于 琪，黃 晏，周文霞

（1.煙臺大學(xué)藥學(xué)院，山東 煙臺 264005；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 100850）

應(yīng)激是指機體受到內(nèi)外環(huán)境因素刺激時表現(xiàn)出的非特異性、全身性的神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)。應(yīng)激時，下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)被激活，大量分泌腎上腺皮質(zhì)激素［1］，在嚙齒類動物中以皮質(zhì)酮（corticos?terone，CORT）為主。有研究表明，糖皮質(zhì)激素是介導(dǎo)應(yīng)激致神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷的重要因素。在細胞水平，糖皮質(zhì)激素不但可通過影響細胞新陳代謝等途徑直接損傷海馬神經(jīng)元，還可加劇谷氨酸和缺氧等對海馬神經(jīng)元的毒性作用［2-3］。在動物水平，糖皮質(zhì)激素可誘導(dǎo)突觸可塑性和認知功能（記憶的獲取、鞏固和提?。p傷［4］。臨床研究表明，糖皮質(zhì)激素水平過度增高與認知功能障礙密切相關(guān)［5］。目前認為，糖皮質(zhì)激素可通過直接誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷［2］、降低腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達和蛋白質(zhì)翻譯［3，6］及興奮性損傷［7］等途徑損傷神經(jīng)系統(tǒng)的功能。其中，谷氨酸誘導(dǎo)的興奮性毒性被認為是糖皮質(zhì)激素損害神經(jīng)系統(tǒng)的重要途徑之一。

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體是其發(fā)揮作用的重要受體之一。NMDA受體是一種離子型的谷氨酸受體，通常由2個1型亞基（GluN1）和2個2型亞基（GluN2）組成的異構(gòu)體復(fù)合物，其中GluN2A和GluN2B是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的GluN2亞單位。通常認為，GluN2A主要分布在突觸內(nèi)，介導(dǎo)突觸傳遞和細胞生存；GluN2B主要分布在突觸外，介導(dǎo)興奮性毒性和細胞凋亡［8-9］。同時，NMDA受體也是介導(dǎo)興奮性毒性的重要途徑之一［10］。研究表明，糖皮質(zhì)激素可通過促進突觸前谷氨酸釋放和抑制谷氨酸重攝取使細胞外谷氨酸水平升高，進而過度激活NMDA受體，使細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，最終導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)功能 損傷［4，7，11-13］。 因 此 ，很多 研究 期 望 通 過調(diào) 節(jié)NMDA受體來改善應(yīng)激致神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，但到底應(yīng)拮抗還是增強NMDA受體功能，尚存在爭議。一些研究表明，抑制NMDA受體功能對應(yīng)激致神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷有改善作用，如NMDA受體拮抗劑美金剛ip給藥14 d可顯著改善應(yīng)激致大鼠記憶損傷［14］。相反，另一些研究則表明，增強NMDA受體功能可改善應(yīng)激致神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷，如NMDA受體共激活劑（coactivator）D-絲氨酸（D-serine，D-Ser）可改善應(yīng)激致認知功能障礙［15-16］。此外，還有研究提示，NMDA受體拮抗劑可通過間接增強谷氨酸能神經(jīng)元興奮性來改善應(yīng)激致認知功能障礙［17］。由此可見，應(yīng)激致突觸可塑性和認知功能損傷時，NMDA受體功能是過度激活還是抑制，目前尚不清楚。因此，闡明NMDA受體功能是過度激活還是抑制，對應(yīng)激所致突觸可塑性和認知功能損傷防治策略的確定和藥物研發(fā)均具有重要意義。

突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶的重要生理學(xué)基礎(chǔ)，長時程增強（long-term potentiation，LTP）是突觸可塑性的主要功能指標之一［14］，常用于學(xué)習(xí)記憶相關(guān)機制的研究中［18］。CORT致LTP減弱也常用于應(yīng)激致突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶損傷機制的研究［19-20］。本研究以LTP為指標，在小鼠離體海馬腦片上觀察多種NMDA受體抑制劑或激動劑對CORT致突觸可塑性損傷的影響，以期明確皮質(zhì)酮致LTP減弱時NMDA受體功能是過度激活還是抑制。

1 材料與方法

1.1 動物、藥品和儀器

C57BL/6J小鼠，雄性，體重19～21 g，SPF級，購自斯貝福生物有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。所有動物在標準實驗室條件下（12 h/12 h光暗循環(huán)，溫度22～26℃，空氣濕度55%～60%）適應(yīng)1周后用于實驗。動物飼養(yǎng)和所有實驗方案均嚴格遵守軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。

NMDA受體拮抗劑D-AP5、GluN2A拮抗劑TCN-201、GluN2B拮抗劑Ro25-6981、NMDA受體共激活劑 D-Ser、NaCl、KCl、CaCl2、MgSO4、NaH2PO4、NaHCO3、D-葡萄糖（D-glucose，D-Glu）、CORT、DMSO和其他化學(xué)試劑均購自美國Sigma公司。

pH計，北京屹源電子儀器科技公司；磁力攪拌機，上海南匯電訊器材廠；恒溫水浴鍋，北京長安科學(xué)儀器廠；萬分之一分析天平（Sartorious-110S），美國Sartorious公司；純水儀（Millinois-Q Biocel），德國Millipore公司；振動切片機（DTK-1000），日本DOSAKA公司；平面微電極陣列記錄系統(tǒng)（MED64）和MED Probe（P1515A），日本Alpha MED Scientific公司；溫度控制器，美國Automate公司；蠕動泵，河北保定蘭格公司；正置顯微鏡，廣州明美科技有限公司；Slice anchor（SHD-22CKIT），美國Warner公司。

1.2 工具藥配制

稱取適量D-AP5溶于DMSO，然后用人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）（mmol·L-1：NaCl，124；KCl，5；CaCl2，2.5；MgSO4，1.3；NaH2PO4，1.2；NaHCO3，26；D-Glu，10）［9］稀釋為 10，25 和100 μmol·L-1，DMSO終濃度≤0.1%。同樣方法配制CORT 1 μmol·L-1，TCN-201 1，3和6 μmol·L-1，Ro25-6981 0.25，0.5和1 μmol·L-1及D-Ser 10 μmol·L-1［21］。

1.3 海馬腦片制備［22］

小鼠用異氟烷麻醉后斷頭取腦，剝離海馬，使用振動切片機（切片速度0.2 mm·s-1，振動頻率80 Hz）將海馬切成厚度為300 μm的腦片，并移至預(yù)通氧（95% O2，5% CO2）1 h的ACSF 中，孵育（31～32℃）1.5 h后用于LTP實驗。

1.4 小鼠海馬腦片LTP記錄和分析［22］

本研究使用MED64 Mobius軟件對LTP進行記錄和分析。藥物采用循環(huán)灌流方式施加于腦片，蠕動泵速度控制在1.0～2.0 mL·min-1。實驗時，將腦片置于微陣列電極中，使海馬CA3-CA1區(qū)域與電極區(qū)域重合，選擇0.033 Hz單脈沖刺激作為基礎(chǔ)突觸傳遞的刺激強度，選取位于Schaffer側(cè)枝的電極作為刺激電極，并選擇可在0.033 Hz單脈沖刺激下誘發(fā)平滑穩(wěn)定的場興奮性突觸后電位（field excit?atory postsynaptic potential，fEPSP）波形的通道為記錄電極，刺激電極和記錄電極間距150～300 μm（圖1A），記錄fEPSP。通過觀察input-output曲線將刺激電流調(diào)整至可誘發(fā)最大fEPSP斜率1/3～1/2的強度，待fEPSP穩(wěn)定后開始記錄15 min fEPSP斜率，取其均值作為fEPSP斜率基礎(chǔ)值，而后施加高頻刺激（high-frequency stimulation，HFS；100 Hz，100串）誘發(fā)LTP，并繼續(xù)記錄fEPSP斜率60 min（圖1B），以HFS后fEPSP斜率與基礎(chǔ)fEPSP斜率比值的百分數(shù)表示LTP。本研究中選取誘發(fā)LTP后第30～60分鐘的LTP增幅進行統(tǒng)計學(xué)分析。

Fig.1 Diagram of relative position of hippocampal slices(A)and electrodes and experimental flow chart(B).The distance between the stimulation electrode and the recording electrode was 150-300 μm.High-frequency stimula?tion(HFS,100 Hz,100 trains)was used to induce long-term potenti?ation(LTP)in Schaffer-CA1 pathway of the dorsal hippocampal slices.Corticosterone(CORT)1 μmol· L-1,CORT 1 μmol· L-1+D-AP5 10 μmol· L-1,CORT 1 μmol· L-1+TCN-201 1 μmol· L-1,CORT 1 μmo·L-1+Ro25-6981 0.25 μmol·L-1,CORT 1 μmol·L-1+D-serine(D-Ser)10 μmol·L-1were applied by recirculating perfu?sion(75 min).The 15-min field excitatory postsynaptic potential(fEPSP)slope was recorded and the average value was taken as the basic fEPSP slope value,and then HFS was used to induce LTP.The ratio of fEPSP slope after HFS and basic fEPSP slope was used to indicate LTP.The average ratio durning 30-60 min after HFS was used for statistical analysis.ACSF:artificial cere?brospinal fluid.

1.5 不同濃度NMDA受體拮抗劑對LTP的影響

將小鼠海馬腦片分為正常對照組和藥物處理組（n=5），分別用ACSF或含D-AP5 10，25和100 μmol·L-1、TCN-201 1，3 和 6 μmol·L-1及Ro25-6981 0.25，0.5和1 μmol·L-1的ACSF全程（75 min）循環(huán)灌流。海馬腦片LTP的記錄和分析同1.4。

1.6 NMDA受體拮抗劑和共激活劑對CORT致LTP減弱的影響

小鼠海馬腦片分為正常對照組、CORT 1 μmol·L-1組、CORT 1 μmol·L-1+D-AP5 10 μmol·L-1組、CORT 1 μmol·L-1+TCN-201 1 μmol·L-1組、CORT 1 μmol·L-1+Ro25-6981 0.25 μmol·L-1組和 CORT 1 μmol·L-1+D-Ser 10 μmol·L-1組（n=5），分別用ACSF或含不同藥物的ACSF全程（75 min）循環(huán)灌流。海馬腦片LTP的記錄和分析同1.4。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 NMDA受體亞型非選擇性拮抗劑D-AP5對CORT致LTP減弱的影響

D-AP5對正常LTP的影響如圖2A所示，與正常對照組相比，D-AP5 10 μmol·L-1對 fEPSP 斜率的增幅無顯著影響，D-AP5 25和100 μmol·L-1可顯著降低fEPSP斜率的增幅（P<0.01）。后續(xù)實驗選擇對正常LTP無明顯影響的濃度（即10 μmol·L-1）觀察D-AP5對CORT致LTP減弱的影響。

CORT 1 μmol·L-1對基礎(chǔ)fEPSP斜率無明顯影響（圖2B）；HFS刺激后，正常對照組fEPSP斜率上升至（166±12）%，成功誘發(fā) LTP；而 CORT 1 μmol·L-1組fEPSP斜率僅上升至（129±14）%，顯著低于正常對照組（P<0.01）（圖2C和2D），提示CORT 1 μmol·L-1在不影響基礎(chǔ)傳遞的條件下顯著減弱LTP。與CORT組相比，CORT+D-AP5組的fEPSP斜率增幅僅有（112.9±1.6）%，提示D-AP5 10 μmol·L-1對 CORT 致 LTP 減弱無改善作用（圖2C和2D）。

2.2 NMDA受體亞型選擇性拮抗劑TCN-201和Ro25-6981對CORT致LTP減弱的作用

隨著濃度的增加，GluN2A拮抗劑TCN-201（圖3A）和GluN2B拮抗劑Ro25-6981（圖4A）均可顯著降低fEPSP斜率的增幅。后續(xù)實驗選擇對正常LTP無明顯影響的濃度（即 TCN-201 1 μmol·L-1和Ro25-6981 0.25 μmol·L-1）觀察其對CORT致 LTP減弱的作用。

與CORT組相比，CORT+TCN-201 1 μmol·L-1組的fEPSP斜率增幅僅有（117±7）%，提示GluN2A拮抗劑對CORT致EPSP斜率增幅的降低無改善作用（圖3B和3C）；CORT+Ro25-6981 0.25 μmol·L-1組的fEPSP斜率增幅僅有（115.1±2.4）%，提示GluN2B拮抗劑對CORT致fEPSP斜率增幅的降低無改善作用（圖4B和4C）。以上結(jié)果表明，NMDA受體亞型選擇性拮抗劑對CORT致LTP減弱無改善作用。

Fig.4 Effect of Ro25-6981 on CORT-induced LTP impair?ment.A：effect of Ro25-6981 on LTP.Hippocampal slices were recirculating perfused by ACSF with Ro25-6981 0.25，0.5 and 1 μmol· L-1for 75 min.B and C：effect of Ro25-6981 on CORT-induced LTP.See Fig.1 for the treatment，C was the quantitative analysis result of B.±s，n=5（from 3-4 mice）.＊＊P<0.01，compared with normal control group.

2.3 NMDA受體共激活劑對CORT致LTP減弱的作用

與CORT組相比，CORT+D-Ser組fEPSP斜率增幅上升至（161±11）%，即 D-Ser可顯著改善CORT導(dǎo)致的fEPSP斜率增幅降低（P<0.01）（圖5），提示增強NMDA受體功能可改善CORT致LTP減弱。

Fig.5 Effect of D-Ser on CORT-induced LTP impair?ment.See Fig.1 for the treatment.B was the quantitative analysis result of A.±s，n=5（from 3-4 mice）.＊＊P<0.01，compared with normal control group.

3 討論

本研究首先觀察 CORT 1 μmol·L-1對基礎(chǔ)突觸傳遞和LTP的影響，然后觀察了NMDA受體亞型非選擇性拮抗劑D-AP5、GluN2A選擇性拮抗劑TCN-201、GluN2B選擇性拮抗劑Ro25-6981和NMDA受體共激活劑D-Ser對CORT致LTP減弱的作用。結(jié)果表明，CORT 1 μmol·L-1可在不影響基礎(chǔ)突觸傳遞的條件下顯著損傷海馬LTP，與文獻［19-20］報道一致。提示CORT 1 μmol·L-1誘導(dǎo)的LTP減弱并非抑制基礎(chǔ)突觸傳遞過程，而是干擾LTP的誘導(dǎo)所導(dǎo)致。

在海馬中，LTP的誘導(dǎo)主要由NMDA受體介導(dǎo)［23-24］。為明確抑制NMDA受體功能對CORT致LTP減弱的影響，本研究選擇D-AP5在對LTP無明顯影響的濃度下觀察其抑制NMDA受體功能對CORT致LTP減弱的影響。結(jié)果表明，D-AP5對CORT致LTP減弱無改善作用，提示CORT致LTP減弱時，NMDA受體可能并未過度激活。有研究表明，糖皮質(zhì)激素不僅通過激活GluN2A增強NMDA誘發(fā)的神經(jīng)毒性［25］，而且可激活GluN2B，損害記憶檢索功能［7］，提示應(yīng)激可能通過激活NMDA受體不同亞型介導(dǎo)突觸可塑性損傷。因此，本研究選擇TCN-201和Ro25-6981，在對LTP無明顯影響的濃度下，觀察特異性拮抗GluN2A或GluN2B對CORT致LTP減弱的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GluN2A拮抗劑和GluN2B拮抗劑均對CORT致LTP減弱的無改善作用。可見，不論是NMDA受體亞型非選擇性還是亞型選擇性拮抗劑均對CORT致LTP減弱無改善作用。因此，有理由推測，CORT致突觸可塑性損傷時，NMDA受體功能可能并非過度激活，而是降低。本研究進一步觀察NMDA受體共激活劑D-Ser對CORT致LTP減弱的影響，以驗證此推測。

D-Ser由L-Ser經(jīng)絲氨酸消旋酶催化而成，與NMDA受體的甘氨酸位點結(jié)合發(fā)揮作用［26］。有文獻報道，NMDA受體甘氨酸位點激動劑D-Ser可用于抑郁、焦慮等精神疾病的輔助治療［15］。本研究結(jié)果表明，D-Ser顯著改善CORT致LTP減弱，即增強NMDA受體功能可改善應(yīng)激致LTP減弱，提示NMDA受體功能是降低而非增強參與CORT致LTP減弱。

文獻報道，NMDA受體拮抗劑美金剛和氯胺酮可以改善應(yīng)激小鼠的LTP減弱［14，27］，提示在動物水平中抑制NMDA受體功能可改善應(yīng)激致LTP減弱。但本研究在離體腦片中得到的結(jié)果卻提示，激動NMDA受體才能改善CORT致LTP減弱，與文獻報道存在矛盾。有文獻報道，在整體動物水平，NMDA受體拮抗劑通過抑制GABA能神經(jīng)元中間NMDA受體的表達和影響NMDA受體介導(dǎo)的自發(fā)興奮性傳遞發(fā)揮抗應(yīng)激作用［28-29］。如氯胺酮可優(yōu)先抑制GABA能中間神經(jīng)元NMDA受體的表達，導(dǎo)致內(nèi)側(cè)前額葉皮質(zhì)錐體細胞的去抑制和興奮性谷氨酸能神經(jīng)傳遞的增強來治療大鼠慢性社會挫敗應(yīng)激致突觸可塑性損傷［17，30］；D-AP5和MK-801等可阻斷NMDA受體介導(dǎo)的靜息神經(jīng)傳遞，從而抑制蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致大鼠海馬CA1區(qū)突觸傳遞增強［31-32］。這些報道表明，間接增加谷氨酸能神經(jīng)元的興奮性是NMDA受體拮抗劑在整體動物水平發(fā)揮抗應(yīng)激作用的重要途徑之一，與本研究通過直接增強NMDA受體功能來改善CORT致LTP減弱的結(jié)果一致，均提示谷氨酸能神經(jīng)元突觸傳遞功能降低是CORT致突觸可塑性損傷的重要因素。

目前，NMDA受體過度激活所致的興奮性損傷被認為是應(yīng)激致認知功能損傷的主要因素之一。但本研究結(jié)果表明，NMDA受體功能降低是參與CORT致LTP減弱的重要因素之一，提示增強NMDA受體功能可能是改善應(yīng)激致認知功能損傷的良好策略，為進一步研究應(yīng)激致認知功能障礙的機制和相關(guān)藥物研發(fā)提供了新的思路。