王藝博，王 峰，肖智勇，周文霞，張永祥

（1.廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006；2.軍事科學院軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京100850）

組織氧供減少或氧不能充分被利用導致組織代謝功能和形態(tài)結(jié)構(gòu)異常變化的病理過程稱為缺氧（hypoxia），是多種疾病發(fā)生發(fā)展乃至死亡的重要原因［1］。冠心病、慢性阻塞性肺病和卒中等多種疾病伴隨的病理損害與組織缺氧密切相關［2-3］。疲勞是日常生活中的常見狀態(tài)，低氧也可引發(fā)疲勞［4］。缺氧還發(fā)生在高原和航空等高海拔環(huán)境中，嚴重影響該環(huán)境中人群的身體健康。同時，在缺氧環(huán)境下機體的活動能力明顯下降，極易感到疲勞［4］。疲勞通常被認為與生理機能下降有關，往往會引發(fā)焦慮抑郁、認知障礙和身體功能障礙等一系列繼發(fā)性問題［5］，甚至引發(fā)生物調(diào)節(jié)紊亂和免疫系統(tǒng)相關疾?。?］。疲勞的病理生理機制復雜，包括能源衰竭、疲勞相關的代謝產(chǎn)物堆積、氧化應激損傷、中樞遞質(zhì)失衡、內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡、肌肉興奮性和活動性改變和肌力下降等［7］。糖原水平、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和乳酸（lactic acid，LA）等主要代謝產(chǎn)物的含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶抗氧化酶（glutathi?one peroxidase，GSH-Px）的活性等的變化在疲勞發(fā)生機制中的研究較為廣泛［8-9］。

紅景天是我國傳統(tǒng)中藥材，具有補氣清肺、活血化瘀、補脾益氣和益智養(yǎng)心等功效。紅景天也是世界范圍內(nèi)公認的植物適應原（botanical adapto?gen），被認為具有提高機體適應能力、保護神經(jīng)、抗衰老和保護心臟等多種藥理活性［10］?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》將紅景天列為藥用上品，《四部醫(yī)典》《月王藥診》和《晶珠本草》等著作中均有關于紅景天的藥用記載，其中大株紅景天〔R.wallichiana（HK.）S.H.Fu var.cholaensis（Praeger）S.H.Fu〕于 1977年被《中國藥典》收錄［11］。筆者于2021年1月20日通過國家藥品監(jiān)督管理總局網(wǎng)站對原料為一味“紅景天”的藥物進行檢索，發(fā)現(xiàn)多種紅景天藥物的功能主治項下均有益氣、活血和化瘀的表述，而僅有3種紅景天藥物（紅景天口服液、大花紅景天口服液和狹葉紅景天片）被批準用于高山反應和身體虛弱。紅景天的抗缺氧作用可能與其種屬和來源等密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，來自同一產(chǎn)地的狹葉紅景天和唐古特紅景天其活血化瘀和抗缺氧能力也有強弱之分［12］。此外，不同品系紅景天在急性高原病防治以及抗疲勞方面的研究結(jié)果并不一致。有研究表明，服用紅景天提取物〔含3%絡塞維（rosavin）28 d后受試者的運動耐力并無提高［13］，服用紅景天提取物（含2.8%總絡塞維）〕42 d后反而加重受試者的疲勞感［14］，且紅景天水提物單獨使用對阻力運動后蛋白質(zhì)合成、肌肉表型和運動性能也無明顯影響［15］。

大株紅景天是生長于高海拔地區(qū)的紅景天屬（Rhodiola L.）的一個亞種，其主要含有丁香酸、紅景天苷、酪醇、紅景天素和沒食子酸等成分［16］。大株紅景天膠囊（large plant Rhodiola capsules，LPRC）由大株紅景天干燥根水提物制成，具有活血化瘀、通脈止痛的功效，主要用于冠心病和心絞痛的治療，癥見胸痛、胸悶、心慌和氣短等［17-18］。雖然目前還不十分清楚紅景天中的哪些特定化合物是活性成分，但其大多數(shù)制劑都被要求具有特定水平的標志性化合物——紅景天苷。目前，臨床使用的不同紅景天制劑的日推薦服用量中紅景天苷的含量存在較大差異。與其他紅景天制劑相比，LPRC日推薦服用量中紅景天苷含量>13.2 mg［19］，但其改善耐缺氧能力和抗疲勞作用未見系統(tǒng)研究。因此，本研究采用低氧混合氣體缺氧模型和密閉缺氧模型，觀察LPRC對小鼠耐缺氧能力的影響，采用負重游泳實驗和轉(zhuǎn)棒實驗評價LPRC對小鼠抗疲勞作用，并對其作用機制進行初步探討，以期為LPRC的臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

LPRC（江蘇康緣藥業(yè)公司，國藥準字號：2200-40023，批號：Z190305，紅景天苷含量>2.89 mg·g-1）；生理鹽水（石家莊四藥有限公司）；凡士林、鈉石灰、低氧混合氣體（3% O2+97% N2）及BUN（批號：C013-2-1）、LA（批號：A019-2-1）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH，批號：A020-2）、SOD（批號：A001-3）、GSH-Px（批號：A005）和丙二醛（malond?ialdehyde，MDA，批號：A003-1）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；糖原含量檢測試劑盒（BC0345）購自北京索萊寶科技有限公司。

自制密閉實驗箱（35 cm×25 cm×25 cm）、125 mL廣口瓶、自制游泳缸（30 cm×10 cm）和SA102型轉(zhuǎn)棒式疲勞儀（江蘇賽昂斯生物科技有限公司）；2300型EnsPire多功能酶標儀（美國PerkinElmer公司）；N9548智能樣品研磨儀（北京赫得）；EPS-2001電子天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司）；ANY-maze動物行為分析系統(tǒng)（上海欣軟）。

1.2 實驗動物

SPF級雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，體重20～24 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)環(huán)境溫度23～27℃，相對濕度50%～60%，每12 h明暗交替，自由攝食飲水。動物實驗遵循動物實驗倫理委員會規(guī)定進行。

1.3 動物分組和給藥

實驗流程見圖1。實驗前，首先檢測受試小鼠的自主活動性。經(jīng)適應性飼養(yǎng)7 d后的小鼠，提前放入行為學實驗室適應30 min，測試前在自制的自主活動箱（30 cm×30 cm×30 cm）中適應2 min后，采用Any-maze軟件記錄分析其20 min的運動總距離。按95%置信區(qū)間剔除自主活動過多和過少的小鼠，其余小鼠根據(jù)體重和自主活動性均衡隨機分為對照組和LPRC 0.35，0.70和1.40 g·kg-1組，每組35只，共140只。分組后次日開始給藥，每天ig給藥1次，連續(xù)給藥7 d，對照組給予相同體積的溶劑（0.9%生理鹽水）。第8天，將每組小鼠分為4批，分別進行低氧混合氣體缺氧實驗（n=10）、密閉缺氧實驗（n=10）、轉(zhuǎn)棒實驗和負重游泳實驗（n=10）及非負重游泳實驗（n=5）（圖1）。藥物受試劑量均依據(jù)其臨床推薦人用劑量（以標準體重60 kg計）折算設置，即LPRC（每粒0.38 g）臨床推薦劑量為每次4粒，每日3次，折算成小鼠每日給藥中劑量為0.70 g·kg-1，小劑量和大劑量分別為中劑量的1/2和2倍，即0.35和1.40 g·kg-1。

Fig.1 Experimental protocol and large plant Rhodiola capsules（LPRC）administration procedure.Mice were ig administered with LPRC 0.35，0.7 and 1.4 g·kg-1or saline（control group）once per day for 7 d before being subjected to behavioral experiments or sacrificed.

1.4 低氧混合氣體缺氧實驗

在低氧混合氣體（3% O2+97% N2）缺氧實驗中，自制密閉箱兩端分別安裝有進氣孔和出氣孔，進氣口連接流量表控制氣體流速。在小鼠放入前，混合氣體以8 L·min-1流速預通氣8 min，確保實驗開始時箱內(nèi)已充滿低氧氣體。實驗中，持續(xù)向密閉箱中以4 L·min-1的流速通低氧混合氣體。從小鼠放入密閉箱后開始計時，以小鼠前后趾抽搐掙扎后突然癱軟、鼻翼無煽動停止呼吸為死亡標準，記錄小鼠從放入到死亡的時間，即為小鼠低氧混合氣體缺氧存活時間。

1.5 密閉缺氧實驗

將小鼠放入廣口瓶中，瓶中裝有15 g鈉石灰，瓶口涂抹凡士林保證氣密性，蓋緊瓶蓋，開始計時，小鼠死亡標準同1.4。小鼠自進入密閉廣口瓶至死亡的時間即為密閉缺氧存活時間。

1.6 轉(zhuǎn)棒疲勞實驗

小鼠轉(zhuǎn)棒疲勞實驗分為學習期和測試期，其實驗結(jié)果分別用于評價藥物對實驗動物的協(xié)調(diào)能力和疲勞耐力的影響［5，20］。第4～7天，每天給藥2 h后將小鼠放于轉(zhuǎn)棒疲勞儀上進行學習，第8天進行測試。學習期轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速設置為20 r·min-1，時間10 min，加速度7 r·min-1，記錄小鼠從放上轉(zhuǎn)棒到掉落的時間，即在棒時間。各組小鼠成績穩(wěn)定后進行測試實驗，測試期轉(zhuǎn)速設置為40 r·min-1，記錄小鼠在棒時間。

1.7 負重游泳力竭實驗

小鼠尾部后1/3處懸掛約自身體重10%的砝碼，輕放入自制圓柱形水缸中，水深25 cm（小鼠四肢、重物均無法接觸缸底），水溫23～27℃。記錄小鼠自放入游泳缸到沉入水中時間>10 s，記為小鼠負重游泳時間。

1.8 非負重游泳力竭小鼠肝糖原和肌糖原含量測定

根據(jù)文獻［8，21］進行改進。給藥第5～7天，對小鼠進行非負重游泳訓練，訓練時程分別為第5天30 min、第6天60 min和第7天90 min，制備小鼠力竭模型。除小鼠無負重外，其余實驗條件同負重游泳實驗。第8天，小鼠游泳90 min后休息30 min，隨即處死小鼠，取肝和腓腸肌加入4℃生理鹽水制成10%的勻漿。根據(jù)糖原檢測試劑盒說明書推薦的方法進行測定。

1.9 非負重游泳力竭小鼠血清中BUN，LA和MDA含量及LDH，SOD和GSH-Px活性測定

與1.8同批小鼠，第8天小鼠游泳90 min后休息30 min，處死前眼眶取血，4℃過夜后1123×g，4℃離心10 min取血清。根據(jù)各自試劑盒說明書測定。

1.10 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 LPRC對小鼠體重的影響

實驗前各組小鼠體重均衡，給藥7 d內(nèi)，各組小鼠體重均隨日齡增加而增長，對照組、LPRC 0.35，0.70和1.40 g·kg-1組小鼠體重分別增長1.6±0.3，1.7±0.7，1.5±0.7和（1.4±0.5）g，各組間無明顯差異。

2.2 LPRC對小鼠低氧混合氣體缺氧和密閉缺氧存活時間的影響

低氧混合氣體缺氧實驗結(jié)果顯示，與對照相比，LPRC 0.70和1.40 g·kg-1可顯著延長小鼠缺氧存活時間（P<0.05，P<0.01），LPRC 0.35 g·kg-1無明顯影響（圖2A）。密閉缺氧實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，LPRC 3個劑量對小鼠缺氧存活時間均無明顯影響（圖2B）。

Fig.2 Effect of LPRC on survival time under gas mixture of low oxygen（A）and hypoxia in hermetic space（B）in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=10.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with control group.

2.3 LPRC對小鼠轉(zhuǎn)棒實驗在棒時間的影響

學習期結(jié)果顯示，隨小鼠學習時間的延長，各組小鼠在棒時間均呈延長趨勢，LPRC 1.40 g·kg-1組小鼠學習第2天時在棒時間顯著長于對照組（P<0.05），LPRC 0.35和0.70 g·kg-1無明顯影響（圖3A）。測試期結(jié)果表明，連續(xù)7 d給予LPRC后，與對照組相比，LPRC 1.40 g·kg-1組小鼠在棒時間顯著延長（P<0.01），LPRC 0.35和0.70 g·kg-1無明顯影響（圖3B）。

Fig.3 Effect of LPRC on rotarod latency in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.The latency in learning phase（A）and test phase（B）was recorded 2 h after LPRC or saline treatment.±s，n=10.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with control group.

2.4 LPRC對小鼠負重游泳時間的影響

與對照組相比，LPRC 0.70和1.40 g·kg-1可顯著延長小鼠負重游泳時間（P<0.01），LPRC 0.35 g·kg-1無明顯影響（圖4）。

Fig.4 Effect of LPRC on weight-loaded swimming time in mice.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=10.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with control group.

2.5 LPRC對非負重游泳力竭小鼠肝和腓腸肌組織中糖原含量的影響

與對照組相比，LPRC 0.35，0.70和1.40 g·kg-1組游泳力竭小鼠肝糖原含量顯著增加（P<0.05，P<0.01），LPRC 0.35和0.70 g·kg-1組游泳力竭小鼠肌糖原含量顯著增加（P<0.05，P<0.01）（表1）。

Tab.1 Effect of LPRC on glycogen levels of liver and gastrocnemius in mice after exhaustive swimming

2.6 LPRC對游泳力竭小鼠血清BUN和LA含量及LDH活性的影響

與對照組相比，LPRC 0.70 g·kg-1組BUN水平顯著降低（P<0.05），LPRC 0.35，0.70和1.40 g·kg-1組LA水平均顯著降低（P<0.05，P<0.01），并增強LDH活性（P<0.01）（表2）。

Tab.2 Effect of LPRC on levels of blood urea nitro?gen（BUN），lactic acid（LA）and activity of lactate dehydrogenase（LDH）in serum of mice after exhaus?tive swimming

2.7 LPRC對游泳力竭小鼠血清SOD和GSH-Px活性及MDA含量的影響

與對照組相比，LPRC 0.35，0.70和1.40 g·kg-1均顯著增強力竭運動小鼠SOD活性，LPRC 1.40 g·kg-1顯著增強GSH-Px活性并降低MDA含量（P<0.05，P<0.01）（表3）。

Tab.3 Effect of LPRC on activity of superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）and content malondialdehyde（MDA）in serum of mice after exhaus?tive swimming

3 討論

吸入氣體氧分壓過低是造成機體整體缺氧的重要原因，除發(fā)生于高原或高空外，也多發(fā)生于密閉環(huán)境或吸入低氧混合氣體情況［22］。密閉缺氧和低氧混合氣體缺氧是觀察動物整體缺氧的常用方法［23］。本研究結(jié)果表明，LPRC可顯著提高小鼠在低氧混合氣體下的耐缺氧能力。負重游泳和轉(zhuǎn)棒是評價動物疲勞耐力的經(jīng)典方法。本研究結(jié)果表明，LPRC可顯著提高小鼠的負重游泳時間和在棒時間，并可改善正常小鼠運動協(xié)調(diào)能力。該結(jié)果提示，LPRC具有提高小鼠耐缺氧能力和抗疲勞作用。

疲勞的病理生理機制復雜。目前關于運動性疲勞發(fā)生的理論認為，其與能量耗竭、代謝產(chǎn)物堆積及氧化應激等密切相關。有研究表明，運動所致的體能下降與糖原消耗同時發(fā)生，增加肝和肌糖原的儲存能有效提高運動耐力［24-25］。本研究發(fā)現(xiàn)，LPRC能顯著增加肝、肌糖原儲備，與文獻報道的紅景天制劑作用一致［26］。機體劇烈運動時可導致LA堆積，最終引起疲勞［9，27］。LDH可減輕LA堆積，其活性可以反映藥物的抗疲勞能力［28］。劇烈運動時還會導致機體蛋白質(zhì)代謝終產(chǎn)物BUN含量升高，其水平能夠反映機體對運動的耐受能力［29］。有文獻報道，紅景天能夠清除疲勞代謝產(chǎn)物，發(fā)揮抗疲勞作用［30］。本研究結(jié)果表明，LPRC也具有增強LDH活性、降低LA和BUN水平的作用。機體疲勞時還可能出現(xiàn)氧化應激水平升高。ROS可直接影響能量供應和興奮-收縮偶聯(lián)過程中的酶活性，又能加速LA和BUN等代謝產(chǎn)物積累［31］。GSH-Px能將SOD催化ROS產(chǎn)生的過氧化氫分解成水和O2，兩者是清除ROS的主要抗氧化酶［32］，清除ROS是多種藥物發(fā)揮抗疲勞作用的基礎［33］。LPRC能顯著增強小鼠抗氧化酶SOD和GSH-Px活性，并減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA水平。缺氧和疲勞在機體病理生理反應上具有相似性，組織缺氧往往伴隨著LA堆積和氧化應激水平增加的現(xiàn)象［34-35］。LPRC對LA代謝和氧化應激的調(diào)節(jié)作用可能與其提高機體耐缺氧能力及抗疲勞作用密切相關。

綜上所述，LPRC可顯著提高小鼠的常壓耐缺氧和抗疲勞能力，其作用可能與增加糖原儲備、清除代謝物堆積及增強抗氧化能力有關。本研究結(jié)果提示，將LPRC臨床推薦劑量增加1倍，其提高耐缺氧及抗疲勞作用可能會增強。本研究為進一步開展其抗缺氧及抗疲勞臨床研究及應用提供了實驗依據(jù)。