章明 單艷菊 姬改革 巨曉軍 劉一帆 屠云潔 鄒劍敏 束婧婷

摘要：PRKAG3是影響畜禽肉品質(zhì)的關(guān)鍵基因。為研究PRKAG3基因在雞不同部位肌肉中的表達(dá)及其與肌纖維類型的相關(guān)性，以隱性白羽肉雞為研究對(duì)象，用ATPase堿孵育法對(duì)不同部位肌肉肌纖維類型進(jìn)行分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測PRKAG3基因在這些肌肉組織中的表達(dá)并將其與肌纖維類型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，PRKAG3基因在Ⅰ型肌纖維比例相對(duì)較高的比目魚肌和縫匠肌中表達(dá)較低，在Ⅱa型比例較高的髂脛外側(cè)肌、腓骨長肌以及只含有Ⅱb型肌纖維的胸大肌、胸小肌中表達(dá)較高，且差異顯著（P<0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肌肉中PRKAG3基因的表達(dá)與Ⅰ型肌纖維比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維比例均呈正相關(guān)，但差異不顯著（P>0.05）。提示，在雞骨骼肌中PRKAG3很可能是AMPK在白肌中發(fā)揮作用的主要γ調(diào)節(jié)亞基。

關(guān)鍵詞：PRKAG3基因;雞;肌纖維類型;表達(dá);相關(guān)性;肌肉;AMPK

中圖分類號(hào)： S831.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2021）16-0144-04

一磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種對(duì)能量敏感的蛋白激酶，是由一個(gè)催化亞基α、2個(gè)調(diào)節(jié)亞基β和γ構(gòu)成的異源三聚體。其中催化亞基α存在α1、α2 2個(gè)亞型，調(diào)節(jié)亞基β存在β1、β2 2個(gè)亞型，調(diào)節(jié)亞基γ存在γ1、γ2、γ3這3個(gè)亞型[1]。PRKAG3（protein kinase adenosine monophosphate-activated γ3-subunit）是編碼調(diào)節(jié)亞基γ3的基因，又稱AMPKγ3。在人、大鼠和小鼠等哺乳動(dòng)物中的研究表明，不同于AMPK調(diào)節(jié)亞基γ的另外2個(gè)亞型（γ1和γ2）在體內(nèi)廣泛分布，PRKAG3在骨骼肌中高度特異性表達(dá)[1]。AMPKγ3基因敲除小鼠（Prkag3-/—）易疲勞，AMPK激活劑和低血糖濃度等誘導(dǎo)的特異AMPK應(yīng)答和功能均消失，表示AMPK其他三聚體不能補(bǔ)償包含有γ3的AMPK三聚體在體內(nèi)的作用[2-3]。自從2000年Milan等報(bào)道PRKAG3的第200個(gè)密碼子Arg突變?yōu)镚ln是引起漢普夏豬酸肉效應(yīng)的根本原因[4]后，PRKAG3作為影響畜禽肉品質(zhì)的重要候選基因，其多態(tài)性常被用于與畜禽肉品質(zhì)、屠宰性狀等經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究[5-9]。然而值得注意的是，PRKAG3基因的這種突變主要影響白肌纖維占很大比例的骨骼肌中AMPK的酶活性[1，10]。另有研究表明，PRKAG3基因R200Q突變豬慢肌肌球蛋白重鏈亞型比例增加[11]?？梢姡琍RKAG3在骨骼肌肌纖維類型組成上也發(fā)揮著重要作用。

骨骼肌的肌纖維類型是影響肉品質(zhì)的重要因素。根據(jù)肌纖維的形態(tài)、功能和生理生化特性，禽類將肌纖維分為慢肌纖維（紅肌纖維、Ⅰ型、氧化型肌纖維）、快紅肌纖維（Ⅱa型、快速氧化型纖維）和快白肌纖維（快速酵解型纖維、Ⅱb型）[12-13]。總體上，慢肌纖維含量多的肌肉肉色紅、嫩度高、風(fēng)味好，而快白肌纖維含量多的肌肉肉色蒼白、屠宰后容易產(chǎn)生“水豬肉”[14-15]。目前，在雞上還未見有關(guān)PRKAG3基因表達(dá)與肌纖維類型相關(guān)的研究報(bào)道。本研究以成年隱性白羽肉雞為試驗(yàn)對(duì)象，研究不同部位肌肉中PRKAG3基因的表達(dá)情況并將其與肌纖維類型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，研究結(jié)果將為揭示PRKAG3在雞骨骼肌中的作用以及雞的肉品質(zhì)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

120日齡隱性白羽肉雞由江蘇省家禽科學(xué)研究所國家地方雞種資源基因庫提供。選取體質(zhì)量變異系數(shù)在5%以內(nèi)的隱性白羽肉雞母雞10只。每個(gè)個(gè)體分別采集胸大肌、胸小肌、縫匠肌、髂脛外側(cè)肌、腓骨長肌和比目魚肌等樣品，置于液氮速凍后，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存。

1.2 總RNA提取和cDNA合成

按照TRNzol Universal總RNA提取試劑[DP424，天根生化科技（北京）有限公司]說明書提取肌肉樣品RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA純度和完整性后，核酸定量儀（Thermo NanoDrop One，美國）測定其濃度。按照HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（R323-01，南京諾唯贊生物科技有限公司）說明書進(jìn)行cDNA合成，合成產(chǎn)物保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中雞PRKAG3 mRNA序列（登錄號(hào)：NM__001031258.2）和DNA序列（登錄號(hào)：NC_006094.5）以及雞GAPDH mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：NM_204305.1）和DNA序列（GenBank登錄號(hào)：NC_006088.5），運(yùn)用在線Primer 3，跨基因內(nèi)含子設(shè)計(jì)引物，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PRKAG3基因上游引物序列為5′-GGATGCTCACCATCACTG-3′，下游引物序列為5′-TCTCCACGTCTCAATCTTGT-3′，片段大小為104 bp;GAPDH基因上游引物序列為 5′-CGATCTGAACTACATGGTTTAC-3′，下游引物序列為5′-TCTGCCCATTTGATGTTGC-3′，片段大小為153 bp。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR Green Ⅰ法，優(yōu)化退火溫度、引物濃度、模板濃度等。反應(yīng)體系為2×ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix 10μL，50×ROX Reference Dye2 0.4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，模板2 μL，加ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，每次反應(yīng)均設(shè)空白樣品為陰性對(duì)照。

1.5 冰凍切片制作與肌纖維類型分析

在恒溫冷凍切片機(jī)（Leica CM1850，德國）內(nèi)進(jìn)行肌肉樣品冰凍切片的制作，每個(gè)樣品垂直于肌纖維延展方向做橫切切片，切片厚度12 μm。切片在室溫下干燥5 min后，參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行肌球蛋白ATPase堿孵育法染色，染好的切片置于正置顯微鏡（Leica DM1000，德國）下觀察并拍照，每個(gè)個(gè)體隨機(jī)抽取5個(gè)完整肌束用Imag-Pro Plus 6.0軟件分析肌纖維類型。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行處理，將腓骨長肌設(shè)為對(duì)照組，計(jì)算不同肌肉組織中PRKAG3基因的相對(duì)表達(dá)量，用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way Anova分析組織對(duì)PRKAG3基因表達(dá)量和肌纖維類型比例的影響，并用Bivariate Correlation分析PRKAG3基因表達(dá)量與肌纖維類型比例的相關(guān)性。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位肌肉的肌纖維類型組成

隱性白羽肉雞腓骨長肌、縫匠肌、髂脛外側(cè)肌、比目魚肌、胸大肌和胸小肌等肌肉肌纖維ATPase堿孵育法染色結(jié)果見圖1，染色淺的是ATPase活性弱的慢肌纖維（Ι型），染色深的是ATPase活性強(qiáng)的快白肌纖維（Ⅱb型），染色效果居中的是ATPase活性居中的快紅肌纖維（Ⅱa型）。由圖1可見，胸大肌和胸小肌中只有Ⅱb型一種肌纖維類型，髂脛外側(cè)肌中有Ⅱa和Ⅱb2種肌纖維類型，腓骨長肌、縫匠肌和比目魚肌中可以區(qū)分出Ⅰ、Ⅱa和Ⅱb等3種肌纖維類型。

對(duì)髂脛外側(cè)肌、腓骨長肌、縫匠肌和比目魚肌這4個(gè)部位肌肉肌纖維類型組成比例進(jìn)行分析，結(jié)果見表1。由表1可見，比目魚肌的 Ι型肌纖維比例最高，顯著高于縫匠肌和腓骨長?。≒<0.05），縫匠肌的Ι型肌纖維比例又顯著高于腓骨長?。≒<0.05）;髂脛外側(cè)肌的Ⅱa型肌纖維比例最高，顯著高于腓骨長肌、縫匠肌和比目魚?。≒<0.05），腓骨長肌的Ⅱa型肌纖維比例又顯著高于縫匠肌和比目魚?。≒<0.05），而縫匠肌和比目魚肌的Ⅱa型肌纖維比例差異不顯著（P>0.05）;Ⅱb型肌纖維比例在縫匠肌中最高，在髂脛外側(cè)肌中最低，除縫匠肌與髂脛外側(cè)肌的Ⅱb型肌纖維比例差異達(dá)顯著水平外（P<0.05），其余肌肉的Ⅱb型肌纖維比例差異均不顯著（P>0.05）。

2.2 PRKAG3基因在不同部位肌肉中的表達(dá)

由圖2可見，PRKAG3基因在髂脛外側(cè)肌中表達(dá)水平最高，在比目魚肌中表達(dá)水平最低;PRKAG3基因在髂脛外側(cè)肌、腓骨長肌、胸大肌和胸小肌中的表達(dá)差異不顯著（P>0.05），但均顯著高于縫匠肌和比目魚?。≒<0.05）;PRKAG3基因在縫匠肌和比目魚肌中的表達(dá)量差異不顯著（P>0.05）。

2.3 不同部位肌肉中PRKAG3基因的表達(dá)與肌纖維類型相關(guān)分析

由表2可見，肌肉中PRKAG3基因的表達(dá)與Ⅰ型肌纖維比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維比例均呈正相關(guān)，但差異不顯著（P>0.05）。

3 討論與結(jié)論

肌纖維是肌肉的構(gòu)成單位，肌纖維類型不僅與肉色、pH值、系水力、嫩度、肌內(nèi)脂肪和風(fēng)味物質(zhì)含量等肉品質(zhì)指標(biāo)密切相關(guān)，還直接影響骨骼肌的代謝[16-20]。了解肌肉肌纖維類型分布規(guī)律對(duì)研究動(dòng)物生長、代謝和肉品質(zhì)均具有重要意義。不同部位的肌肉，其肌纖維類型組成往往不同[21]。本研究用ATPase堿孵育法對(duì)成年隱性白羽肉雞不同部位肌肉肌纖維類型組成進(jìn)行分析，結(jié)果在位于小腿部位的腓骨長肌和比目魚肌以及位于大腿部位的縫匠肌中檢測到Ⅰ、Ⅱa和Ⅱb 3種肌纖維類型，在位于大腿部位的髂脛外側(cè)肌中檢測到Ⅱa和Ⅱb 2種肌纖維類型，而在軀干肌肉胸大肌和胸小肌中均僅檢測到Ⅱb型纖維。這與Zhang等在AA肉雞[22]以及Oshima等在絲羽、蛋用和肉用3個(gè)品種雞[23]的胸大肌中均僅檢測到Ⅱb型纖維的結(jié)果一致。

越來越多的研究表明，AMPK在控制骨骼肌葡萄糖攝取、脂肪酸氧化和基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用。AMPK不同亞單位在不同類型肌纖維中的獨(dú)特表達(dá)模式，很可能與AMPK發(fā)揮作用有關(guān)[24]。在大鼠和小鼠骨骼肌中，PRKAG3基因的表達(dá)與肌肉中白?、騜型比例呈強(qiáng)正相關(guān)，強(qiáng)烈暗示PRKAG3基因在該組織中的作用[1]。束婧婷等用表達(dá)譜芯片挖掘雞骨骼肌不同類型肌纖維差異表達(dá)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，PRKAG3可能是調(diào)控雞肌纖維類型組成基因網(wǎng)絡(luò)中的重要節(jié)點(diǎn)基因[25]。本研究表明，PRKAG3基因在Ⅰ型肌纖維比例相對(duì)較高的比目魚肌和縫匠肌中表達(dá)較低，在Ⅱa型比例較高的髂脛外側(cè)肌、腓骨長肌以及只含有Ⅱb型肌纖維的胸大肌、胸小肌中表達(dá)較高，且差異達(dá)顯著水平（P<0.05）。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，肌肉中PRKAG3基因的表達(dá)與Ⅰ型肌纖維比例呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），與Ⅱa型和Ⅱb型肌纖維比例均呈正相關(guān)，但差異不顯著（P>0.05）。提示，在雞骨骼肌中PRKAG3很可能是AMPK在白肌中發(fā)揮作用的主要γ調(diào)節(jié)亞基。

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