王舒怡 徐 進(jìn) 葛婉悅 王佑華 張玉平 吳靖芳

1 河北北方學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，張家口，075000，中國

2 河北北方學(xué)院，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)，張家口，075000，中國

胃潰瘍（gastric ulcer）是臨床常見的消化道疾病，主要由于黏膜上皮保護(hù)性因子和損傷因子不平衡所致。常見損傷因素有幽門螺桿菌感染、長期服用阿司匹林或其他非甾體抗炎藥及飲酒、吸煙等［1］。胃潰瘍患者除了特征性腹痛外，常伴有胃腸運(yùn)動(dòng)減弱、胃節(jié)律性活動(dòng)下降、排空時(shí)間延長，從而導(dǎo)致胃內(nèi)酸性食糜滯留，影響胃黏膜屏障的修復(fù)［2-3］。胃腸道廣泛分布著P 物 質(zhì)（substance P，SP）和其受 體（neurokinin 1，NK-1），并通過促進(jìn)乙酰膽堿（acetylcholine，ACh）活性，促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)，使其蠕動(dòng)增強(qiáng)［4］。胃潰瘍導(dǎo)致全層P 物質(zhì)免疫陽性物質(zhì)較正常胃組織的減少，并且能夠抑制其受體活性、改變受體數(shù)量。通過使用NK1 受體拮抗劑，抑制 P 物質(zhì)和 NK1 受體之間的相互作用來預(yù)防胃潰瘍患者的惡心和嘔吐［5-6］，減輕其臨床癥狀。實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍愈合過程P 物質(zhì)/NK1 受體信號(hào)通路改變及意義未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過建立實(shí)驗(yàn)性大鼠胃潰瘍模型，研究胃腸功能運(yùn)動(dòng)及胃黏膜SP 的變化，為SP/NK1在實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍愈合中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

雄性SD 大鼠，62 只，體質(zhì)量180～230 g，購自北京維通利華科技有限公司。按隨機(jī)數(shù)字表法分為實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍組32 只、鹽水組24 只和正常組6 只，分籠常規(guī)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的各項(xiàng)操作嚴(yán)格遵循動(dòng)物倫理學(xué)的基本原則和各項(xiàng)規(guī)定。

1.1.2 試劑

生理鹽溶液（physiological saline solution，PSS 溶液），P 物質(zhì)、乙酰膽堿，均購自上海澤葉生物科技有限公司；Aprepitant，NK1 受體拮抗劑，均購自西格瑪奧德里奇公司；SP 試劑盒、DAB 顯色劑，均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器

CJA12300P 分析天平，北京高信儀器設(shè)備有限公司；SDC-6 低溫恒溫槽，Power Lab 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，澳大利亞埃德儀器；四腔器官灌流系統(tǒng)，成都儀器廠；張力換能器，澳大利亞埃德儀器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型制備［7］

造模前，各組大鼠禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛（0.3 mL·100 g-1）腹腔注射麻醉，常規(guī)消毒，開腹，暴露胃幽門部，潰瘍組注射10 μL 冰醋酸至近胃竇處的黏膜下層，造成實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍［1-2］。鹽水組注射等量生理鹽水代替冰醋酸，操作同潰瘍組。正常組不加任何處理。各組動(dòng)物相同條件下飼養(yǎng)。在手術(shù)后4、10、14、28 d 時(shí)處死大鼠，進(jìn)行相應(yīng)胃功能檢測及免疫組化實(shí)驗(yàn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取材潰瘍組8 只，鹽水組6 只，正常組6 只。

1.2.2 離體胃幽門肌條功能的測定［8］

將胃兩端結(jié)扎，置于37 ℃水浴加熱的PSS 液中漂洗干凈，分離寬約2 mm 的幽門環(huán)形肌，將肌條與張力換能器相連，置于加有PSS 液的四腔灌流浴槽掛鉤，37℃下持續(xù)供應(yīng) 95% O2和 5% CO2的混合氣體，每20 min 換灌流液一次，Power Lab 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)記錄肌條的收縮運(yùn)動(dòng)。給張力換能器1 g 的初始張力，平衡1 h，基線穩(wěn)定后，間隔30 min 依次加入ACh、SP 和NK1 受體阻斷劑，以肌條的規(guī)律自發(fā)收縮波作為對(duì)照，觀察不同工具藥物對(duì)肌條收縮的影響。

1.2.3 胃潰瘍愈合過程中潰瘍的變化

大鼠頸椎脫臼處死，打開腹腔，結(jié)扎胃兩端并沿胃大彎剖開胃腔，測量模型組大鼠的潰瘍面積以及深度，拍照記錄潰瘍病灶的大體形態(tài)，并對(duì)不同時(shí)相模型組、鹽水組以及正常組大鼠的胃壁進(jìn)行比較。

1.2.4 胃排空率及肌腸推進(jìn)功能測定［9］

大鼠禁食12 h，不限制飲水。用灌胃針吸取2 mL 1.5%甲基纖維素酚紅溶液灌胃并記錄酚紅灌胃量。30 min 后處死大鼠，剖腹，結(jié)扎賁門和幽門，取出整個(gè)胃，稱重；沿胃大彎剪開，使用蒸餾水充分清洗胃內(nèi)容物，測量空胃重量，計(jì)算出實(shí)測酚紅殘留量。胃排空率=（1-實(shí)測酚紅殘留量/標(biāo)準(zhǔn)酚紅灌胃量）×100%。同時(shí)迅速取幽門括約肌至回腸末端腸段置于生理鹽水潤濕的平板上，輕輕剝離脂肪組織，不加任何牽引力使其平鋪，迅速測量大鼠幽門括約肌至酚紅推進(jìn)前端的距離及全腸距離，計(jì)算大鼠腸推進(jìn)率。腸推進(jìn)率=（腸內(nèi)酚紅推進(jìn)距離/全腸長度）×100%。

1.2.5 免疫組織化學(xué)檢測胃黏膜SP 表達(dá)

石蠟切片常規(guī)脫蠟置水，枸櫞酸緩沖液（pH=6.0）微波熱修復(fù)，3%甲醇-H2O2去除內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗（1∶100），4 ℃孵育過夜，次日滴加生物素化二抗，室溫30 min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，室溫 30 min，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照。參照楊松林計(jì)算積分光密度值（integrated optical density，IOD）［10］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用ANOVA 單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 法，以P<0.05 為有顯著性差異。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 潰瘍大體觀變化

術(shù)后d 4，大鼠胃潰瘍形成率為100%，在大鼠胃體前壁明顯可見直徑均為4 mm 以上，面積為20 mm2左右的潰瘍，其深度在3～4 mm 之間。潰瘍邊緣光整，呈典型的“環(huán)堤征”，周圍組織水腫明顯。術(shù)后d 10，仍可見潰瘍，但直徑減小到4 mm 以下，面積為12 mm2左右，深度在2～3 mm 之間，潰瘍周邊光滑，胃黏膜扁平。至14 d，潰瘍直徑縮小到3 mm 以下，潰瘍面積低于9 mm2，潰瘍處與周圍黏膜分界不清楚，手感較硬，為瘢痕修復(fù)所致。28 d 時(shí)，胃壁基本無潰瘍，整體胃黏膜恢復(fù)正常，詳見Fig.1。

Fig.1 Macroscopic view of ulcer

2.2 胃幽門環(huán)形肌功能測定結(jié)果

胃潰瘍d 4、14 肌條收縮振幅及頻率均明顯低于正常組（P<0.05，P<0.01），至28 d，肌條收縮振幅和頻率有較大提高，但收縮頻率仍低于正常組（P<0.05），并缺乏正常的蠕動(dòng)波形，提示潰瘍導(dǎo)致胃蠕動(dòng)的異常，詳見Fig.2。

Fig.2 Frequency and amplitude of pylorus annulus muscle contraction in different groups

2.3 SP 和ACh 對(duì)離體胃幽門環(huán)形肌收縮功能的影響

SP 以及ACh 均可引起正常組、鹽水組和潰瘍組離體肌條收縮幅度和收縮頻率升高（Tab.1、Tab.2）。但胃潰瘍d 4、10、14 肌條收縮振幅和收縮頻率低于正常組及鹽水組（P<0.05，P<0.01）。胃潰瘍d 28，胃肌條功能與對(duì)照組接近。

Tab.1 Changes of pyloric annular muscle contraction amplitude during ulcer healing

Tab.2 Frequency of pyloric annular muscle contraction during ulcer healing

2.4 SP 和NK1 受體拮抗劑對(duì)離體胃幽門環(huán)形肌收縮功能的影響

正常組加入P 物質(zhì)后，胃幽門環(huán)形肌收縮幅度增加，再加入NK1 受體拮抗劑后，胃幽門環(huán)形肌收縮幅度大幅度下降（P<0.05，P<0.01），說明P 物質(zhì)主要通過NK1 受體相關(guān)的信號(hào)通路影響胃幽門環(huán)形肌收縮功能（Fig.3）。

Fig.3 Effect of SP/NK1 receptor antagonist on the contractile function of pyloric annular muscle

2.5 胃排空和腸蠕動(dòng)的結(jié)果

與正常組和鹽水組相比較，模型組的胃排空率和腸推進(jìn)率明顯低于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）；在模型組潰瘍愈合的過程中，隨著潰瘍時(shí)間的延長，胃排空率和腸推進(jìn)率逐漸上升，最后達(dá)到正常水平（Tab.3、Tab.4）。

Tab.3 Gastric emptying rate during ulcer healing

Tab.4 Propulsion rate of ulcer healing midgut

2.6 免疫組織化學(xué)法檢測胃黏膜SP 表達(dá)變化

SP 陽性蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色。正常組大鼠胃黏膜SP 蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，位于黏膜胃底腺細(xì)胞和肌間神經(jīng)叢神經(jīng)元胞體，呈棕黃色（Fig.4A）。潰瘍組4 d SP 陽性細(xì)胞顯著減少，弱陽性（Fig.4B，Tab.5）（P<0.01）。隨潰瘍術(shù)后時(shí) 間的延長SP 表達(dá)呈漸增趨勢，潰瘍14、28 d SP 陽性信號(hào)逐漸增強(qiáng)（Fig.4C、D）。積分光密度分析顯示：潰瘍4、14 d SP表達(dá)水平降低，與正常組及相應(yīng)鹽水組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.01），潰瘍28 d SP 陽性信號(hào)接近對(duì)照組（Fig.4D）。

Tab.5 Comparison of integrated optical density（IOD）values of SP positive signals in gastric mucosa

Fig.4 Expression of SP in gastric wall（immunohistochemistry）×100

3 討論

胃潰瘍的發(fā)生與炎癥、飲食、壓力等因素有關(guān)，是常見的消化系統(tǒng)疾病，可見穿透黏膜肌層或其以下的壞死病灶，愈合過程也十分復(fù)雜，包括壞死物的清除、基底部肉芽組織生長、進(jìn)而纖維化及黏膜再生、上皮重構(gòu)等過程［7］。實(shí)驗(yàn)性大鼠胃潰瘍模型是用乙酸直接腐蝕胃壁組織出現(xiàn)潰瘍，是胃潰瘍動(dòng)物模型常用、成熟的實(shí)驗(yàn)方法，能夠模擬人胃潰瘍形成的病理過程。本實(shí)驗(yàn)成功建立乙酸胃潰瘍實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停谖笣冃纬杉坝显缙谥锌梢娢概趴章屎湍c推進(jìn)率減弱，說明大鼠消化道運(yùn)動(dòng)功能降低，隨著潰瘍病灶的愈合，大鼠的胃壁結(jié)構(gòu)逐漸修復(fù)，胃排空率和腸推進(jìn)率隨之上升。食物進(jìn)入胃內(nèi)，引起胃運(yùn)動(dòng)加強(qiáng)，從而使得胃內(nèi)壓升高，當(dāng)胃內(nèi)壓大于十二指腸內(nèi)壓時(shí)，食糜即由胃進(jìn)入十二指腸。當(dāng)食糜進(jìn)入腸道后，刺激腸壁神經(jīng)，引起腸道肌肉收縮。整個(gè)消化過程都需要通過胃腸肌肉的收縮來完成［11］。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在潰瘍形成d 4，胃幽門環(huán)形肌肉的收縮振幅和頻率大幅下降，說明此時(shí)胃腸肌肉功能受到潰瘍影響，胃排空率和腸推進(jìn)率最弱，而此時(shí)潰瘍面積最大，并且深達(dá)肌層。隨著潰瘍愈合至d 14，肌層基本修復(fù)，幽門環(huán)肌收縮頻率、振幅增加，收縮功能部分恢復(fù)，此時(shí)免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，SP 的免疫陽性細(xì)胞光密度值增加，提示功能調(diào)節(jié)與潰瘍愈合程度的進(jìn)展與SP 釋放增加有關(guān)。此后隨著時(shí)間進(jìn)展，潰瘍面積減小、消失，胃幽門環(huán)形肌的收縮振幅和頻率在逐漸上升并接近正常值，證明胃腸肌肉功能的逐漸恢復(fù)。同時(shí)胃排空率和腸推進(jìn)率也逐漸上升并有接近正常值的趨勢。

SP 是一種具有廣泛生物活性的腦腸肽激素，可由神經(jīng)細(xì)胞和腸胃內(nèi)分泌的細(xì)胞產(chǎn)生和分泌；與ACh 一樣是消化道中興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，通過調(diào)節(jié)胃腸道平滑肌的興奮性促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)［12］。神經(jīng)激肽受體在生物體內(nèi)廣泛分布，主要有3 種：NK1R、NK2R 和NK3R，SP 是NK1R 內(nèi)源性的高親和力和高選擇性配體。NK1 受體亦表達(dá)于平滑肌細(xì)胞和ICC［13］。SP/NK1R 系統(tǒng)在哺乳動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布，參與多種生理和病理過程［12］。SP 和ACh 對(duì)各組胃運(yùn)動(dòng)節(jié)律具有有效的調(diào)節(jié)作用，說明實(shí)驗(yàn)中離體肌條新鮮、活力好，可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在胃潰瘍形成及愈合過程中，大鼠胃運(yùn)動(dòng)節(jié)律失常，胃腸肌肉的收縮幅度以及收縮頻率均下降，肌肉活性降低，但是在采集到各階段的肌肉收縮活動(dòng)波形后加入SP 和ACh，肌肉的收縮振幅都有大幅度的提升，潰瘍組肌條對(duì)SP 反應(yīng)性更為明顯，提示胃運(yùn)動(dòng)功能發(fā)生障礙與同期免疫組化結(jié)果中SP 陽性信號(hào)減弱有關(guān)。而在加入NK1 受體拮抗劑后，收縮幅度及頻率顯著降低，說明SP 通過作用于平滑肌NK1 受體調(diào)節(jié)胃腸肌肉收縮活動(dòng)，提高肌肉胃運(yùn)動(dòng)節(jié)律的產(chǎn)生，從而使得收縮幅度顯著增加，與張先俊等對(duì)結(jié)腸平滑肌的研究結(jié)果一致［14］。

潰瘍愈合過程胃黏膜SP 陽性信號(hào)隨潰瘍愈合逐漸增強(qiáng)，促進(jìn)胃酸分泌和胃運(yùn)動(dòng)，與胃排空和腸推進(jìn)功能逐漸增強(qiáng)，功能不斷恢復(fù)的情況一致。NK1 受體阻滯劑CP-99994 可以通過調(diào)節(jié)迷走神經(jīng)背運(yùn)動(dòng)核的胃動(dòng)力和胃相關(guān)神經(jīng)元活性來改善順鉑引起的嘔吐［15］。NK1 受體拮抗劑L703606 抑制胃酸分泌［16］。羅伊氏乳桿菌DSM 通過降低SP 的含量降低了氧化應(yīng)激，對(duì)乙醇誘導(dǎo)的胃損傷有保護(hù)作用［17］。SP 通過恢復(fù)缺血性創(chuàng)面的血流和血管網(wǎng)形成，能加速傷口愈合，并且在缺血性小鼠中通過抑制炎癥介導(dǎo)的脾腫大和減少腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表現(xiàn)出抗炎作用［18］?？梢?，SP/NK1 受體軸在大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍愈合過程中發(fā)揮了一定的作用，有助于后續(xù)進(jìn)一步研究下游信號(hào)通路。