柳江楓，楊曄宏，武 樂，楊俊濤

1中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 基礎(chǔ)醫(yī)學研究所醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京 1000052南開大學統(tǒng)計與數(shù)據(jù)科學學院，天津 300071

衰老是一種復雜的生物學過程，伴隨生物體功能的時間相關(guān)性下降[1- 2]。既往研究顯示衰老常伴隨代謝功能紊亂[3]。已有一些干預方法被試用于延緩衰老，如雷帕霉素、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)前體物質(zhì)、衰老細胞清除劑、二甲雙胍、運動或能量限制[4]，然而，延緩衰老的方法至今仍然在探索中。既往衰老研究模型大多由基因編輯或藥物誘導產(chǎn)生[5]，人們對衰老過程的認識仍需完善，強化自然衰老過程的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的研究十分必要。肝臟是人類與小鼠最大的代謝器官，肝臟的血竇結(jié)構(gòu)使肝實質(zhì)細胞能夠與血液較為充分地進行物質(zhì)交換，而血液通過全身循環(huán)，可進行不同組織間的物質(zhì)傳遞。本研究希望對生理狀態(tài)下不同年齡小鼠的肝臟與血清做代謝組學檢測，從整體視角了解衰老相關(guān)的代謝功能改變情況。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)為大規(guī)模生物代謝物鑒定提供了技術(shù)支撐。為認識伴隨自然衰老發(fā)生的代謝改變狀況，本研究應用液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)對自然衰老小鼠的肝臟與血清做非靶向代謝組學分析，以便為衰老相關(guān)基礎(chǔ)研究和干預途徑選擇提供支撐數(shù)據(jù)集。

材料和方法

實驗動物本研究的實驗動物是野生型雄性C57BL/6J小鼠，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司引進。10只2月齡小鼠劃分為年輕組，10只18月齡小鼠劃分為年老組。小鼠生長過程中自由進食水，8月齡以后按1只/籠放置小鼠并繼續(xù)喂養(yǎng)至18月齡。

樣本前處理用三溴乙醇麻醉小鼠，眶靜脈放血實施安樂死。血液收集在1.5 ml EP管中，常溫放置30 min，5000 轉(zhuǎn)/min(轉(zhuǎn)子半徑=7.5 cm)離心15 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的EP管，-80 ℃保存至樣本提取。分離小鼠肝臟，將組織分裝，在-80 ℃保存至樣本提取。

代謝組學樣本前處理、液相色譜-質(zhì)譜分析、峰提取和化合物鑒定由中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉中心朱正江研究員課題組完成，主要參考課題組的前期經(jīng)驗[6]。每只小鼠取20 mg肝臟組織(加200 μl水制成懸濁液)和100 μl血清進行檢測。添加4倍于樣本體積的甲醇/乙腈(體積比1∶1)充分混勻，4 ℃水浴超聲10 min，-20 ℃繼續(xù)孵育1 h。隨后4 ℃、13 000 轉(zhuǎn)/min(轉(zhuǎn)子半徑=7.5 cm)離心15 min，取上清做真空冷凍干燥。用100 μl乙腈/水(體積比1∶1)重懸樣本，充分混勻后4 ℃、13 000 轉(zhuǎn)/min(轉(zhuǎn)子半徑=7.5 cm)離心15 min，-80 ℃保存至質(zhì)譜檢測。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析用Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱(1.7 μm粒徑，內(nèi)徑2.1 mm，100 mm長)做液相色譜分析。流動相A是含25 mmol/L醋酸銨、25 mmol/L氫氧化銨的水溶液(pH 9.6)，流動相B是乙腈。液相梯度設(shè)置為：95% B(0.0～1.0 min)、95% B至65% B(1.0～14.0 min)、65% B至40% B(14.0～16.0 min)、40% B(16.0～18.0 min)、40% B至95% B(18.0～18.1 min)、95% B(18.1～23.0 min)，流速穩(wěn)定在300 nl/min，樣本注入量為2 μl。應用TripleTOF 6600(Sciex)做正離子模式和負離子模式下的串聯(lián)質(zhì)譜分析，數(shù)據(jù)采集模式設(shè)為信息依賴性分析，軟件Analyst TF 1.7(Sciex)選擇一級掃描強度最高的12個母離子進行二級碎裂。

數(shù)據(jù)處理與生物信息分析使用朱正江研究員實驗室開發(fā)的內(nèi)部程序分析質(zhì)譜儀生成的原始.wiff格式文件，做峰提取和化合物定量。用總離子流對數(shù)據(jù)做歸一化，并填補缺失值。對年輕與年老組間化合物做雙樣本t檢驗，用年老組化合物均值比年輕組化合物均值計算變化倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)。整理后的數(shù)據(jù)用R做主成分分析和火山圖展示。用SIMCA14軟件(v14.1，Sartorius Stedim Data Analytics AB)做正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projections to latent structures-discriminant analysis，OPLS-DA)，并獲取OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(variable importance in the project，VIP)。雙樣本t檢驗P<0.05且VIP>1的化合物視為有差異；FC>1的化合物視為衰老中上調(diào)，F(xiàn)C<1的化合物視為衰老中下調(diào)。將正離子模式和負離子模式鑒定到的化合物根據(jù)二級譜圖匹配度做去冗余整合，差異表達化合物上傳至MetaboAnalyst[7]做通路分析。

結(jié) 果

肝臟代謝組學特征經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，小鼠肝臟在質(zhì)譜負離子模式和正離子模式下分別鑒定到242和399個代謝物。主成分分析顯示，質(zhì)控樣本在正負離子兩種模式下均高度聚合，提示質(zhì)譜儀運行穩(wěn)定，樣本鑒定結(jié)果高度可信。而小鼠肝臟代謝組鑒定結(jié)果顯示樣本間的離散度較高，年輕與年老肝臟代謝物整體區(qū)分度較小(圖1A、1B)。用火山圖呈現(xiàn)定性、定量化合物的雙樣本t檢驗P值及變化倍數(shù)，結(jié)果顯示負離子模式鑒定到的肝臟化合物在年老組有整體下調(diào)偏向(圖1C)，而正離子模式鑒定到的化合物改變均衡(圖1D)。

PCA：主成分分析；FC：變化倍數(shù)；PC1：第一主成分；PC2：第二主成分；QC：質(zhì)量控制；Neg：負離子模式；Pos：正離子模式

用SIMCA14軟件進行OPLS-DA建模分析評估年輕與年老小鼠肝臟代謝物的組間差異，模型質(zhì)量用7折交叉驗證檢驗。初始OPLS-DA模型得分散點圖顯示年輕與年老小鼠肝臟代謝組在正負離子鑒定模式下均有組間差異(圖2A、2B)。對模型進行200次置換檢驗，記錄每次檢驗的R2Y(評估分類變量Y的可解釋性)值和Q2(評估模型的可預測性)值，與初始分類模型比較，置換檢驗結(jié)果顯示初始OPLS-DA模型的Q2值遠高于各置換檢驗結(jié)果，R2Y值略高于各次置換檢驗(圖2C、2D)。提示初始OPLS-DA模型不存在過擬合，可以對年輕與年老小鼠肝臟代謝組做有效組間區(qū)分，但組間差異較小。將正負離子模式鑒定到的化合物做去冗余整合及差異篩選，將在衰老中上調(diào)與下調(diào)的肝臟代謝物分別上傳至MetaboAnalyst做京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，上調(diào)代謝物與核黃素代謝、淀粉和蔗糖代謝、果糖和甘露糖代謝、磷酸戊糖途徑、?；撬崤c次?；撬岽x以及花生四烯酸代謝等途徑關(guān)系較為密切(圖2E)。下調(diào)代謝物與嘧啶代謝、嘌呤代謝、煙酰胺代謝、谷胱甘肽代謝、甘油磷脂代謝和檸檬酸循環(huán)等途徑關(guān)系較密切(圖2F)。

血清代謝組學特征經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，負離子模式與正離子模式在小鼠血清中分別鑒定到265和230個代謝物。主成分分析結(jié)果顯示，質(zhì)控樣本高度聚集，提示質(zhì)譜儀運轉(zhuǎn)穩(wěn)定，鑒定結(jié)果可靠；正負離子模式下，年輕與年老小鼠的血清代謝物整體區(qū)分較為明顯(圖3A、3B)。計算各代謝物的雙樣本t檢驗P值和變化倍數(shù)并用火山圖呈現(xiàn)，顯示正負離子模式下鑒定到的血清代謝物在小鼠衰老時均有整體下調(diào)趨勢(圖3C、3D)。

用SIMCA14軟件進行OPLS-DA建模，進一步評估年輕與年老小鼠血清代謝組學的差異狀況，初始模型的得分圖散點圖顯示正負離子模式下年輕與年老小鼠血清代謝組均存在組間差異(圖4A、4B)。對OPLS-DA模型做200次置換檢驗，結(jié)果顯示，原始模型的R2Y和Q2值高于置換檢驗，原始模型有效，不存在過擬合；負離子模式鑒定的血清代謝物對年輕與年老的區(qū)分能力較強(圖4C)，正離子模式鑒定的代謝物對兩組的區(qū)分能力較弱(圖4D)。將正負離子模式鑒定的化合物做去冗余整合并篩選差異代謝物。KEGG通路分析顯示，衰老時血清中含量上調(diào)的代謝物與甘油磷脂代謝、一碳單位池、嘌呤代謝、嘧啶代謝和色氨酸代謝相關(guān)性較強，衰老下調(diào)的代謝物與氨糖和核糖代謝、氨酰-tRNA合成、精氨酸代謝、嘧啶代謝、甘氨酸絲氨酸蘇氨酸代謝、抗壞血酸和醛酸代謝等途徑相關(guān)(圖4E、4F)。

肝臟與血清代謝物比較做韋恩圖比較肝臟與血清代謝組學鑒定代謝物的異同，顯示肝臟與血清共同鑒定到247種代謝物(圖5A)，其中衰老相關(guān)的共有差異代謝物28個(圖5B)。KEGG通路分析顯示，肝臟與血清的共同差異代謝物主要與嘧啶代謝和甘油磷脂代謝等途徑相關(guān)(圖5C)。

討 論

本研究首次共同分析以液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)鑒定的衰老小鼠肝臟與血清代謝組狀況，肝臟代謝組及血清代謝組在年輕與年老小鼠中的整體區(qū)分不明顯。血清代謝組的數(shù)據(jù)特征對年輕、年老小鼠的區(qū)別能力強于肝臟代謝組，但血清代謝物的功能更明顯與核酸代謝途徑相關(guān)。肝臟伴隨衰老而上調(diào)和下調(diào)的代謝物功能區(qū)分更明顯。本研究顯示煙酰胺代謝途徑伴隨衰老在肝臟中下調(diào)。煙酰胺是NAD+的前體物質(zhì)之一，既往研究顯示生物體衰老時NAD+含量降低[3]，而補充NAD+或NAD+前體物質(zhì)，如煙酰胺單核苷酸和煙酰胺核糖可以延長健康壽命和整體壽命[8- 9]。早期研究顯示谷胱甘肽含量伴隨衰老有所降低[10]，本研究也顯示谷胱甘肽代謝途徑的衰老相關(guān)性下調(diào)，谷胱甘肽缺失易導致細胞抗氧化能力下降從而增加氧化損傷風險[11]。而上調(diào)的花生四烯酸也提示衰老肝臟存在炎癥狀態(tài)。廣泛的通路覆蓋提示代謝組學研究復雜生理過程具有優(yōu)勢。

肝臟與血清代謝組共同凸顯出核酸相關(guān)代謝通路在衰老過程中的下調(diào)趨勢。核酸代謝伴隨衰老下調(diào)曾在線蟲中觀察到[12]。補充嘧啶和嘌呤的代謝中間產(chǎn)物，如尿苷、胞苷和次黃嘌呤可以延長線蟲壽命[13]。核酸代謝受損與突變增加、基因組不穩(wěn)定和腫瘤發(fā)生相關(guān)。細胞內(nèi)三磷酸脫氧核糖核苷改變可能損害DNA合成和DNA復制，導致細胞周期失調(diào)和雙鏈DNA斷裂[14- 16]。肝臟是核酸合成代謝的主要器官，肝臟核酸代謝下調(diào)引起的相關(guān)化合物減少能影響全身核酸合成或代謝的原料攝取，進而造成細胞周期的廣泛減緩，加劇細胞衰老狀態(tài)(一種永久的細胞增殖停滯狀態(tài)[17])。

本研究也發(fā)現(xiàn)了一些需要繼續(xù)研究解決的科學問題。以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)做代謝物鑒定以譜圖匹配為基本原理，依賴高質(zhì)量譜圖庫和穩(wěn)定的譜圖生成過程。本研究雖然鑒定到數(shù)目可觀的代謝物，但因技術(shù)原理限制導致的譜圖庫規(guī)模限制，仍有大量代謝物不能被成功識別。本研究應用的液相色譜分離系統(tǒng)有利于鑒定極性化合物，但可能相應降低對非極性化合物和脂質(zhì)的鑒定。本研究在肝臟和血清中發(fā)現(xiàn)了多種與衰老相關(guān)的通路，但多數(shù)通路有大量分子無法被鑒定。也提示現(xiàn)階段有必要將代謝組學與其他生物組學，如轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學，進行聯(lián)動分析以全面認識衰老過程。衰老是一種復雜的生物學過程，筆者希望以客觀呈現(xiàn)結(jié)果方式全面展示小鼠的肝臟和血清中代謝物伴隨衰老發(fā)生的變化，為復雜生物學功能、機制研究或?qū)ふ已泳徦ダ戏桨柑峁┗A(chǔ)支撐數(shù)據(jù)集。

OPLS-DA：正交偏最小二乘法-判別分析；KEGG：京都基因與基因組百科全書

A.負離子模式鑒定到的小鼠血清化合物PCA；B.正離子模式鑒定到的小鼠血清化合物PCA；C.負離子模式鑒定到的小鼠血清化合物火山圖，呈現(xiàn)每個化合物的FC和雙樣本t檢驗P值(紅色：P<0.05的化合物；綠色：P>0.05的化合物)；D.正離子模式鑒定到的小鼠血清化合物火山圖，呈現(xiàn)每個化合物的FC和雙樣本t檢驗P值(紅色：P<0.05的化合物；綠色：P>0.05的化合物)

綜上，本研究以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜為平臺實現(xiàn)對自然衰老小鼠肝臟與血清代謝物的批量定性定量分析，發(fā)現(xiàn)核酸代謝通路有伴隨衰老下調(diào)的趨勢。本研究為繼續(xù)深入開展衰老研究提供了代謝組學數(shù)據(jù)資源。

A.年老組對年輕組OPLS-DA模型得分散點圖(負離子模式鑒定到的小鼠血清代謝物)；B.年老組對年輕組OPLS-DA模型得分散點圖(正離子模式鑒定到的小鼠血清代謝物)；C.年老組對年輕組OPLS-DA模型的置換檢驗結(jié)果(200次置換，負離子模式鑒定到的小鼠血清代謝物)；D.年老組對年輕組OPLS-DA模型的置換檢驗結(jié)果(200次置換，正離子模式鑒定到的小鼠血清代謝物)；E.衰老上調(diào)的小鼠血清代謝物的KEGG通路分析；F.衰老下調(diào)的小鼠血清代謝物的KEGG通路分析

A.小鼠肝臟與血清鑒定代謝物的韋恩圖；B.小鼠肝臟與血清伴隨衰老發(fā)生差異改變的代謝物的韋恩圖；C.小鼠肝臟與血清的衰老相關(guān)的28個共同差異代謝物的KEGG通路分析