王東偉，劉海萍，王慶東，赫 赤，劉思洋，胡玉紅，陳 萍，臧榮佳

（佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.麻醉科，2.婦產(chǎn)科，黑龍江 佳木斯 154002）

異氟醚（isoflurane，Iso）是一種臨床常用的吸入性全身麻醉藥，其可誘導(dǎo)新生動物的大腦神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡，嚴重者可能影響腦功能［1］，且該影響可長期存在，導(dǎo)致神經(jīng)突觸數(shù)量減少甚至消失，引起永久腦損傷，可表現(xiàn)為新生大鼠發(fā)育成熟后行為功能障礙［2］。白樺脂酸（betulinic acid，BC）是五環(huán)羽扇烷型三萜化合物。Ma等［3］研究認為，BC能通過血紅素氧合酶1/核因子E2相關(guān)因子2/NF-κB信號通路抑制糖尿病模型小鼠的認知障礙。Jiao等［4］研究顯示，BC能抑制腦缺血缺氧誘發(fā)的小鼠海馬神經(jīng)損傷，具有神經(jīng)保護作用。本研究以發(fā)育期大鼠為研究對象，探討B(tài)C對Iso誘導(dǎo)的發(fā)育期神經(jīng)損傷的保護作用，為臨床尋找能夠有效減輕或消除Iso導(dǎo)致的發(fā)育期神經(jīng)損傷的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和主要儀器

Iso（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司，批號：20172831）；BC（中國科學(xué)院成都生物研究所，批號：18032423）；活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒和丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（上海亨代勞生物科技公司）；線粒體膜電位（mito?chondrial membrane potential，MMP）檢測試劑盒和Ca2+熒光探針檢測試劑盒（BestBios生物科技有限公司）；Annexin Ⅴ-Biotin，Annexin Ⅴ-FITC和Annexin Ⅴ-PE（美國BD公司）。Fabius麻醉機（德國Drager公司）；流式細胞儀（美國Beckman公司）；熒光酶標儀（芬蘭Thereto實驗儀器公司）；麻醉箱（上海玉研科學(xué)儀器公司）；MindrayT8監(jiān)護儀（深圳邁瑞公司）；Morris水迷宮實驗系統(tǒng)（美國National Instruments公司）；血氣分析儀（普朗公司）；分光光度計（V-1000，翔藝儀器上海有限公司）。

1.2 實驗動物、分組和樣本制備

7日齡SPF級SD大鼠80只，雌雄各半，體重17～20 g，佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SYXK（黑）2016-014。幼鼠在通風良好、室溫20～24℃和濕度50%～60%的環(huán)境飼養(yǎng)于清潔籠具中，12 h晝夜交替光照。自由進食、進水。

大鼠隨機分為4組：正常對照組、Iso組和Iso+BC 100和200 mg·kg-1組，每組20只，雌雄各半。除正常對照組外，其余各組大鼠置恒溫水槽上的麻醉箱內(nèi)吸入1.5% Iso 6 h進行全身麻醉［5］，麻醉箱內(nèi)溫度37～38℃。Iso麻醉前1 h，正常對照組和Iso組ip給予0.9%生理鹽水，Iso+BC組分別ip給予BC 100或200 mg·kg-1預(yù)處理。處置完畢后對大鼠進行血氣分析，然后每組隨機取10只大鼠立即處死，每只大鼠取部分海馬組織，剪碎后用胰蛋白酶消化，并用200目孔徑尼龍網(wǎng)過濾，450×g離心5 min，棄上清，加PBS重懸后反復(fù)柔和吹打，制備成1×108L-1的單細胞懸液，用于檢測細胞凋亡率、ROS、MMP和神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+濃度。取部分海馬組織剪碎，按質(zhì)量比1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水，用勻漿器制成勻漿，626×g，4℃離心15 min，取上清，-20℃保存用于檢測MDA含量。余下10只返回飼養(yǎng)籠中喂養(yǎng)至6周后進行Morris水迷宮實驗。

1.3 流式細胞術(shù)檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率

取1.2制備的大鼠海馬單細胞懸液，按照試劑盒說明操作，向細胞懸液中加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC標記抗體，室溫避光孵育20 min，再加入5 μL 0.1 g·L-1的PI細胞核染料混勻，室溫避光孵育10 min，用流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.4 DCFH-DA探針檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞ROS水平

按照試劑盒說明書進行操作，取1.2制備的大鼠海馬單細胞懸液，加DCFH-DA（終濃度10 μmol·L-1）37℃孵育30 min后，用PBS洗滌2次，用熒光酶標儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm）測讀，以相對熒光單位（relative fluorescence unit，RFU）反映細胞內(nèi)ROS水平。

1.5 硫代巴比妥酸縮合法檢測大鼠海馬組織MDA含量

按照試劑盒說明書進行操作，取1.2制備的海馬組織勻漿，加3 mL 20%三氯乙酸，再加入1 mL 0.67%硫代巴比妥酸，用旋渦混合器混勻30 s，95℃水浴40 min，取出后流水冷卻，800×g離心10 min，取上清液，用分光光度計在波長532 nm處測定吸光度值，以反映MDA含量。

1.6 Fluo-3/AM探針檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度

按照試劑盒說明書進行操作，取1.2制備的大鼠海馬單細胞懸液，加入Fluo-3/AM探針工作液，在37℃細胞培養(yǎng)箱中避光孵育20 min。加入5倍體積的含有1%胎牛血清的Hanks平衡鹽溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS），繼續(xù)孵育40 min。用HBSS洗滌細胞2～3次后重懸細胞，37℃細胞培養(yǎng)箱中孵育10 min，用熒光酶標儀（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長526 nm）測讀，以RFU反映細胞內(nèi)Ca2+濃度。

1.7 JC-1法檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞MMP

取1.2制備的大鼠海馬單細胞懸液，按照試劑盒操作說明加入 JC-1染色液 10 μmol·L-1，37℃孵育 30 min，626×g，4℃離心 3～4 min，棄上清，用JC-1染色液洗滌2次后重懸細胞，在熒光顯微鏡下觀察JC-1單體（激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，綠色）及JC-1聚合物（激發(fā)波長525 nm，發(fā)射波長590 nm，紅色）的熒光圖像。用熒光酶標儀檢測熒光強度值（fluorescence intensity，F(xiàn)I），用FI綠/FI紅表示MMP水平（△ψm）。

1.8 Morris水迷宮實驗檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力

經(jīng)1.2處理的另10只大鼠返回飼養(yǎng)籠中繼續(xù)飼養(yǎng)至6周后進行Morris水迷宮實驗［6］。Morris水迷宮模型由圓柱型水池和可移動位置的平臺2部分組成。水池高60 cm，直徑120 cm，平臺（直徑10 cm）淹沒固定在水池的4個象限之一。連續(xù)4 d，每天4次將大鼠從水池邊放入水中進行訓(xùn)練。觀察大鼠在水中找到平臺并爬上平臺的時間，記為逃避潛伏期。如果在120 s內(nèi)不能找到平臺，則人為將其引導(dǎo)到平臺，停留10 s，并將逃避潛伏期記為120 s；當大鼠自行到達平臺時，可被允許在上面休息30 s。記錄第4天4次訓(xùn)練的平均逃避潛伏期。第5天，去除平臺后進行空間探索實驗，記錄120 s內(nèi)大鼠穿過原平臺位置的次數(shù)和在原平臺象限的探索時間。實驗數(shù)據(jù)由計算機軟件自動記錄。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BC對Iso暴露大鼠血氣指標的影響

血氣分析結(jié)果（表1）顯示，與正常對照組比較，各組大鼠血液pH值、pO2和pCO2均無統(tǒng)計學(xué)差異。

Tab.1 Effect of betulinc acid(BC)on arterial blood gas indexes in isoflurane（Iso）exposure rats

2.2 BC對Iso暴露大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡的影響

Iso組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率顯著高于正常對照組（P<0.01），Iso+BC 100和200 mg·kg-1組海馬神經(jīng)細胞凋亡率低于Iso組（P<0.05），Iso+BC 200 mg·kg-1組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡率低于Iso+BC 100 mg·kg-1組（P<0.05）（圖1）。

Fig.1 Effect of BC on hippocampal neuron apoptosis of Iso exposure rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.＊＊P<0.01，compared with normal control group；＃P<0.05，compared with Iso group；△P<0.05，compared with Iso+BC 100 mg·kg-1group.

2.3 BC對Iso暴露大鼠海馬神經(jīng)細胞ROS水平和MDA含量的影響

Iso組大鼠海馬組織中MDA含量和海馬神經(jīng)細胞內(nèi)ROS的水平明顯高于正常對照組（P<0.01）；與Iso組相比，Iso+BC 100和200 mg·kg-1組大鼠海馬組織中MDA含量及海馬神經(jīng)細胞內(nèi)ROS水平明顯減少（P<0.05），且Iso+BC 200 mg·kg-1組對ROS的抑制作用強于Iso+BC 100 mg·kg-1組（P<0.05）（圖2）。

2.4 BC對Iso暴露大鼠海馬神經(jīng)細胞Ca2+濃度和MMP的影響

實驗結(jié)果如圖3所示，Iso組大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常對照組（P<0.01），Iso+BC 100和200 mg·kg-1組大鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)游離Ca2+濃度較Iso組減少（P<0.05），Iso+BC 200 mg·kg-1組低于Iso+BC 100 mg·kg-1組（P<0.05）（圖3A）。與正常對照組相比，Iso組大鼠海馬神經(jīng)細胞MMP明顯降低（P<0.05），Iso+BC 100和200 mg·kg-1組大鼠海馬神經(jīng)細胞MMP明顯高于Iso組（P<0.05），且Iso+BC 200 mg·kg-1組高于Iso+BC 100 mg·kg-1組（P<0.05）（圖3B）。

Fig.3 Effect of BC on Ca2+concentration（A）and mito?chondrial membrane potential（MMP，B） in hippo?campal neurons of Iso exposuer rats.See Tab.1 for the rat treatment.FI：fluorescence intensity.±s，n=10.＊＊P<0.01，compared with normal control group；＃P<0.05，compare with Iso group；△P<0.05，compared with Iso+BC 100 mg·kg-1group.

2.5 BC對Iso暴露大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

與正常對照組相比，Iso組大鼠訓(xùn)練第4天逃避潛伏期明顯延長（P<0.01），穿越平臺次數(shù)明顯減少（P<0.01），平臺探索時間明顯縮短（P<0.01）；與Iso組相比，Iso+BC 100和200 mg·kg-1組大鼠訓(xùn)練第4天逃避潛伏期均明顯縮短（P<0.05），穿越平臺次數(shù)明顯增加（P<0.05），平臺探索時間明顯延長（P<0.05）；Iso+BC 100 mg·kg-1組與Iso+BC 200 mg·kg-1組間上述指標未見明顯差異（圖4）。

Fig.4 Effect of BC on learning and memory behavior in Morris water maze test in Iso exposure rats.See Tab.1 for the rat treatment.±s，n=10.＊＊P<0.01，compared with normal control group；＃P<0.05，compared with Iso group.

3 討論

大量研究表明，Iso易導(dǎo)致神經(jīng)損傷或認知障礙［7］，但影響神經(jīng)系統(tǒng)的機制尚不明確。本研究結(jié)果顯示，Iso暴露可引起大鼠海馬組織中MDA和神經(jīng)細胞中ROS水平明顯升高，胞內(nèi)鈣超載和神經(jīng)細胞MMP明顯降低，進而促進大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡；而BC預(yù)處理能改善Iso暴露誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)細胞氧化損傷，穩(wěn)定MMP，進而減少大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡。Zhao等［8］報道，Iso可增加海馬神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2+濃度，誘導(dǎo)神經(jīng)毒性。細胞內(nèi)Ca2+升高是細胞損傷的較早期事件，Iso通過下調(diào)N-甲基-D-天冬氨酸受體或過度激活γ-氨基丁酸受體可能導(dǎo)致Ca2+過多進入，引起線粒體超載，線粒體膜電位去極化，胱天蛋白酶激活，導(dǎo)致神經(jīng)細胞凋亡［9］。研究表明，氧化應(yīng)激與腦神經(jīng)損傷密切相關(guān)［10］，過量的ROS可以引起細胞內(nèi)Bax/Bcl-2比例失調(diào)，激活胱天蛋白酶3，引起細胞凋亡［11］。Iso引起的細胞內(nèi)ROS蓄積是其產(chǎn)生神經(jīng)毒性的原因之一。

本研究應(yīng)用Morris水迷宮實驗檢測Iso暴露及BC干預(yù)對發(fā)育期大鼠遠期學(xué)習(xí)記憶能力的影響。據(jù)文獻報道，性激素水平影響大鼠水迷宮實驗反應(yīng)性和敏感性［12］。本研究選擇雌雄各半大鼠，以排除激素水平對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，Iso組大鼠潛伏期明顯延長，穿越平臺次數(shù)和平臺象限探索時間明顯減少，表明Iso暴露可損傷發(fā)育期大鼠遠期學(xué)習(xí)記憶能力，該結(jié)果與Jevtovic-Todorovic 等［13］和 Stratmann 等［14］的研究結(jié)果一致。本研究同時發(fā)現(xiàn)，Iso暴露前給予BC 100和200 mg·kg-1可使大鼠潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數(shù)明顯增多，表明BC對Iso暴露誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠神經(jīng)細胞毒性具有保護作用，能有效改善Iso暴露誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠空間記憶功能障礙。

本研究結(jié)果表明，BC在受試劑量下對Iso暴露誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠神經(jīng)細胞毒性有保護作用，但其在其他給藥時間、給藥途徑及劑量下的作用有待進一步系統(tǒng)研究。

綜上所述，BC對Iso誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)細胞損傷具有保護作用，表現(xiàn)為BC預(yù)處理能夠抑制Iso暴露誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡和氧化損傷，并能夠改善Iso暴露誘導(dǎo)的發(fā)育期大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙。