瞿敏敏，陳 佳，郭 磊，徐 華，謝劍煒

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100850）

DNA是最重要的生命遺傳物質(zhì)之一，保持DNA的完整性和穩(wěn)定性對(duì)于生物體的正常生長(zhǎng)發(fā)育和機(jī)體功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)至關(guān)重要。然而，DNA會(huì)受到外源性和內(nèi)源性諸多因素的影響和干擾［1］，進(jìn)而造成不同程度損傷，如食品污染物、環(huán)境污染物、藥品雜質(zhì)、紫外線、電離輻射乃至正常代謝產(chǎn)生的活性氧等，均會(huì)對(duì)DNA造成損傷［2-3］。其中，DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSB）是一種最嚴(yán)重的DNA損傷形式，如未能及時(shí)修復(fù)，將可能導(dǎo)致疾病甚至誘發(fā)癌癥［4］。因此，DNA損傷的檢測(cè)對(duì)于基因組穩(wěn)定性的監(jiān)測(cè)以及及早發(fā)現(xiàn)并預(yù)防重大疾病具有重要意義。1998年，Rogakou等［5］首次報(bào)道，磷酸化組蛋白H2AX（γ-H2AX）是一種表征DNA損傷尤其是DSB的特異性生物標(biāo)志物，且其形成的焦點(diǎn)數(shù)與DSB數(shù)量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，旨在檢測(cè)γ-H2AX的試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱γ-H2AX試驗(yàn)）被應(yīng)用于眾多與DNA損傷相關(guān)的基礎(chǔ)研究和醫(yī)學(xué)診斷中。目前，γ-H2AX試驗(yàn)已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)、輻射生物劑量學(xué)、藥物研發(fā)和療效評(píng)估等研究領(lǐng)域，尤其在對(duì)化合物基因毒性的體外初步篩選方面，顯示出極大的應(yīng)用潛力［6］。本文系統(tǒng)綜述近年來(lái)γ-H2AX試驗(yàn)在基因毒性測(cè)試中的研究進(jìn)展，并展望其在基因毒性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中的應(yīng)用前景。

1 γ-H2AX的生成及生物學(xué)意義

1.1 H2AX和 γ-H2AX

組蛋白是真核細(xì)胞特有的一類(lèi)堿性蛋白質(zhì)，在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的組成和基因功能調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。通常由核心組蛋白H2A，H2B，H3和H4各2個(gè)分子組成1個(gè)組蛋白八聚體，其被147 bp的DNA包裹形成染色質(zhì)的基本組成單位——核小體，而H1作為連接組蛋白，起到穩(wěn)定核小體間DNA的作用［7］。H2A蛋白家族具有多樣的變體，包括H2A1、H2A2、H2AX、H2AZ和其他變體［8-9］。在人類(lèi)細(xì)胞中，H2AX占H2A含量的2%～10%［5］，分子質(zhì)量為14 ku，其編碼基因位于11號(hào)染色體的q23.2～q23.3，共編碼142個(gè)氨基酸。H2AX多肽鏈N端的120個(gè)殘基與H2A1的該段氨基酸序列幾乎完全一致，而C端的22個(gè)殘基序列與目前已知的脊椎動(dòng)物H2A家族其他蛋白序列無(wú)同源性。C端序列在進(jìn)化上高度保守，包括1個(gè)含139位絲氨酸（Ser-139）的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸（Ser-Gln-Glu，SQE）結(jié)構(gòu)域（圖1）。SQE結(jié)構(gòu)域在不同種屬生物體中高度保守［10-11］，該進(jìn)化保守性提示H2AX的C端序列可能具有重要的生物學(xué)功能。

圖1 組蛋白H2AX多肽鏈C端高度保守的絲氨酸-谷氨酰胺-谷氨酸結(jié)構(gòu)域.Y：酪氨酸；E：谷氨酸；Q：谷氨酰胺；S：絲氨酸；A：丙氨酸.

1998年，Bonner團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，電離輻射誘導(dǎo)DSB數(shù)分鐘后，細(xì)胞內(nèi)H2AX蛋白的Ser-139位點(diǎn)可被毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)突變基因（ataxia telangiectasia mutated gene，ATM）、ATM與Rad3相關(guān)蛋白（ATM and Rad3-related protein，ATR）及DNA依賴蛋白激酶催化亞基（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs）快速磷酸化，生成γ-H2AX［5］。γ-H2AX聚集在DSB處，形成γ-H2AX焦點(diǎn)。研究表明，γ-H2AX焦點(diǎn)在DSB發(fā)生數(shù)分鐘內(nèi)即可形成，且在30 min內(nèi)達(dá)到峰值；隨后γ-H2AX會(huì)隨著DSB的修復(fù)而逐漸去磷酸化或被正常的H2AX取代，其半衰期約為2～7 h［12］。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，每產(chǎn)生1個(gè)DSB可導(dǎo)致γ-H2AX擴(kuò)散到2 Mb染色質(zhì)上，包括近2000個(gè)γ-H2AX分子［11］。

1.2 γ-H2AX的生物學(xué)意義

外源性因素如輻射［13］、熱效應(yīng)［14］、滲透壓改變［15］和化學(xué)暴露物［16］，內(nèi)源性因素如細(xì)胞凋亡［17］、衰老［18］和有絲分裂［19］，均可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX形成。一旦內(nèi)外源性因素誘導(dǎo)DSB形成，細(xì)胞即刻激活DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）機(jī)制，于DSB處募集大量信號(hào)分子和修復(fù)蛋白，對(duì)損傷的DNA進(jìn)行修復(fù)，以維持基因組的完整性和細(xì)胞的正常功能［20］。其中，γ-H2AX焦點(diǎn)的形成是DSB發(fā)生后早期被招募的蛋白復(fù)合體之一，并為其他修復(fù)蛋白提供結(jié)合位點(diǎn)。ATM，ATR和DNA-PKcs均可催化H2AX的磷酸化，ATR被認(rèn)為是單鏈損傷及復(fù)制損傷誘導(dǎo)形成γ-H2AX的主要磷酸化激酶［21］，DNAPKcs則介導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中H2AX的磷酸化［22］。

DSB誘導(dǎo)H2AX的磷酸化主要通過(guò)ATM激酶介導(dǎo)。細(xì)胞感應(yīng)DNA損傷后，ATM發(fā)生自動(dòng)磷酸化而激活，三聚復(fù)合物Mre11-Rad50-Nbs1（MRN）首先識(shí)別DNA損傷，隨后募集活化的ATM到損傷位點(diǎn)，使ATM靶向下游底物，如H2AX蛋白、p53結(jié)合蛋白1（p53-binding protein 1，53BP1）和DNA損傷檢控點(diǎn)介體1（mediator of DNA damage check?point 1，MDC1），磷酸化細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）和CHK2，激活周期檢查點(diǎn)，H2AX蛋白的Ser-139磷酸化作為DNA損傷起始信號(hào)，招募細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和修復(fù)蛋白至損傷位點(diǎn)，與γ-H2AX結(jié)合形成焦點(diǎn)（圖2）。MDC1蛋白通過(guò)與γ-H2AX結(jié)合，錨定ATM以募集更多活化的ATM，進(jìn)一步放大H2AX磷酸化信號(hào)。Nijmegen斷裂綜合征蛋白1（Nijmegen breakage syndrome protein 1，NBS1）與γ-H2AX結(jié)合促使越來(lái)越多的DDR蛋白包括53BP1和MRN復(fù)合物聚集在DNA損傷位點(diǎn)，即γ-H2AX作為錨點(diǎn)募集DDR中介物以及更多修復(fù)蛋白到損傷位點(diǎn)，釋放生物信號(hào)并引導(dǎo)修復(fù)蛋白對(duì)DNA進(jìn)行修復(fù)［23-25］。因此，γ-H2AX被認(rèn)為是可同時(shí)表征DNA損傷和修復(fù)的生物標(biāo)志物。

圖2 磷酸化組蛋白H2AX形成過(guò)程［22］及主要檢測(cè)技術(shù).WB：Western印跡法；IF：免疫熒光顯微技術(shù)；ELISA：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；FCM：流式細(xì)胞術(shù)；HCA：高內(nèi)涵分析技術(shù)；LC-MS/MS：高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；S：組蛋白H2AX的139位絲氨酸；P：組蛋白H2AX的139位絲氨酸發(fā)生磷酸化；DSB：DNA雙鏈斷裂；MRN：三聚復(fù)合物Mre11-Rad50-Nbs1；ATM：毛細(xì)血管共濟(jì)失調(diào)突變基因；53BP1：P53結(jié)合蛋白1；BRCA1：乳腺癌1號(hào)基因蛋白；MDC1：DNA損傷檢控點(diǎn)介體1.

2 γ-H2AX試驗(yàn)在體外基因毒性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

基因毒性物質(zhì)是指能直接或間接損傷細(xì)胞DNA而導(dǎo)致基因突變或體內(nèi)誘變的物質(zhì)，具有誘發(fā)癌癥的潛在威脅［26-27］。因此，建立基因毒性物質(zhì)的通量篩查測(cè)試方法是安全性評(píng)估的重要組成部分。傳統(tǒng)的基因毒性評(píng)價(jià)方法依賴動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，費(fèi)用高，周期長(zhǎng)，種屬差異大［28］。隨著21世紀(jì)“3R”原則與毒性測(cè)試替代策略的提出，細(xì)菌回復(fù)突變（Ames）試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)、小鼠淋巴瘤細(xì)胞tk基因突變?cè)囼?yàn)和體外微核（micronucleus，MN）試驗(yàn)已被較好的發(fā)展并應(yīng)用，但一定程度上均存在特異性低的缺陷［29］。

近年來(lái)，為實(shí)現(xiàn)基因毒性物質(zhì)的快速通量篩查，研究者提出了從基因損傷共性效應(yīng)靶分子入手。如DNA損傷和修復(fù)的生物標(biāo)志物γ-H2AX，作為一種早期敏感的基因毒性生物標(biāo)志物，可由多種類(lèi)型的DNA損傷（DSB、DNA加合物、DNA單鏈斷裂、DNA氧化和烷基化）誘導(dǎo)產(chǎn)生。也有研究者提出，可將γ-H2AX作為篩選基因毒性的生物標(biāo)志物并應(yīng)用于監(jiān)管評(píng)估中［6］。在此推動(dòng)下，目前國(guó)內(nèi)外已發(fā)展多種技術(shù)（圖2），通過(guò)檢測(cè)γ-H2AX對(duì)累計(jì)200余種化學(xué)物質(zhì)的基因毒性開(kāi)展了測(cè)試（表1）。

表1 不同檢測(cè)技術(shù)在 γ-H2AX體外基因毒性研究中的應(yīng)用

2.1 雙向凝膠電泳技術(shù)

雙向凝膠電泳是分離和定量組蛋白混合物的基本方法之一。最初，Rogakou等［5］應(yīng)用二維凝膠電泳技術(shù)檢測(cè)暴露于電離輻射后CHO細(xì)胞、SF268細(xì)胞和DBA/2小鼠形成的γ-H2AX焦點(diǎn)。結(jié)果表明，γ-H2AX在DNA損傷后約10 min即可被該技術(shù)檢測(cè)。該技術(shù)雖是發(fā)現(xiàn)γ-H2AX的主要技術(shù)，但所需樣本量較大，過(guò)程繁瑣耗時(shí)，且無(wú)法實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。

2.2 免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)是基于抗原抗體反應(yīng)的特異性和靈敏性、以熒光素及酶等對(duì)抗原或抗體加以標(biāo)記，經(jīng)過(guò)化學(xué)呈色反應(yīng)后，用顯微鏡或電子顯微鏡觀察，對(duì)靶蛋白進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。由于其靈敏度高、特異性強(qiáng)且應(yīng)用范圍廣，可對(duì)靶蛋白進(jìn)行定位、定性和定量。因此，目前γ-H2AX試驗(yàn)主要是基于該技術(shù)。

2.2.1 細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

Western印跡法是在凝膠電泳技術(shù)和固相免疫技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)通過(guò)特異性抗γ-H2AX抗體對(duì)經(jīng)凝膠電泳等步驟處理過(guò)的生物樣品著色，分析著色的位置和深度，對(duì)目標(biāo)蛋白γ-H2AX進(jìn)行定性和半定量分析。Western印跡法結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定可靠，但其操作過(guò)程繁瑣，不利于大規(guī)模的篩選分析。隨著現(xiàn)代儀器的發(fā)展，Khoury 等［30］于 2013 年建立了一種基于Western印跡法改進(jìn)的γ-H2AX試驗(yàn)，命名為細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)（in cell Western，ICW），并首次用歐洲替代方法驗(yàn)證中心（European Center for Validation of Alternative Methods，ECVAM）推薦的包括基因毒性和非基因毒性在內(nèi)的61個(gè)化合物在HepG2細(xì)胞中對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，ICW技術(shù)檢測(cè)γ-H2AX焦點(diǎn)水平的特異性達(dá)90%，靈敏度為75%。之后，為了驗(yàn)證ICW技術(shù)，該課題組在多種細(xì)胞中評(píng)估了不同化合物的基因毒性［31-35］，結(jié)果表明，基于ICW技術(shù)的γ-H2AX實(shí)驗(yàn)可準(zhǔn)確評(píng)估化合物的基因毒性。

2.2.2 免疫熒光顯微技術(shù)

免疫熒光顯微技術(shù)是首先利用特異性抗體對(duì)目標(biāo)γ-H2AX進(jìn)行識(shí)別，隨后利用標(biāo)記熒光基團(tuán)或加入偶聯(lián)有熒光基團(tuán)的二抗進(jìn)行信號(hào)放大，通過(guò)熒光顯微鏡分析熒光信號(hào)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)形成的γ-H2AX焦點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)，以確定γ-H2AX分布和含量。2006年，Zhou等［36］利用免疫熒光顯微技術(shù)首次分析了2個(gè)具直接作用的基因毒性化合物甲磺酸甲酯與N-亞硝基-N-乙基脲及2個(gè)具間接作用的基因毒性化合物苯并芘與2-乙酰氨基芴作用于人羊膜FL細(xì)胞和中國(guó)倉(cāng)鼠CHL細(xì)胞后的γ-H2AX焦點(diǎn)水平變化，認(rèn)為γ-H2AX焦點(diǎn)是評(píng)判基因毒性的理想指標(biāo)，其結(jié)果與彗星試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

2.2.3 全細(xì)胞酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cell enzymelinked immunosorbent assay，Cell-ELISA）

Cell-ELISA檢測(cè)γ-H2AX焦點(diǎn)的方法通常是利用抗γ-H2AX的單抗與經(jīng)甲醇固定后的細(xì)胞培養(yǎng)物共孵育，再經(jīng)酶標(biāo)二抗識(shí)別，隨后酶催化特異性底物產(chǎn)生一定量的顯色產(chǎn)物，通過(guò)分析顏色信號(hào)實(shí)現(xiàn)γ-H2AX的定性或半定量。該技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)是操作方便簡(jiǎn)單、快速和高通量［37-38］。Matsuzaki等［37］分別應(yīng)用Cell-ELISA和免疫熒光顯微技術(shù)，在CHL，CHO和V79細(xì)胞中評(píng)價(jià)了6個(gè)非整倍體誘導(dǎo)劑、8個(gè)染色體斷裂劑和10個(gè)非基因毒性化合物。結(jié)果表明，非整倍體誘導(dǎo)劑和非遺傳毒性化合物的試驗(yàn)結(jié)果均呈陰性，而染色體斷裂劑中除5-氟尿嘧啶在CHO細(xì)胞中的試驗(yàn)結(jié)果為陰性外，其余均為陽(yáng)性。

2.2.4 流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是將經(jīng)過(guò)免疫熒光標(biāo)記的細(xì)胞使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選檢測(cè)，得出單個(gè)細(xì)胞核中γ-H2AX的熒光強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞總熒光強(qiáng)度的百分比，進(jìn)而得到定量結(jié)果。該技術(shù)不僅可快速定量多細(xì)胞群中的γ-H2AX，而且可同時(shí)定量分析細(xì)胞毒性和細(xì)胞周期分布［39-52］。Smart等［41］通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX以評(píng)估作用機(jī)制不同的基因毒性化合物和非基因毒性化合物。結(jié)果表明，其對(duì)Ames試驗(yàn)的特異性達(dá)到67%，預(yù)測(cè)靈敏度高達(dá)100%；對(duì)體外哺乳動(dòng)物基因毒性試驗(yàn)的特異性和靈敏度分別為89%和91%。Tsamou等［44］將HepG2細(xì)胞暴露于ECVAM推薦的基因毒性化合物和非基因毒性化合物，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行γ-H2AX檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其特異性為78%，靈敏度為54%，將γ-H2AX試驗(yàn)與其他試驗(yàn)如染色體畸變?cè)囼?yàn)或小鼠淋巴瘤細(xì)胞突變?cè)囼?yàn)等組合后則可顯著提高測(cè)試的準(zhǔn)確度。

2.2.5 高內(nèi)涵分析（high content analysis，HCA）技術(shù)

HCA是一種新發(fā)展的自動(dòng)化熒光顯微成像技術(shù)，其作為一種化合物毒性通量檢測(cè)的新方法，能在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)上，利用多種熒光標(biāo)記物標(biāo)記細(xì)胞，自動(dòng)化地檢測(cè)樣品對(duì)細(xì)胞的生理狀態(tài)和屬性等影響。該技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確及通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，且可自動(dòng)化處理分析大批量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［53-55］。Garcia-Canton等［53］在人支氣管上皮細(xì)胞系BEAS-2B中采用HCA技術(shù)評(píng)價(jià)了ECVAM推薦的包括基因毒性和非基因毒性化合物在內(nèi)的22個(gè)化合物，發(fā)現(xiàn)基于γ-H2AX的體外基因毒性試驗(yàn)的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確度分別達(dá)88%，92%和86%。Ando等［54］用19個(gè)基因毒性化合物和7個(gè)非基因毒性化合物作用于HepG2細(xì)胞，利用HCA技術(shù)檢測(cè)γ-H2AX的形成。結(jié)果顯示，基于HCA的體外γ-H2AX試驗(yàn)的靈敏度達(dá)到100%。最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，采用代謝能力強(qiáng)的HepaRG細(xì)胞進(jìn)行γ-H2AX的HCA，證明黃曲霉毒素B1、苯并芘、7，12-二甲基苯并蒽、氟蟲(chóng)腈和硫丹的基因毒性，并驗(yàn)證了γ-H2AX試驗(yàn)應(yīng)用于基因毒性篩查的適用性［31］。

2.3 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high liquid chroma?tography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)

近20年來(lái)，隨著生物質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，逐漸利用LC-MS/MS技術(shù)解析組蛋白的變化［56-57］。Matsuda等［57］采用LC-MS/MS技術(shù)，對(duì)γ-H2AX磷酸化位點(diǎn)即包含Ser-139的特定肽段ATQAp?SQEY進(jìn)行定量檢測(cè)，并同時(shí)對(duì)H2AX肽段ATQA?SQEY進(jìn)行檢測(cè)，創(chuàng)建了一種可絕對(duì)定量分析細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的LC-MS/MS方法。

本課題組近期亦建立了γ-H2AX質(zhì)譜定量檢測(cè)技術(shù)，在HepG2細(xì)胞中評(píng)估了ECVAM推薦的包括基因毒性化合物和非基因毒性化合物在內(nèi)的69個(gè)化合物。結(jié)果表明，基于質(zhì)譜技術(shù)的γ-H2AX試驗(yàn)特異性、靈敏度和準(zhǔn)確度分別達(dá)到100%，88%和96%?；谫|(zhì)譜定量監(jiān)測(cè)進(jìn)一步獲得DNA損傷及修復(fù)動(dòng)力學(xué)曲線，初步揭示修復(fù)速率與基因毒性化合物的致癌性水平密切相關(guān)，致癌性強(qiáng)的化合物通常呈現(xiàn)需較長(zhǎng)的修復(fù)時(shí)間；通過(guò)構(gòu)建數(shù)學(xué)模型計(jì)算關(guān)鍵動(dòng)力學(xué)參數(shù)，可應(yīng)用于基因毒性化合物的測(cè)試及其致癌性的預(yù)測(cè)評(píng)估［56］。目前對(duì)該方法的應(yīng)用加以拓展，證實(shí)可初步應(yīng)用于藥品中基因毒性雜質(zhì)的篩查鑒定，將藥品簡(jiǎn)單用水溶解后直接暴露細(xì)胞，藥物成分和賦形劑均不干擾測(cè)定，具有簡(jiǎn)便、靈敏度高及準(zhǔn)確度好的特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)藥品中基因毒性雜質(zhì)的快速通量篩查［58］。

3 γ-H2AX試驗(yàn)與其他基因毒性試驗(yàn)的性能對(duì)比

Westerink等［59］基于體外MN試驗(yàn)在HepG2細(xì)胞中評(píng)估了ECVAM推薦的化合物，并比較了MN試驗(yàn)和γ-H2AX試驗(yàn)的敏感性和特異性。結(jié)果顯示，γ-H2AX試驗(yàn)在檢測(cè)基因毒性化合物方面更具優(yōu)勢(shì)，如可避免假陰性結(jié)果等。Khoury等［30］也表明，通過(guò)MN試驗(yàn)，N-亞硝基-N-乙基脲、2-乙酰氨基芴、氯化鎘、對(duì)苯二酚和齊多夫定均未被檢測(cè)出基因毒性特點(diǎn)，但在γ-H2AX實(shí)驗(yàn)中這些化學(xué)物質(zhì)均呈現(xiàn)正確的陽(yáng)性結(jié)果。

最近，Kim等［60］使用彗星試驗(yàn)和γ-H2AX試驗(yàn)在HepG2細(xì)胞系中檢測(cè)了甲磺酸乙酯、N-亞硝基-N-乙基脲、紫外線照射與苯并［a］芘-7，8-二醇-9，10-環(huán)氧化合物的DNA損傷效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)低濃度的甲磺酸乙酯和N-亞硝基-N-乙基脲誘導(dǎo)γ-H2AX焦點(diǎn)生成呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，其靈敏度比彗星試驗(yàn)高10倍。同樣，Nikolova等［16］報(bào)道，相比于彗星試驗(yàn)，γ-H2AX試驗(yàn)?zāi)芨煽?、更靈敏及更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)基因毒性化合物。Dertinger等［52］亦報(bào)道，γ-H2AX試驗(yàn)和MN試驗(yàn)檢測(cè)致染色體斷裂化合物的結(jié)果呈現(xiàn)一致性。

4 體外 γ-H2AX試驗(yàn)注意事項(xiàng)

盡管γ-H2AX試驗(yàn)展現(xiàn)出良好的體外基因毒性評(píng)價(jià)前景，但在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中仍存在一些值得關(guān)注的問(wèn)題。

4.1 細(xì)胞模型的選擇

在γ-H2AX試驗(yàn)中，細(xì)胞模型對(duì)結(jié)果的敏感性影響很大。通常，人源細(xì)胞比目前體外毒理試驗(yàn)中廣泛使用的嚙齒類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞更接近人體對(duì)藥物的代謝規(guī)律，因此更適合于γ-H2AX試驗(yàn)。如HepG2細(xì)胞，自身存在多種藥物代謝酶，使用該細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)無(wú)需再加入體外代謝活化系統(tǒng)，可簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟并降低試驗(yàn)成本［32］。本課題組近期研究亦發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞對(duì)于基因毒性化合物及基因毒性雜質(zhì)的毒性測(cè)試是一種理想的細(xì)胞模型［56，58］。但有研究者認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞DNA的損傷修復(fù)機(jī)制和細(xì)胞周期調(diào)控功能均發(fā)生了異常變化，而γ-H2AX參與細(xì)胞DNA損傷應(yīng)答和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，因此正常細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞更可靠［36］。

4.2 避免細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的 γ-H2AX假陽(yáng)性

細(xì)胞凋亡等內(nèi)源性因素也可誘導(dǎo)γ-H2AX的形成，細(xì)胞毒性是γ-H2AX試驗(yàn)的干擾因素之一［61］。Tsamou等［44］發(fā)現(xiàn)，非整倍體化合物在細(xì)胞毒性較高時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而產(chǎn)生凋亡型的γ-H2AX焦點(diǎn)，而致染色體斷裂劑則誘導(dǎo)細(xì)胞形成DNA損傷型的γ-H2AX焦點(diǎn)。因此，建議試驗(yàn)時(shí)需要預(yù)先對(duì)化合物進(jìn)行細(xì)胞增殖試驗(yàn)評(píng)價(jià)，從而選擇不超過(guò)50%抑制濃度的化合物濃度，降低凋亡型γ-H2AX焦點(diǎn)的形成［30，62］，以避免出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。另一方面，越來(lái)越多的研究表明，H2AX磷酸化是指征DNA早期損傷的重要指標(biāo)，在DNA損傷早期時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)γ-H2AX，可更好地避免由細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的γ-H2AX假陽(yáng)性結(jié)果［52］。

5 體內(nèi) γ-H2AX試驗(yàn)的應(yīng)用研究

大量研究表明，γ-H2AX在不同細(xì)胞系中均有表達(dá)［63］，但γ-H2AX用于基因毒性評(píng)估的體內(nèi)試驗(yàn)研究尚未廣泛開(kāi)展。Guerard等［64］評(píng)估了致癌物4-氯-鄰甲苯胺在不同雄性大鼠組織中的基因毒性。大鼠肝組織γ-H2AX免疫組化結(jié)果顯示，組織中可觀察到γ-H2AX陽(yáng)性的細(xì)胞核。Matsuda等［65］以LC-MS/MS技術(shù)定量分析小鼠體內(nèi)γ-H2AX，發(fā)現(xiàn)睪丸中γ-H2AX水平最高（占總H2AX的2.3%），其次為骨髓（0.51%）、胃（0.28%）、腎（0.20%）、脾（0.20%）、肝（0.15%）和肺（0.10%）。他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠分別ip給予致癌物絲裂霉素C和甲磺酸乙酯后，不同臟器中的γ-H2AX水平波動(dòng)存在差異，其中骨髓、胃、腎、脾、肝和肺中γ-H2AX水平隨時(shí)間發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，而睪丸中γ-H2AX水平未改變，揭示通過(guò)監(jiān)測(cè)致癌物誘導(dǎo)的體內(nèi)γ-H2AX水平變化，可檢測(cè)致癌物在不同器官中的基因毒性。但目前關(guān)于γ-H2AX的體內(nèi)試驗(yàn)研究仍較少，若將其作為現(xiàn)有體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)的補(bǔ)充，則需采用更多種具不同基因毒作用模式的化學(xué)品進(jìn)行研究，以明確其作為體內(nèi)標(biāo)志物評(píng)價(jià)基因毒性的可行性。

6 γ-H2AX與其他毒性終點(diǎn)標(biāo)志物的互補(bǔ)

隨著對(duì)化合物基因毒性理解的深入，研究者對(duì)基因毒性測(cè)試方法提出了更高的要求。如由于具不同基因毒性作用模式的化合物的致癌性存在顯著差異［66］，因此在候選藥物的前期篩選過(guò)程中將會(huì)被賦予不同的去留命運(yùn)，具染色體毒性的化合物會(huì)被直接淘汰，而僅具紡錘體毒性的化合物則可被留下參與后續(xù)的非臨床研究。近期Motoyama等［67］撰文評(píng)述，應(yīng)開(kāi)發(fā)能提供基因毒性作用機(jī)制信息的評(píng)價(jià)方法，區(qū)分判斷2種主要的基因毒性，即染色體毒性〔導(dǎo)致點(diǎn)突變和（或）結(jié)構(gòu)性染色體突變的DNA損傷〕或紡錘體毒性（染色體數(shù)量增加或減少）。目前研究表明，將γ-H2AX和其他效應(yīng)標(biāo)志物相結(jié)合，將提供一種可行的區(qū)分不同基因毒性作用模式的化合物方法。

6.1 γ-H2AX與p-H3組合

在有絲分裂過(guò)程中，組蛋白H3的10位絲氨酸（Ser-10）經(jīng)Aurora激酶作用而發(fā)生磷酸化，以促使染色質(zhì)凝集和染色體分離。眾多研究已證實(shí)，組蛋白H3的Ser-10磷酸化（p-H3）是細(xì)胞有絲分裂的生物標(biāo)志物。非整倍體誘導(dǎo)劑導(dǎo)致細(xì)胞有絲分裂延遲，使組蛋白H3的Ser-10發(fā)生顯著磷酸化，p-H3可作為指征非整倍體誘導(dǎo)劑的生物標(biāo)志物［66］。Khoury等［33］在HepG2，LS174T和ACHN 3種細(xì)胞中評(píng)價(jià)了10種非整倍體誘導(dǎo)劑、5種染色體斷裂劑和5種細(xì)胞毒性化合物，采用ICW技術(shù)，基于γ-H2AX和p-H3生物標(biāo)志物的組合，有效區(qū)分作用模式不同的基因毒性化合物。

本課題組前期通過(guò)LC-MS/MS技術(shù)對(duì)γ-H2AX的磷酸化位點(diǎn)即Ser-139的靶肽段及p-H3的磷酸化位點(diǎn)即Ser-10的靶肽段進(jìn)行定量檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)對(duì)γ-H2AX/H2AX和p-H3/H3的同時(shí)定量監(jiān)測(cè)。進(jìn)一步以HepG2和HeLa細(xì)胞為模型，評(píng)價(jià)了7個(gè)染色體斷裂劑、7個(gè)非整倍體誘導(dǎo)劑、2個(gè)細(xì)胞毒性化合物和3個(gè)非基因毒性化合物。結(jié)果表明，基于質(zhì)譜技術(shù)的γ-H2AX和p-H3測(cè)定方法，不僅能靈敏區(qū)分并準(zhǔn)確定量具不同基因毒作用模式的化合物，還能動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)基因毒性化合物對(duì)DNA的損傷、修復(fù)和轉(zhuǎn)錄過(guò)程［56］。

6.2 γ-H2AX與其他生物標(biāo)志物組合

為進(jìn)一步區(qū)分致染色體斷裂化合物的作用模式，Kopp等［68］以9種作用機(jī)制不同的致染色體斷裂化合物處理HepG2細(xì)胞，同時(shí)分析γ-H2AX、p-H3和其他6種參與DNA損傷信號(hào)通路的生物標(biāo)志物。多參數(shù)分析表明，所選的8個(gè)生物標(biāo)志物無(wú)法精確分類(lèi)致染色體斷裂化合物作用模式，但γ-H2AX和磷酸化P53蛋白存在相關(guān)性，結(jié)合磷酸化P53蛋白的定量可提高基因毒性的篩查效率。

最近，Wilde等［69］提出，基于蛋白質(zhì)翻譯后修飾可對(duì)不同藥物的作用模式加以區(qū)分。該研究以96孔微孔板培養(yǎng)TK6細(xì)胞，采用不同藥物處理細(xì)胞后，應(yīng)用自動(dòng)化細(xì)胞成像技術(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，基因毒性藥物和非基因毒性藥物在TK6細(xì)胞中誘導(dǎo)不同的生物標(biāo)志物反應(yīng)，其中磷酸化的53BP1蛋白與誘導(dǎo)DSB的藥物呈現(xiàn)相關(guān)性，乙酰化的P53蛋白則能區(qū)分被評(píng)價(jià)藥物的基因毒性和非基因毒性。

因此，γ-H2AX與其他生物標(biāo)志物的組合策略可在檢測(cè)基因毒性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基因毒性作用模式的評(píng)價(jià)區(qū)分。

7 結(jié)語(yǔ)

γ-H2AX作為同時(shí)表征DNA損傷修復(fù)的生物標(biāo)志物，可作為指示基因毒性的特異性效應(yīng)指標(biāo)。已經(jīng)建立了多種體外分析檢測(cè)細(xì)胞和組織內(nèi)的γ-H2AX的技術(shù)用于化合物體外基因毒性評(píng)價(jià)，其中免疫化學(xué)檢測(cè)技術(shù)較為常用，相比免疫化學(xué)技術(shù)，質(zhì)譜是新興發(fā)展的一種可絕對(duì)定量檢測(cè)γ-H2AX的技術(shù)，但其在通用性上還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。由于不同細(xì)胞模型和細(xì)胞凋亡等其它因素的干擾，γ-H2AX試驗(yàn)在體外基因毒性評(píng)價(jià)中仍存在一些限制。另一方面，目前關(guān)于γ-H2AX體內(nèi)試驗(yàn)研究剛起步，有待采用更多的代表性化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)以深入探討?？傊?，γ-H2AX試驗(yàn)作為一項(xiàng)新的可以準(zhǔn)確檢測(cè)DNA損傷的試驗(yàn)，可應(yīng)用于基因毒性的體外高通量篩選評(píng)價(jià)；同時(shí)，γ-H2AX與p-H3等其他生物標(biāo)志物的組合檢測(cè)可進(jìn)一步提供一種快速有效區(qū)分化合物基因毒性作用模式的方法。但目前γ-H2AX檢測(cè)方法多樣，尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟，制約了其標(biāo)準(zhǔn)化推廣，因此采用更多的化合物以進(jìn)一步驗(yàn)證γ-H2AX試驗(yàn)的穩(wěn)定性、可靠性以及建立相應(yīng)的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)具有重要價(jià)值。