宋阿倩，周秀彥

1.山西醫(yī)科大學，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院消化內(nèi)科

克羅恩病(Crohn’s disease, CD)是炎癥性腸病之一，是胃腸道慢性炎性肉芽腫性疾病，病變多見于末端回腸和鄰近結(jié)腸，但可累及消化道從口腔至肛門各段，呈節(jié)段性或跳躍式分布。我國流行病學資料顯示,黑龍江省大慶市CD的年齡標化發(fā)病率為1.77/10萬，廣東省中山市為3.14/10萬，CD在我國仍屬少見病，但近20余年來其就診人數(shù)呈快速上升趨勢[1]。CD的臨床特點是突然或隱匿起病，以腹痛、腹瀉、瘺管形成、腹部包塊及腸梗阻為主要表現(xiàn)，可伴發(fā)熱、貧血、營養(yǎng)障礙以及關(guān)節(jié)、皮膚、眼、口腔黏膜、肝膽等腸外損傷。其特征主要是慢性復發(fā)和緩解性腸道炎癥，涉及先天性和適應性免疫系統(tǒng)的病理反應。CD的治療藥物主要有氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、硫嘌呤類藥物、甲氨蝶呤、抗TNF-α單克隆抗體等，目前應用于臨床并取得較好治療效果的抗TNF-α制劑有英夫利昔單抗、阿達木單抗等，然而，人們已經(jīng)認識到，約三分之一的患者對抗TNF-α制劑的治療失敗，且高達40%最初受益的患者隨后失去反應[2]，因此針對CD的發(fā)病機制開發(fā)新的治療策略具有非常重要的意義。由于白細胞介素(IL)-12/23軸是CD黏膜免疫學和發(fā)病機制的重要組成部分，中和細胞因子IL-12和IL-23的烏司奴單抗(Ustekinumab)已成為治療CD的新方法。烏司奴單抗是一種人完全IgG1-κ單克隆抗體，主要用于治療銀屑病、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、類風濕關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病等疾病。2016年美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)及歐盟委員會批準烏司奴單抗適用于治療對常規(guī)治療或TNF-α拮抗劑反應不足或不耐受或有醫(yī)學禁忌證的成人中-重度活動性CD[1]。烏司奴單抗與IL-12和IL-23的p40亞單位結(jié)合，阻止與NK或T細胞表面IL-12Rb1結(jié)合，抑制IL-12信號和T細胞Th1亞群的進一步激活以及IL-23信號傳導和T細胞Th17亞群的進一步激活[3]?；贑D的發(fā)病機制，烏司奴單抗可為CD治療提供新思路。本文主要從以下幾個方面闡述烏司奴單抗在CD治療中的研究進展。

1 CD的發(fā)病機制

CD的發(fā)病機制是多因素的，涉及遺傳、環(huán)境、腸道菌群、免疫失調(diào)的相互作用，從而導致異常的免疫反應和隨后的腸道炎癥。有研究認為，CD發(fā)病機制可能是環(huán)境因素作用于遺傳易感個體，引起腸道菌群過度活躍所致的黏膜免疫反應[4]。宿主的遺傳易感性和環(huán)境因素已經(jīng)被認為是導致腸內(nèi)免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)失調(diào)而導致CD的原因之一[5]，基因變異在CD的發(fā)病風險中起著重要作用，但廣泛的環(huán)境因素，包括吸煙、飲食、藥物、社會壓力等，也被認為是CD的危險因素。越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群與黏膜免疫系統(tǒng)之間失調(diào)導致菌群失調(diào)及免疫反應失調(diào)的惡性循環(huán)，最終導致慢性腸道炎癥狀態(tài)[6]。

腸道菌群對免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟非常重要。人類腸道菌群，擁有超過100萬億個微生物，是CD發(fā)病機制中重要的一部分，通過改變微生物成分提供抗原刺激，促進宿主微生物群失衡，導致腸道和免疫穩(wěn)態(tài)紊亂。遺傳易感宿主對腸道微生物群中特定成分的攻擊性T細胞介導的免疫反應導致CD腸道炎癥[7]。腸道菌群失調(diào)被認為與潛在CD的發(fā)展或惡化有關(guān)。對CD患者腸道菌群的研究表明，致病微生物數(shù)量增加，而正常共生菌的數(shù)量減少。Imhann等[8]研究表明，與健康人相比，CD患者腸道菌群失調(diào)且多樣性降低。

失調(diào)的黏膜免疫反應是CD的主要驅(qū)動因素，其特征是先天性免疫系統(tǒng)改變，效應T細胞激活，B細胞增多，抗體生成增多，促炎介質(zhì)增多。由細胞因子驅(qū)動的炎癥反應的不適當激活和維持及調(diào)節(jié)機制的降低和IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β等抗炎細胞因子缺乏控制，導致慢性腸道炎癥。此外，炎癥的腸道顯示黏膜地址素細胞粘附分子1(MAdCAM-1)的表達增加，導致腸道特異性T細胞向固有層的募集增加，并使炎癥循環(huán)持續(xù)，導致慢性組織損傷和上皮損傷。參與CD發(fā)病機制的關(guān)鍵先天性和適應性免疫細胞主要有樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞、上皮細胞、肌成纖維細胞等，其中DC控制先天免疫和適應性免疫之間的串擾，以維持體內(nèi)平衡。DC可在IL-6、TNF、IL-1β、IL-18等調(diào)控下產(chǎn)生效應T細胞，原始T細胞可以通過抗原呈遞細胞產(chǎn)生的效應細胞因子控制分化為Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T(Treg)細胞[9]。其中Th1和Th17細胞在CD發(fā)病過程中起重要作用[10]。Th1細胞在IL-12和IL-27刺激下從幼稚的CD4+T細胞分化，隨后誘導表面轉(zhuǎn)錄因子如T-bet和STAT-4，其特征是分泌IFN-c、TNF和IL-2。Th17細胞由IL-6、TGF-β及STAT3的表達共同誘導，IL-23可促進Th17細胞的擴張，Th17細胞的特點是產(chǎn)生大量的IL-17A、IL-17F、IL-21和IL-22，并表達轉(zhuǎn)錄因子維甲酸受體相關(guān)孤兒受體(ROR)ct[11]。Guéry等[12]研究發(fā)現(xiàn)，Th17細胞具有可塑性，可被誘導分化為Th1細胞。持續(xù)的天然免疫反應及Th1、Th17等細胞異常激活等釋放出各種炎癥介質(zhì)及免疫調(diào)節(jié)因子參與了腸黏膜屏障的免疫損傷。IL-12和IL-23的產(chǎn)生在對多種抗原刺激物的反應中增加，并與許多慢性自身免疫性疾病的炎癥發(fā)病機制有關(guān)，包括斑塊性銀屑病、強直性脊柱炎和CD，其中IL-12和IL-23通過誘導CD患者腸黏膜中Th17、Th1或固有淋巴細胞(ILCs)的發(fā)育而引起炎癥[13]。最近對CD患者的烏司奴單抗的臨床試驗所示，與安慰劑相比，IL-12/23在抗腫瘤壞死因子治療失敗中-重度CD患者是有效的[14]。因此，IL-12和IL-23的炎癥作用為開發(fā)CD阻斷劑提供了理論依據(jù)。

2 烏司奴單抗治療CD的相關(guān)機制

2.1 IL-12和IL-23IL-12家族由IL-12、IL-23、IL-27和IL-35 4個成員組成。IL-12、IL-23和IL-27由活化抗原呈遞細胞分泌，如DC和巨噬細胞。而IL-35是調(diào)節(jié)性T細胞和B細胞的產(chǎn)物。它們通過啟動幼稚的CD4+T細胞分化為產(chǎn)生細胞因子的輔助性T細胞亞群和記憶性T細胞，在先天性和適應性免疫系統(tǒng)之間架起了橋梁。IL-12細胞因子除了影響淋巴細胞的分化外，還調(diào)節(jié)正常免疫系統(tǒng)功能所需的細胞途徑，一些成員激活促炎反應以防感染，而其他成員則抑制導致自身免疫疾病的過度免疫反應。其中IL-12和IL-23除了影響細胞介導的免疫反應和炎癥反應，還可以驅(qū)動機體對病毒和細菌感染的反應，以及形成抗腫瘤和促腫瘤免疫之間的平衡[15]。

IL-12是所述家族的第一個成員，是一種促炎細胞因子。它是一種異二聚體，由IL-12p35和IL-12p40亞基組成[16]，在同一細胞中的共表達需要通過二硫鍵連接形成的具有生物活性的IL-12p70細胞因子。雖然它由多種造血細胞分泌，但主要的生理生產(chǎn)者是抗原呈遞細胞。IL-12與其在活化T細胞、自然殺傷(NK)細胞和DC上表達的高親和力受體(IL-12Rβ1/IL-12Rβ2)結(jié)合，其中IL-12Rβ1鏈與p40亞單位結(jié)合，而IL-12p35與IL-12Rβ2鏈結(jié)合，從而激活TYK2(酪氨酸激酶2)、JAK2和STAT通路。雖然STAT1、STAT3和STAT4在體外有不同程度的激活，但對IL-12的生理反應主要通過STAT4介導[17]。IL-12可促進活化NK細胞、淋巴因子激活殺傷(LAK)細胞和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的生成，誘導NK細胞和T細胞產(chǎn)生IFN-γ、TNF-α和粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，還可增強NK細胞、CTL和自然殺傷T(NKT)細胞的細胞毒性活性[18]。在CD4+T細胞中，IL-12信號和抗原呈遞被認為是將細胞分化向輔助性T細胞(Th)1表型的轉(zhuǎn)變，Th1細胞是一種重要的IFN-γ產(chǎn)生者，Th1細胞和NK細胞產(chǎn)生的IFN-γ反過來激活固有免疫細胞以正反饋方式分泌IL-12，增強細胞介導的免疫反應[19]。CD已被證明具有主要的Th1特征。CD患者胃腸道組織中IL-12的p35和p40亞基的過度表達升高，編碼IL-12/23p40或IL-23R的基因多態(tài)性與CD也有關(guān)[20]。

IL-23于2003年被發(fā)現(xiàn)，它也是一種異二聚體，與IL-12共享IL-12p40亞基，但由于其獨特的IL-23p19亞基而與IL-12不同[21]。與IL-12相似，IL-12p40和IL-23p19亞基在同一細胞中的共表達是分泌二硫鍵連接的生物活性IL-23細胞因子的必要條件。共享IL-12p40亞單位可使IL-12和IL-23與IL-12Rβ1受體亞單位相互作用。高親和力IL-23受體源于IL-12Rβ1與獨特的IL-23受體亞單位(IL-23R)的結(jié)合。IL-23由巨噬細胞、DC、角質(zhì)形成細胞和其他抗原呈遞細胞及T和NK淋巴細胞產(chǎn)生[22]。高親和力IL-23受體表達在活化的T細胞和免疫細胞上，包括Th17細胞、γδT細胞、NKT細胞和ILC。IL-23對其靶細胞的生物學效應通過激活TYK2、JAK2、STAT3和STAT4來介導[23]。IL-23在促炎作用下參與Th17細胞的分化，尤其是在TGF-β和IL-6存在的情況下。活化的Th17細胞產(chǎn)生IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-22、TNF-α和GM-CSF，這些細胞因子被認為在CD發(fā)病中起重要作用[24]。此外，IL-23刺激可導致功能性CD8+T細胞和NK細胞反應，誘導ILC，以及ILC介導的腸道微生物群變化[2]。全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)證明了CD和IL-23受體編碼基因之間的關(guān)聯(lián)。Macaluso等[25]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照者和潰瘍性結(jié)腸炎患者相比，CD患者黏膜中IL-23p19的表達顯著增加。

2.2 烏司奴單抗治療CD烏司奴單抗在小鼠模型中的治療潛力初步得到證實。IL-12/IL-23p40阻斷研究表明，在IL-10基因敲除小鼠中，p40亞基敲除小鼠可免于結(jié)腸炎的發(fā)生[26]。來自2,4,6-三硝基苯磺酸誘導的結(jié)腸炎模型的初始數(shù)據(jù)顯示，在使用針對IL-12的單克隆抗體治療后，臨床和組織學均有改善[27]。在小鼠IL-23/p19基因敲除結(jié)腸炎模型中進行的實驗進一步證實了IL-12在CD發(fā)病機制中的重要性。這些動物表現(xiàn)出從DC分泌的大量IL-12，隨后在無IL-23抑制的情況下發(fā)展成嚴重的結(jié)腸炎。這些結(jié)果提示,IL-23可能調(diào)節(jié)IL-12的產(chǎn)生，進而促進結(jié)腸炎的發(fā)展。雖然IL-23最初被認為通過影響IL-12在結(jié)腸炎的發(fā)展中起到間接作用，但有研究發(fā)現(xiàn)，IL-10/IL-12p35缺陷小鼠在缺乏IL-12的情況下仍然發(fā)生結(jié)腸炎[28]。相反，IL-10/ILp19基因敲除缺乏合成IL-23的能力，即使在IL-12存在的情況下也仍未發(fā)生疾病。在將給予IL-10基因的小鼠幼稚T細胞或記憶性T細胞敲除后10～12周發(fā)生結(jié)腸炎；伴隨著同時給予IL-23這一過程在4周內(nèi)加快[29]。來自動物模型的其他數(shù)據(jù)支持IL-23在激活組織巨噬細胞和腸道歸巢記憶T細胞中的重要性[29]。此外，給予的抗IL-23p19藥物通過下調(diào)促炎性細胞因子的產(chǎn)生和引起Th17細胞凋亡來預防和治療已建立的T細胞轉(zhuǎn)移性結(jié)腸炎[29]。這些均表明抑制IL-12/IL-23可能有助于控制人類受試者的CD炎癥。

烏司奴單抗是一種人類免疫球蛋白G1κ(IgG1κ)單克隆抗體，是一種直接的IL-12和IL-23拮抗劑，不干擾腫瘤壞死因子途徑。兩種白細胞介素都有一個p40亞單位，與細胞結(jié)合的IL-12Rβ1受體結(jié)合，IL-12和IL-23p40亞基與其受體的結(jié)合分別刺激Th1和Th17細胞因子通路。烏司奴單抗與p40亞單位的結(jié)合阻止了IL-12和IL-23與NK或T細胞表面IL-12Rb1受體復合物的相互作用，從而抑制了IL-12和IL-23介導的下游信號傳導、基因激活和細胞因子的產(chǎn)生，中斷Th1和Th17的產(chǎn)生，降低體外單核細胞分泌IFN-g和TNF-α可降低免疫細胞的激活[30]。初步實驗觀察表明，在一些模型中，IL-12p40缺乏的小鼠對實驗誘導的自身免疫疾病具有抵抗力，包括結(jié)腸炎[31]。

人類IL-12和IL-23的p40亞單位由三個結(jié)構(gòu)域(D)組成，即D1～D3，其中兩個域(D2和D3)參與IL-12p35和IL-23p19的結(jié)合，基于烏司奴單抗Fab區(qū)與人IL-12復合的晶體結(jié)構(gòu)，烏司奴單抗的結(jié)合表位位于p40亞單位的D1結(jié)構(gòu)域，在空間上與IL-12p35和IL-23p19相距甚遠。突變分析證實，D1內(nèi)的氨基酸殘基是烏司奴單抗結(jié)合所必需的。通過等溫滴定量熱法分析，烏司奴單抗與IL-12和IL-23的結(jié)合強度相等。烏司奴單抗不能結(jié)合與細胞表面IL-12Rb1受體復合物結(jié)合的IL-12或IL-23細胞因子，因此不太可能在具有IL-12或IL-23受體的細胞中促進補體或抗體介導的細胞毒性。這些研究確定了烏司奴單抗與IL-12/23p40之間精確的特異性和分子相互作用[32]。

3 討論

近年來隨著生物制劑的深入研究及在炎癥性腸病中的廣泛應用，烏司奴單抗作為CD中的一種治療方法，為治療CD帶來更多的新前景。烏司奴單抗的獨特之處在于它能靶向IL-12/23炎癥通路。因此，對于那些以前用免疫調(diào)節(jié)劑、類固醇皮質(zhì)激素或腫瘤壞死因子拮抗劑治療失敗或不耐受的患者，提供了一種替代作用機制的治療選擇。然而仍需要進行更多大樣本、多中心的隨機對照臨床試驗研究烏司奴單抗對CD的治療作用，從而更好地指導臨床治療，提高CD患者的預后及生活質(zhì)量。