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其最終累計(jì)產(chǎn)氫量為6.24 mL/g[28]，而本研究礦井水中產(chǎn)氫菌經(jīng)馴化后的產(chǎn)氫量為10.89 mL/g，增產(chǎn)了74.52%，足以說明馴化菌群對(duì)于增產(chǎn)有極大的促進(jìn)作用。而另一項(xiàng)研究[29]在優(yōu)化煤制氫產(chǎn)出條件時(shí)，獲得的氫氣產(chǎn)量高達(dá)24.26 mL/g，原因在于添加了10 mL/g的FeCl2·4H2O，F(xiàn)e是氫化酶的重要組成部分，F(xiàn)e2+的添加通過促進(jìn)氫化酶的合成來達(dá)到提高氫氣產(chǎn)量的目的。馴化本身是為了提高菌群對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，其雖也增大氫化酶活性，但仍不及添加Fe2+的促進(jìn)效果。同理，經(jīng)馴化后的產(chǎn)甲烷菌的產(chǎn)氣能力相較于其他文獻(xiàn)[30]報(bào)道中產(chǎn)甲烷菌的產(chǎn)氣能力均有所提高。

2.4 菌濁與氫化酶活性的關(guān)系

以煤為唯一碳源的馴化培養(yǎng)能增強(qiáng)菌種對(duì)煤的適應(yīng)性，逐步提升氫化酶活性，細(xì)菌培養(yǎng)液在600 nm處的吸光值D(600)可直接反映菌濁特征，并間接考察菌濁與氫化酶活性的關(guān)系。

三種來源產(chǎn)氫菌在不同馴化培養(yǎng)階段的D(600)值如圖5所示。由圖5可以看出，馴化前菌液的D(600)明顯高于馴化后菌液的D(600)，說明三種產(chǎn)氫菌液在馴化前的微生物總量高于馴化后的微生物總量，馴化前產(chǎn)氫菌液中可能存在大量的非產(chǎn)氫細(xì)菌，它們的存在會(huì)使得菌液的生物活性很大，但卻會(huì)干擾針對(duì)產(chǎn)氫菌的氫化酶活性測(cè)定，而在測(cè)定過程中，為了提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，雖添加了產(chǎn)甲烷菌活性抑制劑2-溴乙烷磺酸鈉，但其對(duì)大部分的非產(chǎn)甲烷雜菌并不起作用。馴化后菌液中原本存在的無(wú)法利用煤的細(xì)菌因缺乏碳源而大量死亡。隨著馴化的進(jìn)行，產(chǎn)氫菌的相對(duì)含量不斷增加，加之恒溫培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，使得產(chǎn)氫菌源的D(600)值不斷增大。

圖5 逐代馴化過程檢測(cè)的不同菌源的D(600)值Fig.5 D(600) values of different bacterial sources detected in the process of generational acclimation

將三種產(chǎn)甲烷菌源在不同培養(yǎng)階段的D(600)測(cè)算值進(jìn)行對(duì)比后可以看出，產(chǎn)甲烷菌源的D(600)值在不同培養(yǎng)階段的變化規(guī)律與產(chǎn)氫菌源的D(600)值在不同培養(yǎng)階段的變化規(guī)律不同，產(chǎn)甲烷菌源在馴化前的D(600)值低于馴化后的D(600)值，說明接種后細(xì)菌的生長(zhǎng)速度緩慢，這基本符合產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)繁殖特性，產(chǎn)甲烷菌屬于典型的長(zhǎng)生長(zhǎng)周期的厭氧細(xì)菌[31-32]，接種后短短3 d的培養(yǎng)時(shí)間，產(chǎn)甲烷菌仍處于生長(zhǎng)緩慢期，特別是礦井水菌源，因其中的細(xì)菌數(shù)量本就少于沼液和污泥中的細(xì)菌數(shù)量，故相應(yīng)的D(600)值也小于沼液和污泥的D(600)值，這也是初期氫化酶活性較弱的原因。而隨著馴化的進(jìn)行，產(chǎn)甲烷菌逐漸適應(yīng)以煤為碳源進(jìn)行生長(zhǎng)和繁殖，數(shù)量不斷增多，之后D(600)出現(xiàn)下降，此時(shí)氫化酶活性也有所減弱。

3 結(jié) 論

1) 分別確定了產(chǎn)氫菌和產(chǎn)甲烷菌氫化酶活性的測(cè)定條件，產(chǎn)氫菌氫化酶活性的測(cè)定需加入溶菌酶，而產(chǎn)甲烷菌氫化酶活性的測(cè)定可以添加等量的水替代，并且以甘氨酸為電子載體測(cè)定氫化酶活性的作用效果要優(yōu)于以甲基紫精為電子載體測(cè)定氫化酶活性的作用效果。

2) 不同菌源中，產(chǎn)甲烷菌經(jīng)過逐代馴化培養(yǎng)的氫化酶活性遠(yuǎn)高于產(chǎn)氫菌經(jīng)過逐代馴化培養(yǎng)的氫化酶活性，產(chǎn)甲烷菌的氫化酶活性保持在2 mL/(mg·min)左右，而產(chǎn)氫菌的氫化酶活性基本維持在0.1 mL/(mg·min)這一很低的水平。主要是因?yàn)楫a(chǎn)甲烷菌的耗氫作用能夠有效降低環(huán)境中的氫分壓，有利于有機(jī)物分解產(chǎn)氫。

3) 不同菌源菌群的氫化酶活性隨馴化培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)基本表現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，各菌源菌群馴化培養(yǎng)氫化酶活性達(dá)到峰值的條件分別為：A1經(jīng)三次馴化并培養(yǎng)48 h，峰值為0.11 mL/(mg·min)；A2經(jīng)二次馴化并培養(yǎng)48 h，峰值為0.17 mL/(mg·min)；A3經(jīng)二次馴化并培養(yǎng)56 h，峰值為0.14 mL/(mg·min)；B1經(jīng)三次馴化并培養(yǎng)56 h，峰值為2.84 mL/(mg·min)；B2經(jīng)二次馴化并培養(yǎng)64 h，峰值為2.23 mL/(mg·min)；B3經(jīng)二次馴化并培養(yǎng)80 h，峰值為2.45 mL/(mg·min)。

4) 不同菌源菌群的產(chǎn)氣效果和菌濁與各自馴化階段表現(xiàn)出的氫化酶活性高度一致。其中A1，A2和A3的氫氣產(chǎn)量峰值分別為10.89 mL/g，14.45 mL/g和11.32 mL/g，B1，B2和B3的甲烷產(chǎn)量峰值分別為6.54 mL/g，4.95 mL/g和5.51 mL/g。