付寶軍，姜靜靜，黃玉瓊，林宗航，李 恒

（廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院，清遠市人民醫(yī)院麻醉科，廣東 清遠 511518）

長春新堿（vincristine）是一種最常用化療藥物，在抗腫瘤治療中發(fā)揮重要作用，該藥在治療腫瘤同時常常誘導產(chǎn)生化療誘導神經(jīng)病理性痛（chemo?therapy-induced neuropathic pain，CINP）［1］，這種不良反應的嚴重程度通常與化療藥物使用劑量有關。目前臨床治療CINP的藥物不僅療效不理想，而且藥物本身的不良反應也限制了其臨床應用［2-3］。因此，闡明CINP發(fā)生發(fā)展機制，尋找新的藥物作用靶點，對于開發(fā)安全有效治療藥物具有重大臨床意義。隨著對CINP機制研究的不斷深入，膠質(zhì)細胞尤其小膠質(zhì)細胞在CINP中的作用得到更廣泛關注［4-5］。研究表明，腹腔注射長春新堿導致 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號激活，同時伴有小膠質(zhì)細胞和星型膠質(zhì)細胞活化［6］。在長春新堿誘導CINP模型中，Notch信號促進脊髓小膠質(zhì)細胞趨化因子C-X3-C-基元受體 1〔chemokine（C-X3-C motif）receptor 1，CX3CR1〕/p38絲裂原激活的蛋白激酶（p38 mito?gen-activated protein kinase，p38 MAPK）通路活化［7］，但在CINP中脊髓小膠質(zhì)細胞活化調(diào)節(jié)機制仍不清楚。Pellino（Peli）是最近發(fā)現(xiàn)的一個E3泛素連接酶家族，包括Peli1，Peli2和Peli3［8］。最近研究顯示，Peli1通過促進腫瘤壞死因子受體相關蛋白6（tumer necrosis factor receptor associated factor 6，TRAF6）的泛素化，激活心肌中MAPK和NF-κB信號通路，導致炎癥反應［9-11］。另一項研究表明，在小膠質(zhì)細胞中，Peli1通過泛素化激活白細胞介素1（interleukin-1，IL-1）受體相關激酶/TRAF6復合物介導 Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）/NF-κB信號轉(zhuǎn)導促進炎癥反應［12］。Peli1作為一種小膠質(zhì)細胞特異性調(diào)節(jié)因子，參與實驗性自身免疫性腦脊髓炎［13］、蛛網(wǎng)膜下腔出血［14］和西尼羅病毒腦炎的病理生理過程［15］。有研究報道，坐骨神經(jīng)壓迫損傷模型中，大鼠脊髓Peli1通過增加K63相關TRAF6泛素化，從而激活MAPK信號通路［16］。更值得關注的是，最近研究表明，在坐骨神經(jīng)壓迫致神經(jīng)病理性痛和嗎啡鎮(zhèn)痛耐受中，脊髓背角Peli1蛋白表達上調(diào)，并通過活化小膠質(zhì)細胞參與痛覺過敏發(fā)生和維持過程［16-17］。本研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，脊髓背角Peli1蛋白參與瑞芬太尼誘發(fā)痛覺過敏，其機制與神經(jīng)炎癥密切相關［18］。然而Peli1在CINP中的作用未見報道。本研究采用長春新堿誘導CINP大鼠模型，通過鞘內(nèi)注射表達Peli1短發(fā)夾RNA（Peli1 short hairpin RNA，shPeli1）的慢病毒靶向抑制Peli1，探討Peli1在長春新堿誘導CINP中的作用及其可能機制，為CINP發(fā)生機制的研究提供理論基礎，為研發(fā)防治CINP新藥提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

注射用硫酸長春新堿（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：H20068151）。山羊抗大鼠Peli1、離子鈣接頭蛋白1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）、膠質(zhì)細胞原纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、磷酸化 p38 MAPK（phospho-p38 MAPK，p-p38 MAPK）、p38 MAPK、p-c-Jun N 端激酶（p-c-Jun N-terminal kinases，p-JNK）、JNK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases1/2，ERK1/2）和 p-ERK1/2單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；IL-6、IL-1β和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒（上海碧云天生物技術公司）；HRP標記的兔抗山羊IgG抗體、CY3標記的兔抗山羊IgG抗體和cDNA第一鏈合成試劑盒（美國Invit?rogen公司）；RT-PCR試劑盒（美國Abcam公司）；干擾shRNA（scrambled shRNA，shscr）、shRNA寡核苷酸鏈和慢病毒質(zhì)粒（上海吉凱基因化學技術有限公司）。NK3酶標儀（iMark，美國Bio Tek公司）；高速離心機（5415R，德國Eppendorf公司）；凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；熒光顯微鏡（DM4000B，德國Leica公司）；PE-10導管（上海瑾瑜科學儀器有限公司）；Von frey纖維絲刺激針（37400，意大利Ugo Basile公司）；熱輻射痛刺激儀（美國，Stoelting公司）。

1.2 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠，體重200～230 g，10～12周齡，由廣東省醫(yī)學研究院實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK（粵）2019-0206。12 h光照-黑暗循環(huán)、安靜環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由飲水攝食。室溫21.5～22.5℃，濕度45%～65%。所有實驗操作均符合廣州醫(yī)科大學附屬第六醫(yī)院動物實驗中心動物倫理要求并按照實驗動物使用原則進行。

1.3 慢病毒介導shRNA構(gòu)建

1.3.1 shRNA寡核苷酸鏈設計合成

根據(jù)Peli1微RNA序列設計Peli1 shRNA（shPeli1）1，2和3及shscr（陰性對照），每條核苷酸鏈的中間添加莖環(huán)結(jié)構(gòu)TTCAAGAGA，正、反義鏈的5′端分別引入GATCC和AATTC，分別與BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后的黏性末端互補，經(jīng)Blast比對，與人類其他基因編碼序列無同源性。shPeli1和shscr寡核苷酸鏈由上海吉凱基因化學技術有限公司合成。

1.3.2 Peli1 shRNA慢病毒質(zhì)粒構(gòu)建

用BamHⅠ和EcoRⅠ對慢病毒質(zhì)粒進行雙酶切，將shRNA寡核苷酸鏈退火形成雙鏈DNA并與雙酶切后的質(zhì)粒連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α大腸桿菌，在氨芐青霉素瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，篩選陽性克隆后委托上海吉瑪制藥技術有限公司測序驗證。Peli1 shRNA1：5′-GGATTTATGCTG?CAGGGTTTG-3′；Peli1 shRNA2：5′-GGTGGTT?GAATATACTCATGA-3′；Peli1 shRNA3：5′GGTTCACAGAAGACTCCAAAC-3′；shscr：5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3′。

1.4 大鼠鞘內(nèi)置管術

大鼠ip給予戊巴比妥鈉50 mg·kg-1麻醉后，參照Yaksh等［19］方法進行鞘內(nèi)置管。定位于大鼠L3～L4棘突間隙，常規(guī)備皮，消毒，俯臥位固定，切開皮膚，鈍性分離棘突兩側(cè)肌肉與筋膜，暴露并挑破硬脊膜后將PE-10導管向頭端置入約2 cm，觀察大鼠是否出現(xiàn)甩尾反射及是否有腦脊液流出，若出現(xiàn)則說明置管順利。固定導管，并將導管經(jīng)皮下隧道至頸部引出，消毒縫皮后單籠飼養(yǎng)。置管后通過PE-10導管注射2%利多卡因15 μL，如果30 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)雙后肢麻痹（肢體完全不能活動且不見肌肉的收縮）且30 min后運動功能恢復正常，則判定為置管成功。剔除肌力減退或癱瘓（即后爪不能完全伸展、行走時轉(zhuǎn)圈或傾倒及不能自發(fā)行走）的大鼠。

1.5 大鼠分組和藥物處理

1.5.1 正常大鼠脊髓Peli1敲減實驗

正常雄性SD大鼠行鞘內(nèi)置管術后按隨機數(shù)字表法分為shscr組和shPeli1組（n=9），分別于術后第2～4天（D2～D4）每天1次鞘內(nèi)注射shscr慢病毒10 μL或shPeli1慢病毒10 μL（2×108TU）。于術后D4，D6，D8，D10和D12進行機械痛覺過敏和熱痛覺過敏行為學檢測（機械痛覺過敏實驗結(jié)束30 min后行熱痛覺過敏實驗），D12行為學檢測后30 min處死大鼠，取大鼠L4～L5脊髓節(jié)段，分別用Western印跡法和RT-PCR檢測Peli1蛋白和mRNA表達水平（實驗流程見圖1A）。

1.5.2 CINP模型大鼠脊髓Peli1敲減實驗

正常雄性SD大鼠行鞘內(nèi)置管術后隨機分為正常對照組、CINP組、CINP+shscr組和CINP+shPeli1組。CINP+shscr組和CINP+shPeli1組分別于鞘內(nèi)置管術后D2～D4每天1次鞘內(nèi)注射shscr慢病毒10 μL或shPeli1慢病毒10 μL（2×108TU）［16］。于鞘內(nèi)置管術后D5開始，除正常對照組外，其余各組隔日ip給予長春新堿125 mg·kg-1（共4次）［20］，分別于鞘內(nèi)置管術后D4，D6，D8，D10和D12進行機械痛覺過敏和熱痛覺過敏（機械痛覺過敏實驗結(jié)束30 min后行熱痛覺過敏）行為學檢測，以D8 MWT和TWL均降低至≤70%基礎值為模型制備成功（本實驗模型成功率≥94.4%，造模成功后n=18）。于D12行為學檢測后30 min處死大鼠，取大鼠L4～L5脊髓節(jié)段，用于后續(xù)Western印跡、RT-PCR和ELISA檢測（實驗流程見圖1B）。

Fig.1 Experimental procedure.A：the normal male SD rats were intrathecally injected（it）with scrambled shRNA（shscr group）or Peli1 shRNA（shPeli1 group）once daily from the 2ndday after intrathecal catheterization（D2）to D4.Mechanical allodynia and heat hyperalgesia were evaluated via the mechanical withdrawal threshold（MWT）and thermal withdrawal latency（TWL）on D4，D6，D8，D10 and D12（n=6）.The rats were sacrificed 30 min after the detection of behavior on D12，and the L4-L5 spinal cord was removed for the assays of Western blotting and RT-PCR（n=3）.B：the normal male SD rats were randomly divided into normal control group，CINP group，CINP+shscr group and CINP+shPeli1 group after intrathecal catheterization（n=18）.Rats were injected intrathecally with lentivirus expressing shscr 10 μL and shPeli1 10 μL（2×108TU）once daily from D2 to D4 in CINP+shscr group and CINP+shPeli1 group，respec?tively.Vincristine 125 mg·kg-1was ip injected on four alternate days from D5 in the remaining groups except the normal control group.The behavior detection of mechanical allodynia and heat hyperalgesia was performed on D4，D6，D8，D10 and D12，respectively（n=6）.The rats were sacrificed 30 min after the detection of behavior on D12，and L4-L5 spinal cord segments were taken for subsequent assays.

1.6 機械痛覺過敏和熱痛覺過敏行為學檢測

根據(jù)文獻［21］方法，用Von frey纖維絲按克數(shù)由小到大的順序依次垂直刺激大鼠后足底中部，力度以纖維輕微彎曲為準，持續(xù)3～5 s，直到大鼠出現(xiàn)縮足反應，同一克數(shù)的纖維絲重復測試3次，每次間隔5 min，引起大鼠縮足反應的最小纖維絲克數(shù)即為機械縮足反射閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）。以up-down法推測大鼠MWT，中位數(shù)法計算50%反應閾值，以反映大鼠機械痛覺過敏。

參照文獻［22］方法，將大鼠置于厚3 mm的玻璃板上適應環(huán)境15 min，用熱輻射刺激儀照射大鼠后肢足底中部（刺激強度在整個實驗過程中維持一致），照射開始至大鼠出現(xiàn)縮足或舔足的時間為熱縮足反射潛伏期（thermal withdrawal latency，TWL），每只大鼠測定5次，每次間隔3 min，計算平均TWL反映大鼠熱痛覺過敏。為避免組織損傷，最長照射時間設為20 s。

1.7 Western印跡法檢測脊髓Peli1，Iba1和GFAP蛋白表達水平及p38 MAPK，JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平

大鼠分組和藥物處理同1.5.2。D12，每組各取3只大鼠，處死后冰上迅速取出L4～L5脊髓節(jié)段，加入裂解液進行勻漿，4℃下17 888×g離心5 min，并用BCA試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。每份樣品取30 μg進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后牛奶封閉2 h，加入一抗（稀釋倍數(shù)：GAPDH，p38 MAPK，JNK和 ERK1/2 為 1∶1000；Peli1，GFAP，Iba1，p-p38 MAPK，p-JNK和p-ERK1/2為1∶2000），4℃孵育過夜，加入HRP標記的兔抗山羊IgG抗體（1∶1000）室溫孵育后洗膜、顯色、曝光、顯影，采用Image J軟件分析蛋白條帶積分吸光度，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值或磷酸化蛋白條帶與其總蛋白條帶積分吸光度比值反映目的蛋白相對表達水平或蛋白磷酸化水平。

1.8 RT-PCR檢測脊髓Peli1，Iba1和GFAP mRNA表達水平

大鼠分組和藥物處理同1.5.2。D12，每組各取3只大鼠，處死后取L4～L5脊髓，使用TRIzol?試劑提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物序列見表1。擴增條件：94℃預變性 5 min，94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 20 s，共45個循環(huán)，72℃延伸10 min。用2-ΔCt法計算Peli1，Iba1和GFAP mRNA相對表達水平。

Tab.1 Sequence of primers for RT-PCR

1.9 免疫熒光化學法檢測脊髓組織切片Iba1蛋白表達

大鼠分組和藥物處理同1.5.2。D12，每組取3只大鼠，麻醉后迅速取大鼠L4～L5脊髓節(jié)段，4%多聚甲醛固定2 h后分別于20%和30%蔗糖溶液中脫水，冰凍切片機切片（厚度15 μm）。免疫熒光染色：PBS 0.01 mol·L-1（pH7.4）洗片 3 次，每次20 min，加5%山羊血清室溫封閉2 h后加山羊抗大鼠Iba1抗體（1∶200），4℃孵育過夜；次日復溫至室溫后PBS洗3次，每次15 min；分別加入CY3標記的兔抗山羊IgG抗體（1∶1000），室溫孵育2 h；PBS洗3次，每次20 min；晾干，封片劑封片；倒置熒光顯微鏡下拍照觀察。每只大鼠隨機選擇4張脊髓切片使用Image J軟件計算各組熒光強度值反映Iba1蛋白表達水平。

1.10 ELISA檢測脊髓勻漿TNF-α，IL-6和IL-1 β含量

大鼠分組和藥物處理同1.5.2。D12，每組大鼠取3只斷頭處死，迅速冰上取出L4-L5脊髓節(jié)段并勻漿，4℃，7155×g 離心10 min，取上清液，-80℃保存。TNF-α，IL-6和IL-1β含量測定按照試劑盒說明書進行。用NK3酶標儀于波長480 nm處測定吸光度值，根據(jù)繪制的標準曲線計算TNF-α，IL-6和IL-1β含量。

1.11 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 敲減脊髓Peli1對正常大鼠機械痛覺過敏和熱痛覺過敏的影響

行為學檢測結(jié)果（圖2）顯示，正常大鼠shscr組和shPeli組鞘內(nèi)置管術后D4，D6，D8，D10和D12 MWT（圖2A）和TWL（圖2B）差異均無統(tǒng)計學意義。

Fig.2 Effect of spinal Peli1 knockdown on mechanical allodynia（A）and heat hyperalgesia（B）in normal rats.See Fig.1A for the rat treatment.MWT：mechanical with?drawal threshold in mechanical allodynia test；TWL：thermal withdrawal latency in heat hyperalgesia test.±s，n=6.

2.2 敲減脊髓Peli1對正常大鼠脊髓Peli1蛋白和mRNA表達水平的影響

Western印跡法（圖3A）和RT-PCR（圖3B）結(jié)果顯示，與shscr組相比，shPeli1組大鼠鞘內(nèi)置管后D12脊髓Peli1蛋白和mRNA表達均明顯下調(diào)（P<0.05）。

Fig.3 Effect of spinal Peli1 knockdown on protein and mRNA expression of Peli1 in spinal cords of normal rats by Western blotting（A）and RT-PCR（B）.See Fig.1A for the rat treatment.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s.n=3.＊P<0.05，compared with shscr group.

2.3 敲減脊髓Peli1對CINP模型大鼠機械痛覺過敏和熱痛覺過敏的影響

行為學檢測結(jié)果（圖4）顯示，對正常對照組、CINP組、CINP+shscr組、CINP+shPeli1組大鼠的行為學結(jié)果進行重復測量方差分析顯示，分組和檢測時間點存在交互效應（P<0.01）；鞘內(nèi)置管術后D8，D10和D12，與正常對照組相比，CINP組大鼠MWT和TWL均顯著降低（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠MWT和TWL明顯增加（P<0.05，P<0.01）。

Fig.4 Effect of spinal Peli1 knockdown on mechanical allodynia(A)and heat hyperalgesia(B)in CINP model rats.See Fig.1B for the rat treatment.±s,n=6.＊＊P<0.01,compared with normal control group;#P<0.05,##P<0.01,compared with CINP+shscr group.

2.4 敲減脊髓Peli1對CINP模型大鼠脊髓Peli1蛋白和mRNA表達的影響

Western印跡法和RT-PCR檢測結(jié)果（圖5）顯示，與正常對照組相比，CINP組大鼠脊髓Peli1蛋白和mRNA表達明顯上調(diào)（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓Peli1蛋白及mRNA表達明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。

Fig.5 Effect of spinal Peli1 knockdown on protein and mRNA expression of Peli1 in spinal cords of CINP model rats detected by Western blotting（A）and RT-PCR（B）.See Fig.1B for the rat treatment.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with CINP+shscr group.

2.5 敲減脊髓Peli1對CINP模型大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA的影響

Western印跡法、RT-PCR和免疫熒光化學法檢測結(jié)果（圖6）顯示，與正常對照組相比，CINP組大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA表達水平均明顯上調(diào)（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA表達水平均明顯下調(diào)（P<0.01）。

Fig.6 Effect of spinal Peli1 knockdown on protein and mRNA expression of Iba1 in spinal cords of CINP model rats detected by Western blotting（A），RT-PCR（B）and immunofluorescence chemistry（C）.See Fig.1B for the rat treatment.A2 and C2 were the semi-quantitative results of A1 and C1，respectively.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with normal control group；##P<0.01，compared with CINP+shscr group.

2.6 敲減脊髓Peli1對CINP模型大鼠脊髓GFAP蛋白和mRNA表達的影響

Western印跡法和RT-PCR檢測結(jié)果（圖7）顯示，各組大鼠脊髓GFAP蛋白及mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異。

Fig.7 Effect of spinal Peli1 knockdown on protein and mRNA expression of GFAP in spinal cords of CINP model rats detected by Western blotting（A）and RT-PCR（B）.See Fig.1B for the rat treatment.A2 was the semi-quantitative result of A1.±s，n=3.

2.7 敲減脊髓Peli1對CINP模型大鼠脊髓p38 MAPK，JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響

Western印跡法檢測結(jié)果（圖8）顯示，與正常對照組相比，CINP組大鼠脊髓p38 MAPK，JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯上調(diào)（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓p38 MAPK，JNK和ERK1/2蛋白磷酸化水平明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。

2.8 敲減脊髓Peli1對CINP模型大鼠脊髓TNF-α，IL-6和IL-1 β含量的影響

ELISA結(jié)果（圖9）顯示，與正常對照組相比，CINP組大鼠脊髓組織血漿中TNF-α，IL-6和IL-1β含量明顯上調(diào)（P<0.01）；與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓組織血漿中TNF-α，IL-6和IL-1β含量明顯下調(diào)（P<0.05，P<0.01）。

Fig.9 Effect of spinal Peli1 knockdown on contents of tumor necrosis factor α（TNF-α）（A），interleukin-6（IL-6）（B）and IL-1 β（C）in spinal cords of CINP model rats detected by ELISA.See Fig.1B for the rat treatment.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with CINP+shscr group.

3 討論

本研究采用文獻［20］方法構(gòu)建CINP大鼠模型，該模型具有可操作性強、易于模擬及與CINP臨床特征相似等優(yōu)點，已被廣泛應用于評價藥物有效性和安全性以及探討CINP發(fā)生發(fā)展機制的研究中。本研究于術后D4，D6，D8，D10和D12采用行為學方法評價機械痛覺過敏和熱痛覺過敏，結(jié)果顯示，D8 MWT和TWL均降低至≤70%基礎值并持續(xù)到本研究觀察結(jié)束（D12），提示CINP模型制備成功。

RNA干擾技術是近年來生命科學領域重大的發(fā)現(xiàn)之一，是指小分子雙鏈RNA特異性地降解同源mRNA或抑制其表達，從而抑制或關閉特定基因功能的現(xiàn)象，該技術為本研究闡明CINP機制提供可靠的靶向干預工具。本研究結(jié)果顯示，與shscr組相比，shPeli組大鼠鞘內(nèi)置管后D12，脊髓Peli1蛋白和mRNA表達均明顯下調(diào)，MWT和TWL無顯著差異，提示敲減正常大鼠脊髓Peli1并未誘發(fā)痛覺過敏。另外，與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓Peli1蛋白和mRNA表達明顯下調(diào)，MWT和TWL明顯降低，提示脊髓靶向敲減Peli1的RNA干擾技術有效可靠；脊髓Peli1基因在CINP發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

目前，CINP發(fā)生發(fā)展機制仍不清楚，現(xiàn)有藥物療效不佳且長期應用下不良反應明顯，令患者無法耐受。因此，亟需闡明CINP發(fā)生發(fā)展機制，為新的有效治療藥物的開發(fā)提供理論基礎。大量證據(jù)表明，膠質(zhì)細胞在CINP發(fā)生發(fā)展機制中發(fā)揮著關鍵作用［24］。我們及其他團隊研究表明，在長春新堿誘導CINP形成過程中，脊髓小膠質(zhì)細胞活化介導CINP大鼠機械痛覺過敏和熱痛覺過敏［25-26］。本研究結(jié)果表明，CINP模型組大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA表達水平均較正常對照組明顯上調(diào)，而GFAP蛋白和mRNA表達水平在各組間均無明顯差異。文獻報道，與疼痛密切相關的小膠質(zhì)細胞在CINP形成階段發(fā)揮作用，而星形膠質(zhì)細胞在CINP維持階段發(fā)揮作用［27-28］。本研究時間范圍（D4～D12）正處于CINP形成階段，提示與星形膠質(zhì)細胞相比，脊髓小膠質(zhì)細胞在CINP形成過程中可能發(fā)揮更為重要的作用。

脊髓小膠質(zhì)細胞活化介導神經(jīng)病理性痛的分子機制研究一直備受關注。目前已研究證實，CC類趨化因子配體 2［29］和集落刺激因子 1［30］等均可激活脊髓小膠質(zhì)細胞而導致神經(jīng)病理性痛，但是在CINP形成過程中，Peli1基因?qū)π∧z質(zhì)細胞活化的調(diào)控作用鮮有報道。王林等［16］研究表明，在慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎模型中，預先鞘內(nèi)注射shPeli1靶向敲減Peli1，小鼠脊髓小膠質(zhì)細胞活化標志物Iba1和星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP蛋白和mRNA表達于術后D7均明顯下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)置管后D12，與CINP+shscr組相比，CINP+shPeli1組大鼠脊髓Iba1蛋白和mRNA表達均明顯下調(diào)，而脊髓GFAP蛋白和mRNA表達無明顯差異，提示Peli1基因可作為脊髓小膠質(zhì)細胞活化的新分子機制。本研究與王林等［16］研究結(jié)果在脊髓GFAP表達方面存在差異，可能與2個實驗中采用的CINP模型、GFAP檢測時間點和使用的動物種屬不同有關，同時提示在化療藥物和坐骨神經(jīng)結(jié)扎導致的CINP中，Peli1基因的作用可能存在差異，即Peli1基因通過激活不同膠質(zhì)細胞發(fā)揮作用。

Peli1是一種E3泛素連接酶，可作為模式識別受體（patern recognition receptor）信號，調(diào)控先天免疫反應［31-32］。最近研究表明，Peli1通過激活Toll樣受體和T細胞受體促進炎癥細胞因子合成［13］。炎癥細胞因子在慢性疼痛中樞敏化過程中發(fā)揮重要作用［33-34］。神經(jīng)損傷后，膠質(zhì)細胞合成和釋放的炎癥細胞因子如TNF-α，IL-6和IL-1β，可與感覺神經(jīng)元表面受體結(jié)合，增加神經(jīng)元興奮性，誘發(fā)痛覺過敏［35-36］。Peli1通過激活小膠質(zhì)細胞促進嗎啡鎮(zhèn)痛耐受相關的痛覺過敏的發(fā)生發(fā)展過程，同時伴有炎癥細胞因子合成和釋放表達上調(diào)［17］。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射shPeli1靶向敲減Peli1后，CINP模型大鼠MWT和TWL明顯增加，脊髓TNF-α，IL-6和IL-1β含量明顯下調(diào)，提示Peli1可能通過炎癥細胞因子介導神經(jīng)元敏化，從而促進CINP的發(fā)生發(fā)展。

MAPK是一組能被不同的細胞外刺激（如細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞應激和細胞黏附等）激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，將外界信號經(jīng)細胞表面?zhèn)鬟f至細胞核內(nèi)部。有研究報道，在神經(jīng)損傷的情況下，脊髓背角MAPK信號通路包括ERK，p38和JNK被激活［37-39］。另一項研究表明，在小膠質(zhì)細胞內(nèi)，Peli1基因缺失抑制脂多糖誘導的MAPK信號的激活［13］。小膠質(zhì)細胞內(nèi)Peli家族成員Peli1通過髓系分化88依賴途徑參與MAPK激活，促進炎癥細胞因子的合成和釋放［14，40］。本研究結(jié)果顯示，鞘內(nèi)注射shPeli1靶向敲減Peli1，可使CINP模型大鼠脊髓p38 MAPK，JNK和ERK1/2磷酸化水平下調(diào)，脊髓TNF-α，IL-6和IL-1β含量明顯下調(diào)，提示Peli1可能通過MAPK信號通路調(diào)控炎癥細胞因子的合成和釋放，進而促進CINP的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，敲減脊髓Peli1可明顯抑制長春新堿誘導的CINP，其機制可能與抑制大鼠脊髓小膠質(zhì)細胞活化及MAPK信號通路介導的炎癥反應有關。