陳曉依 趙靖宇 陳樹春

1.河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，張家口，075000，中國

2.河北省人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，石家莊，050051，中國

3.華北理工大學(xué)研究生學(xué)院，唐山，063210，中國

2015 年國家衛(wèi)計委提出的《中國疾病預(yù)防控制工作進展報告》中指出：慢性病已經(jīng)成為我國居民頭號健康威脅，其中糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥、心腦血管疾病等已成為主要死亡原因。近年來，伴隨著分子檢測技術(shù)的快速發(fā)展，外泌體在慢性病中的調(diào)控作用和臨床診療日益受到研究者的關(guān)注。

外泌體（exosomes）是細胞主動分泌到微環(huán)境中的，體積較小、具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞外囊泡，可自由通過各種生理屏障，其內(nèi)含有的蛋白、核酸和脂質(zhì)等可調(diào)節(jié)靶細胞的生物學(xué)功能，參與細胞間通訊及免疫調(diào)節(jié)，在各種生理及病理過程中具有重要作用。外泌體在體液中廣泛分布，如：血液、尿液、腦脊液、羊水、乳汁及唾液等。其中尿液具有樣本量多、取樣方便且穩(wěn)定性高等多種優(yōu)點，相對于其他體液是更理想的各種疾病生物標(biāo)記物的來源［1］。最新研究表明，尿外泌體參與了慢性病（糖尿病、高尿酸血癥、高血壓、心肌損傷、阿爾茨海默病、帕金森綜合征等）的發(fā)生發(fā)展，同時對尿外泌體中蛋白質(zhì)、核酸及脂類的檢測對疾病的早診斷、早治療和預(yù)后判斷有很大的幫助［2］。因此，本文就尿外泌體在代謝性疾病及心腦血管疾病中的最新研究進展作一綜述，并探討其相關(guān)調(diào)控機制。

1 尿外泌體

1.1 外泌體的信息交流方式

外泌體是來源于細胞的膜性小泡，目前認為外泌體與靶細胞有3 種作用方式［3-4］：①外泌體可直接與靶細胞膜融合；②外泌體通過與細胞膜表面的受體相互作用進入細胞內(nèi)，并刺激靶細胞及其下游的信號通路；③外泌體能被靶細胞內(nèi)吞進入胞內(nèi)，并在靶細胞內(nèi)重新被釋放或經(jīng)溶酶體途徑降解。

1.2 尿外泌體的組成成分

尿外泌體是最早由Pisitkun 等用超速離心法分離純化得到的，并用全液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析揭示了正常人尿外泌體含有295 種蛋白質(zhì)，隨著技術(shù)的進步，Wang 等［5］利用多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)對尿外泌體進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果鑒定出3 280 種蛋白質(zhì)，其中9 個人之間有31%的重疊，即共同含有1 000 多種蛋白質(zhì)，為未來的研究提供了可靠的參考價值。尿外泌體攜帶母細胞來源的特異性蛋白，如Wilms’腫瘤基因-1（wilms’tumor-1，WT1）、近曲小管的3 型Na-H 交換 器（Na+/H+-exchanger 3，NHE3）、水通道蛋白-1、髓袢升支粗段的2 型Na-K-2Cl 共轉(zhuǎn)運體（Na+-K+-2Clcotransporter 2，NKCC2）、遠曲小管的Na-Cl 共轉(zhuǎn)運體（Na-Clcotransporter，NCC）和集合管的上皮鈉通道（epithelial sodium channel，ENaC）等。因此檢測尿外泌體攜帶的組織特異性蛋白質(zhì)能反映靶細胞現(xiàn)階段的狀態(tài)、病變部位及程度［6］。此外，外泌體中還含有蛋白、核酸（miRNA、mRNA、lncRNA、DNA）、脂質(zhì)等活性分子。因尿外泌體的蛋白質(zhì)或RNA 在不同疾病中的表達不同，且具有穩(wěn)定性高、敏感性強的特征，從而成為診斷疾病理想的標(biāo)記物，甚至有可能成為未來靶向治療的載體。

2 尿外泌體在代謝性疾病中的應(yīng)用

2.1 糖尿病

糖尿病是一組以血糖水平高為主要表現(xiàn)的內(nèi)分泌代謝性疾病，其并發(fā)癥可危及生命。最近的研究證明，尿外泌體與糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生關(guān)系密切，尤其在糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）方面。大多數(shù)研究認為高血糖和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）參與了DN 的關(guān)鍵信號通路及基因表達。Wang 等［7］發(fā)現(xiàn)，腎小球系膜細胞在高糖環(huán)境下比正常環(huán)境下分泌的外泌體更多，且外泌體中含的TGF-β1 mRNA 更高，其可激活足細胞內(nèi)磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 通路，誘導(dǎo)足細胞凋亡及黏附抑制。Abe H［8］對糖尿病患者尿外泌體中WT1 蛋白的表達進行了檢測，發(fā)現(xiàn)WT1 蛋白隨患者腎功能的降低反而上升，并可對糖尿病患者腎小球足細胞的損傷進行有效反映，提示尿外泌體可作為DN 早期診斷的非侵入性標(biāo)記物。研究還指出，尿外泌體中WT1 蛋白mRNA 水平可預(yù)測DN 患者腎小球濾過率的下降速度。此外，研究發(fā)現(xiàn)尿外泌體中miR-362-3p、miR-877-3p、miR-150-5p 和miR-15a-5p 可作為DN 早期的無創(chuàng)標(biāo)記物［9］。

2.2 高尿酸血癥

研究發(fā)現(xiàn)尿外泌體源性microRNA 在高尿酸血癥的診斷中也起到重要的作用。胡艷艷等［10］檢測了高尿酸血癥患者尿液外泌體microRNA 的表達，與正常對照組相比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10 種已知 microRNA 表達差異（P<0.05），其 中miRNA-32 表達上 調(diào)，而miR-1246、miR-3615、miR-1、miR-204、miR-126、miR-320d、miR-320c、miR-3158、miR-6510 表達下調(diào)，提示以上尿外泌體攜帶的microRNAs 可能參與了高尿酸血癥的發(fā)生發(fā)展，將來有可能成為高尿酸血癥有價值的生物標(biāo)記物。然而該研究納入的人群較少，需要大量的臨床試驗研究證實，同時需要深入的研究進一步探討尿外泌體源性的microRNA 在高尿酸血癥的作用及潛在的調(diào)節(jié)機制，為高尿酸血癥發(fā)病機制的研究提供參考。

3 尿外泌體在心血管系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）引起30% 以上的全球死亡人數(shù)。在CVD 患者中，活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生會增加。Agudiez 等［11］首次對CVD 患者和正常對照的尿外泌體代謝組學(xué)進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CVD 患者的尿外泌體中4-氨基馬尿酸水平比正常人升高，而N-1 甲基煙酰胺和檸檬酸水平降低。其中4-氨基馬尿酸水平增加可能與較高 ROS 產(chǎn)生及炎癥有關(guān)，而N-1 甲基煙酰胺具有血管舒張?zhí)匦裕砂l(fā)揮抗血栓和抗炎作用，成為動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的分子指標(biāo)。檸檬酸水平降低可使三羧酸循環(huán)代謝失調(diào)，促進蛋白尿的產(chǎn)生，進而導(dǎo)致頑固性高血壓，甚至可能加重CVD 患者慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）的發(fā)生。綜上，尿外泌體的代謝產(chǎn)物含量可以預(yù)測心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險。實驗證明尿液作為CVD 生物標(biāo)記物的來源研究具有很大潛力。

3.1 高血壓

高血壓能造成嚴(yán)重的心血管疾病，引發(fā)了全球的關(guān)注。有原發(fā)性高血壓和繼發(fā)性高血壓，其中原發(fā)性高血壓的病因不明確，研究發(fā)現(xiàn)遺傳、內(nèi)皮功能障礙、血管重塑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活等均與高血壓的發(fā)生有關(guān)，但其分子機制依然不明確。最近研究表明，高血壓的發(fā)生、發(fā)展中尿外泌體起著重要作用。

目前，尿源性外泌體在高血壓中的研究相對于循環(huán)外泌體的研究多，可能是尿液中的外泌體由腎及泌尿生殖道各種上皮細胞分泌，且大多數(shù)蛋白-鈉轉(zhuǎn)運體位于腎上皮的頂端質(zhì)膜上［12］。研究顯示，尿外泌體內(nèi)鈉轉(zhuǎn)運蛋白與高血壓密切相關(guān)。尿外泌體內(nèi)含有NHE3、NKCC2、NCC 和ENaC，以上轉(zhuǎn)運蛋白在維持電解質(zhì)平衡及血壓調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。這些轉(zhuǎn)運蛋白的改變會導(dǎo)致特殊類型高血壓的發(fā)生，如假性醛固酮增多癥、醛固酮增多癥?；颊吣蛲饷隗w的磷酸化水平比正常人明顯升高，其機制在醛固酮的作用下，促進腎的鈉轉(zhuǎn)運體上的NCC 和ENaC 蛋白磷酸化并移位到尿外泌體內(nèi)，提示尿外泌體可作為高血壓疾病的一種新的無創(chuàng)性診斷標(biāo)記物［13］。Perez-Hernandez 等［14］通過比較大量的高血壓患者與正常人尿液樣本發(fā)現(xiàn)，尿外泌體miR-26a 水平與蛋白尿呈負相關(guān)，提示尿外泌體miR-26a 可能是研究高血壓早期腎損傷的潛在有用工具。此外，大多數(shù)研究表明高血壓患者尿外泌體的miR-615、miR-211、miRNA-29a-3p、miRNA-193a-5p 等多種miRNAs 對血壓波動較敏感，并且被認為是尿外泌體中所特有的，提示尿外泌體的miR-615、miR-211、miRNA-29a-3p、miRNA-193a-5p 可以作為是血壓鹽敏感性和逆鹽敏感性的新型標(biāo)記物［15-16］。

3.2 心肌損傷

心肌損傷可誘導(dǎo)心肌細胞死亡。近年來，外泌體miRNA 作為缺血性心臟病的診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物，成為了缺血性心臟病研究熱點之一。microRNAs（miRNAs）是一種小的（<24 個核 苷酸）RNA，具有很強的生物學(xué)功能。研究顯示，尿液中存在外泌體miRNAs，它們來源于泌尿生殖以外的細胞，經(jīng)血液循環(huán)到達腎臟，最終以尿外泌體的形式排出體外［17］。血清及尿液外泌體中多種miRNAs，在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者表達顯著升高，如miR-1、miR-208、miR-194、miR-34a 及miR-499，其中miR-34a、miR-194 與AMI 患者合發(fā)右心衰關(guān)系顯著。研究證實了心臟釋放的miRNAs 可以通過腎釋放進入尿液，提示尿外泌體中的miR-1、miR-194、miR-208、miR-34a 及miR-499 可能代表了一組新的缺血性心臟病的尿液生物標(biāo)記物［18］。

4 尿外泌體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

4.1 阿爾茨海默病

阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是以記憶減退合并認知障礙為特征的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。AD的發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前認為與β淀粉樣蛋白參與形成淀粉樣老年斑、Tau 蛋白過度磷酸化聚集成雙螺旋變成神經(jīng)纖維纏結(jié)及神經(jīng)功能退行性病變等密切相關(guān)，外泌體則參與了β淀粉樣蛋白和Tau 蛋白在機體內(nèi)的代謝、轉(zhuǎn)運等過程［19］。目前對阿爾茨海默癥尿外泌體蛋白質(zhì)組學(xué)的報道并不多，吳利等［20］首次采用液壓透析與超高速離心兩種方法聯(lián)合提取分離AD 患者尿液外泌體，并通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法對AD 患者與對照組尿外泌體的差異蛋白進行分析，提出與機體炎癥相關(guān)的尿外泌體alpha-1-antichymotrypsin、ceruloplasmin、protein S100-A8、protein S 100-A9 與細胞骨架相關(guān)的尿外泌體annexin A2 等五個蛋白可作為AD 的生物標(biāo)記物。

4.2 帕金森病

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）成為排名第二的老年人常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明PD 典型病理改變是路易氏體的形成，而α-核突觸蛋白（alphasynuclein，α-Syn）是其主 要成分［21］。α-Syn 可能通過富亮氨酸重復(fù)激酶2（leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2）介導(dǎo)的自噬和細胞內(nèi)吞途徑致病，而LRRK2基因的表達被證實與外泌體的合成和分泌有關(guān)［21］：LRRK2 與內(nèi)吞蛋白Rab5b 可互相作用調(diào)節(jié)內(nèi)體囊泡轉(zhuǎn)運。在PD 患者的尿液中可以檢測到LRRK2 蛋白外泌體，這表明LRRK2 蛋白的分泌又依賴于外泌體。

目前，有關(guān)PD 認知障礙的尿液生物標(biāo)記物研究較少，F(xiàn)raser 等［22］收集了79 例已排除LRRK2 基因突變的PD 患者和79 例健康受試者的尿液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD 患者尿外泌體磷酸化LRRK2 水平高于健康受試者，且磷酸化 LRRK2 水平越高，PD 患者認知功能及日常活動能力越差。而Ho 等［23］在PD 患者尿外泌體未檢測到α-Syn，且發(fā)現(xiàn)PD 患者尿外泌體中的DJ-1 和LRRK2蛋白與健康受試者無明顯差異，男性PD 患者尿外泌體中DJ-1 蛋白水平較男性健康受試者增高，但尿外泌體中的DJ-1 蛋白是否可作為男性PD 患者的候選生物標(biāo)記物，需要不斷探索和研究。

5 總結(jié)和展望

尿外泌體作為慢性疾病的新型診斷標(biāo)記物具有很多優(yōu)勢，尿外泌體攜帶有特異性的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)，它的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)可以保護內(nèi)部循環(huán)的miRNA、mRNA、DNA 片段及功能性蛋白等活性物質(zhì)，取樣容易且穩(wěn)定存在于尿液中，因此可用作各系統(tǒng)疾病的診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物［1］。近年來，雖然尿外泌體在各系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中取得一定的成果，但在臨床應(yīng)用方面仍然面臨著很多挑戰(zhàn)，需要更高效、更標(biāo)準(zhǔn)化的外泌體分離和鑒定技術(shù)。提取尿外泌體有差速超速和密度梯度離心法等，這些提取方法還有許多不足，如產(chǎn)量低、耗時長等。但隨著對尿外泌體在慢性疾病研究中的不斷深入及分子檢測技術(shù)的飛速發(fā)展，尿外泌體作為新型生物標(biāo)記物在慢性疾病的早期診斷和預(yù)后評估必然發(fā)揮關(guān)鍵作用，甚至有可能成為疾病診療的新方向。