周璐瑾 崔思瑤 陳素艷 李喜龍 劉俊杰 閆珂 王瑾潔 王文棟 常曉彤

河北北方學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，張家口，075000，中國(guó)

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）通常由高血壓、高血脂和動(dòng)脈粥樣硬化引發(fā)，在臨床上主要表現(xiàn)為心悸、眩暈、紫紺、呼吸困難和卒中等癥狀［1］，且通常伴有較多并發(fā)癥，嚴(yán)重危害人類健康。我國(guó)CVD 發(fā)病率高，死亡率位居首位。隨著我國(guó)人口老齡化與社會(huì)城鎮(zhèn)化進(jìn)程的發(fā)展，我國(guó)心血管疾病危險(xiǎn)因素流行趨勢(shì)明顯［2］，防治問(wèn)題刻不容緩。

炎癥反應(yīng)對(duì)心血管疾病有顯著影響［3-4］。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是最早被鑒定出與心血管疾病有關(guān)的免疫細(xì)胞，在動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)含有少量的激活B 細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞以及大量的單核巨噬細(xì)胞和激活T 淋巴細(xì)胞［5］。單核細(xì)胞具有明顯的異質(zhì)性，依據(jù)其表面分子白細(xì)胞分化抗原14（cluster of differentiation antigen 14，CD14）和CD16 的表達(dá)水平可劃分為經(jīng)典型（CD14++CD16-）、中間型（CD14++CD16+）和非經(jīng)典型（CD14+CD16++）三種單核細(xì)胞nianfu 亞群，且三種單核細(xì)胞亞群可相互轉(zhuǎn)化［6］。中間型單核細(xì)胞亞群參與了腦缺血性中風(fēng)和心臟栓塞等心血管疾病的發(fā)病過(guò)程［7］，在預(yù)后不良冠心病患者體內(nèi)含量顯著升高，有望作為治療冠心病的靶細(xì)胞［8-9］。單核細(xì)胞表面CD14 蛋白含量的變化機(jī)制對(duì)各單核細(xì)胞亞群之間的轉(zhuǎn)化具有極其重要的意義［10］。

CD14 基 因位于人類5 號(hào)染色 體5q23-31 區(qū)，其編碼產(chǎn)物蛋白具有2 種形式，一種是膜結(jié)合型CD14（membrane-bound CD14，mCD14），通過(guò)糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，nian’fuGPI）錨定結(jié)合于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性白細(xì)胞的膜外側(cè)；另一種是可溶型CD14（soluble CD14，sCD14），游離在血漿中［11］。CD14 蛋白可作為許多微生物產(chǎn)物受體，與相應(yīng)配體結(jié)合激活單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等，分泌細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，調(diào)控黏附因子的表達(dá)，加速蛋白質(zhì)糖化產(chǎn)物的形成并導(dǎo)致其在血管內(nèi)堆積，引起血管平滑肌細(xì)胞的增生和動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚［12］。由此可見(jiàn)，CD14 在炎癥、動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，但其在心血管疾病中的分子遺傳機(jī)制尚不清楚。已知CD14 基因存在-159C/T（rs2569190）多態(tài)性位點(diǎn)，TT 純合子的sCD14 水平明顯高于CC 和CT 基因型的攜帶者，且干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和白介素4（interleukin 4，IL-4）反應(yīng)分別與血清sCD14 水平呈正相關(guān)和負(fù)相關(guān)［13］。本研究利用生物信息學(xué)方法、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP）和測(cè)序等技術(shù)對(duì)CD14 基因及其編碼產(chǎn)物進(jìn)行分析，研究CD14 基因-159C/T 位點(diǎn)多態(tài)性與心血管疾病的關(guān)系，從而探討CVD 的分子遺傳機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料及其來(lái)源

收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院心血管疾病患者血漿標(biāo)本75 例，其中男性患者42 例，女性患者33例；健康對(duì)照組125 例，包括男性患者80 例，女性患者45 例，每人采靜脈血5 mL。本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意，且所有納入者均知情同意。從Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）查詢獲得人CD14_HUMAN（P08571）蛋白序列［14］。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取及目的片段擴(kuò)增

根據(jù)全血基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)，采用SMA4000UV-Vis 超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定儀測(cè)定DNA含量與純度。根據(jù)測(cè)得的DNA 濃度配制50 μL 的PCR 體系（10×PCR Buffer 10 mmol·L-15 μL；dNTP 2.5 mmol·L-14 μL；上游引 物5′-ATCATCCTTTTCCCACACC-3′10 μmol·L-13 μL；下游引 物5′-AACTCTTCGG CTGCCTCT-3′ 10 μmol·L-13 μL；模 板DNA，濃 度為400 ng/DNA；200 μmol·L-1的Tap 酶 0.25 μL；最后蒸餾水補(bǔ)足至50 μL），進(jìn)行基因擴(kuò)增（95 度預(yù)變性10 min，94 度變性40 s，61 度退火40 s，72 度延伸1 min；重復(fù)35 個(gè)循環(huán)，72 度補(bǔ)平10 min，4 ℃保存），產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果通過(guò)Oemge 紫外投射儀進(jìn)行檢驗(yàn)，理論目標(biāo)條帶為296 bp。

1.2.2 產(chǎn)物酶切及鑒定

根據(jù)PCR 產(chǎn)物，進(jìn)行酶切。HaeⅢ酶識(shí)別和切割位點(diǎn)序列為GGCC，若位點(diǎn)序列改變，則無(wú)法切割。HaeⅢ酶37 ℃下反應(yīng)3 h 后，產(chǎn)物經(jīng)3.5%瓊脂糖凝膠電泳，紫外投射儀檢驗(yàn)，根據(jù)所得結(jié)果進(jìn)行分型。理論目標(biāo)條帶：CC 型為152 bp 和141 bp 兩條帶；CT 型為296 bp、152 bp 和141 bp 三條帶，TT 型為296 bp 一條帶。將PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果，確定最終分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)正常對(duì)照組和CVD患病組的CD14 基因型對(duì)比情況進(jìn)行卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，其中，年齡分布的計(jì)量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05，表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 生物信息學(xué)分析

1.4.1 人CD14 蛋白理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)分析

利用生物信息學(xué)分析工具（Tab.1）分析CD14 基因分析蛋白的理化性質(zhì)、親疏水性、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)其二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估。

Tab.1 Bioinformatics analysis tools

1.4.2 人CD14 蛋白互作分析及基因功能注釋

使 用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/）［15］挖掘以人CD14 蛋白為中心結(jié)點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape 軟件v3.6.1 版本［16］完成可視化，篩選出關(guān)聯(lián)基因。然后使用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（Visualization，Annotation and Integrated Analysis，https：//david.ncifcrf.gov）［17］對(duì)CD14 和關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行富集分析，找出顯著富集的生物學(xué)功能注釋（P≤ 0.05 和 Count ≥4 genes）［18］。

2 結(jié)果

2.1 酶切檢測(cè)基因型結(jié)果

PCR 產(chǎn)物酶切后，電泳結(jié)果如Fig.1A、B 所示，測(cè)序鑒定結(jié)果見(jiàn)Fig.1C、D、E，據(jù)此區(qū)分三種不同的基因型。

Fig.1 CD14 gene PCR product sequencing results and enzyme digestion results

基因型分布頻率見(jiàn)Tab.2，等位基因分布頻率見(jiàn)Tab.3。用χ2檢驗(yàn)分析患病組和正常對(duì)照組等位基因頻率及基因型有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以及是否符合Hardy-Weinberg 平 衡。對(duì)照組 和患病 組CD14-159C/T（rs2569190）基因多態(tài)性分布頻率符合 Hardy-Weinberg平衡。Tab.2 中，TT 基因型分布頻率在患病組（56%）和正常對(duì)照組（40.8%）之間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。Tab.3 顯示，對(duì)照組和患病組之間等位基因頻率也存在顯著差異（P<0.05）。結(jié)果提示，心血管疾病與CD14-159C/T（rs2569190）等位基因有關(guān)聯(lián)。

Tab.2 CD14 genotype comparison between normal control group and diseased group

Tab.3 Comparison of CD14 allele frequency between normal control group and diseased group

2.2 CD14 蛋白的生物信息分析

2.2.1 理化性質(zhì)分析結(jié)果

CD14 基因編碼蛋白序列由375 個(gè)氨基酸殘基組成，原子總數(shù)為5 669 個(gè)，分子總質(zhì)量為40 kDa，總分子式為C1770H2858N498O526S17。在組成蛋白的所有氨基酸中Leu 占比最高（16.5%），Tyr 含量最低（0.5%）。負(fù)電荷殘基數(shù)大于正電荷殘基數(shù)，為酸性蛋白。蛋白質(zhì)具備弱親水性，沒(méi)有明顯的疏水區(qū)段，所以可以推測(cè)CD14 蛋白沒(méi)有跨膜區(qū)，并且已有研究結(jié)果表明mCD14 通過(guò)GPI 錨定結(jié)合在細(xì)胞膜上，符合跨膜區(qū)預(yù)測(cè)工具的分析結(jié)果［19］。詳細(xì)內(nèi)容見(jiàn)Fig.2。已知人體CD14 成熟蛋白有2 種存在形式：膜結(jié)合型和血漿游離型，詳細(xì)見(jiàn)Tab.4 和Tab.5。

Tab.4 Analysis of physicochemical properties of human CD14 gene encoding protein

Tab.5 Hydrophilicity/ hydrophobicity analysis of human CD14 gene encoding protein

Fig.2 Hydrophilicity/ hydrophobicity analysis of protein encoded by CD14 gene（Kety and Doolittle algorithm）

2.2.2 人CD14 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和隱馬可夫模型兩種算法預(yù)測(cè)CD14 信號(hào)肽，結(jié)果一致，CD14 蛋白具有信號(hào)肽，為分泌蛋白，詳細(xì)數(shù)據(jù)見(jiàn)Tab.6。

Tab.6 Human CD14 protein signal peptide prediction

2.2.3 CD14 蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

采用亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)工具TargetP1.1 和WoLF PSORT，均表明人CD14 蛋白是種分泌蛋白，定位于細(xì)胞外基質(zhì)（Tab.7）。

Tab.7 Prediction of human CD14 protein subcellular localization

2.2.4 人CD14 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用SOPMA 在線預(yù)測(cè)工具對(duì)人CD14 蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。SOPMA 預(yù)測(cè)結(jié)果表明人CD14 蛋白α螺旋（alpha helix）占整段蛋白序列的39.73%，β折疊（extended strand，β sheet）占比為12.27%（Fig.3）。

Fig.3 Human CD14 Secondary Structure Prediction（SOPMA）

2.2.5 同源建模法預(yù)測(cè)CD14 三級(jí)結(jié)構(gòu)并進(jìn)行模型質(zhì)量評(píng)估

根據(jù)人CD14 蛋白序列在SWISS-MODEL 在線測(cè)序工具搜索預(yù)測(cè)模板，結(jié)果得到了PDB ID 為 4glp.1.A的預(yù)測(cè)模型，相似度為99.68%，GMQE 值為0.74，選用模板可靠性高。選用4glp.1.A 作為模板，而后用同源建模法得到Fig.4A。將得到的模型PDB 文件上傳至SAVES v5.0 平臺(tái)上進(jìn)行在線評(píng)估。Fig.4B 是拉曼圖來(lái)源于SWISS-MODEL，用于對(duì)模型的質(zhì)量評(píng)估，評(píng)估結(jié)果顯示95%以上的氨基酸殘基都在合理的區(qū)域范圍即Cα的二面角合理，表明該結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。3D-1D 得分結(jié)果表明有88.39%的氨基酸殘基3D-1D 得分大于等于0.2，高于80%氨基酸殘基大于等于0.2 的標(biāo)準(zhǔn)，并且Fig.4C 顯示低分部分較少，表明模型質(zhì)量合格，三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。

Fig.4 The use of homology modeling method to predict the tertiary structure of CD14 protein and its model quality evaluation results display

2.2.6 人CD14 互作網(wǎng)絡(luò)及關(guān)聯(lián)基因的功能注釋

利用STRING 在線分析工具和Cytoscape 軟件挖掘出以人CD14 基因編碼蛋白為中心節(jié)點(diǎn)的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化，發(fā)現(xiàn)有10 個(gè)與CD14 互作的蛋白分別為：TLR2、LBP、LY96、ITGAM、ITGB2、MYD88、PLCG2、TLR1、TLR4、TLR6。其中CD14 蛋白與TLR4 基因關(guān)聯(lián)最緊密（Fig.5A）。使用DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)將CD14 與關(guān)聯(lián)基因進(jìn)行生物學(xué)功能注釋，篩選最顯著富集的生物學(xué)功能注釋（P-value≤0.05 和Count≥4 genes）見(jiàn)Fig.5B，細(xì)胞對(duì)脂蛋白的反應(yīng)（cellular response to lipoteichoic acid），細(xì)胞因子分泌的調(diào) 節(jié)（regulation of cytokine secretion），Toll 樣受體信號(hào)通路（toll-like receptor signaling pathway），白細(xì)胞介素6 產(chǎn)生的正調(diào)控（positive regulation of interleukin-6 production），對(duì)脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide），Toll 樣受體4 信號(hào)通路（toll-like receptor 4 signaling pathway），脂多糖介導(dǎo)的信號(hào)通路（lipopolysaccharidemediated signaling pathway），腫瘤壞死因子產(chǎn)生的正調(diào)控（positive regulation of tumor necrosis factor production），MyD88 依賴的Toll 樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（MyD88-dependent toll-like receptor signaling pathway），炎癥反應(yīng)（inflammatory response），先天免疫反應(yīng)（innate immune response），質(zhì)膜（plasma membrane），脂多糖結(jié)合（lipopolysaccharide binding），受體活性（receptor activity），其中CD14 在Toll 樣受體4 信號(hào)通路和MyD88 依賴的Toll 樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用最強(qiáng)。

Fig.5 CD14 interacting protein and its functional annotation

3 討論

單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是影響個(gè)體對(duì)疾病遺傳易感的重要遺傳因素［21］，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CD14-159C/T（rs2569190）等位基因TT的基因型與心血管疾病患者之間存在相關(guān)性，即TT 型患者心血管病發(fā)病率高于CT 型和CC 型。CD14 基因-159C>T（rs2569190）基因位點(diǎn)的改變可能影響心血管疾病的發(fā)生。

CD14 蛋白無(wú)跨膜區(qū)，完整CD14 序列有375 個(gè)氨基酸殘基，mCD14 有326 個(gè)氨基酸殘基，從第20位氨基酸殘基開(kāi)始以第345 位氨基酸殘基結(jié)束，并且第345 位氨基酸殘基為天冬酰胺，是糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）的錨定結(jié)合位點(diǎn)，并且將CD14 通過(guò)GPI 錨定在單核細(xì)胞的核膜上，sCD14有348 個(gè)氨基酸殘基，從第20 位至第367 位氨基酸殘基，完整序列20 位氨基酸殘基之前為蛋白質(zhì)信號(hào)肽，367 位氨基酸殘基之后的蛋白序列在蛋白成熟后被切除。mCD14 分子分布在巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞和中間粒細(xì)胞的表面，單核細(xì)胞可依據(jù)其表面CD14 和CD16 表達(dá)水平劃分為不同亞群，并且Chang 等證實(shí)存在通過(guò)減少mCD14 分子水平而增加sCD14 分子水平的生物過(guò)程［22］，這也為單核細(xì)胞不同亞群之間相互轉(zhuǎn)換提供理論支持。其中CD14 在中間型單核細(xì)胞上高表達(dá)，并且中間型單核細(xì)胞含量增加常伴隨有患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)［23］。

CD14 是一種存在于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原，由DAVID 富集通路結(jié)果可知，CD14 蛋白分子所參與的細(xì)胞組分是質(zhì)膜，CD14 的分子功能是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的受體，當(dāng)LPS 與mCD14 結(jié)合時(shí)向單核細(xì)胞傳遞信號(hào)，刺激單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、IL-1 等細(xì)胞因子，以及能夠促進(jìn)單核細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附作用［24-25］，而且異常的單核細(xì)胞的黏附和聚集很可能是急性心肌梗死和動(dòng)脈硬化的發(fā)病原因［26］，單核細(xì)胞分泌的炎癥因子如TNF、IL-1 等可以正向調(diào)節(jié)CD14 基因，這將導(dǎo)致更高水平的CD14。DAVID 富集通路結(jié)果顯示，與CD14 具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的生物學(xué)過(guò)程有Toll 樣受體4 信號(hào)通路和MyD88 依賴的Toll 樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，CD14 是LPS 的受體，其與 LPS 特異性結(jié)合后，可通過(guò)Toll 樣受體4 以及MD2 蛋白向下游傳遞激活信號(hào)，從而啟動(dòng)單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（mononeuclear phagocyte system，MPS），并釋放多種炎性細(xì)胞因子發(fā)生一系列反應(yīng)［25］，Kim 的小鼠TLR4 基因敲除實(shí)驗(yàn)同樣得到了相同的結(jié)論，TLR4 作用增強(qiáng)與動(dòng)脈壁炎癥的發(fā)生具有強(qiáng)關(guān)聯(lián)［27］。LPS 誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌炎癥因子，阻遏CD14分子功能就可防止或中止發(fā)生LPS 性炎癥反應(yīng)等病理反應(yīng)。并且CD14 在病原相關(guān)模式分子（pathogenassociated molecular patterns，PAMP）如細(xì)菌LPS 等刺激下被單核-巨噬細(xì)胞高表達(dá)，再激活體內(nèi)單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等靶細(xì)胞，使其釋放炎癥因子，引發(fā)炎癥反應(yīng)，正向調(diào)節(jié)CD14 的表達(dá)，并形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致心血管疾病的發(fā)生［28-31］。

綜上所述，基于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)CD14 蛋白的理化性質(zhì)和功能，CD14 基因表達(dá)水平升高可能在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用；CD14 基因-159C/T（rs2569190）基因位點(diǎn)多態(tài)性與心血管疾病發(fā)生密切相關(guān)，其原因可能是TT 純合子突變影響了CD14 基因的表達(dá)。因此，借助CD14 基因多態(tài)性和異常表達(dá)的篩查及早發(fā)現(xiàn)易患心血管疾病的人群，并盡早的進(jìn)行預(yù)防，對(duì)于提升人民健康水平具有重大意義。