王錦鋒， 秦紅霞

（鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔預(yù)防科，河南 鄭州 450000）

牙周病是口腔疾病中最常見(jiàn)的一種，主要包括牙齦炎和牙周炎兩大類(lèi)。牙齦炎指病變部位在局部牙齦的上皮及結(jié)締組織內(nèi)，未引起其他部位病變的一類(lèi)疾病。當(dāng)牙齦炎沒(méi)有得到及時(shí)的治療，炎癥蔓延至結(jié)締組織深層，造成牙周纖維結(jié)締組織降解，牙槽骨不同程度的吸收和牙齒病理性移位甚至脫落等癥狀，即為牙周炎。牙周炎的發(fā)生嚴(yán)重降低患者的生活質(zhì)量，也是目前我國(guó)成年人失牙的主要原因[1]。

目前，針對(duì)牙周炎的治療措施主要包括牙周基礎(chǔ)治療、新技術(shù)輔助治療和藥物治療三個(gè)方面?；A(chǔ)治療和新技術(shù)輔助治療通常只能達(dá)到清潔刮治牙周表面的作用，無(wú)法完全清除病原微生物入侵牙周組織引起的感染和炎癥，需要藥物治療進(jìn)行補(bǔ)充。治療牙周炎的藥物主要包括口腔局部藥物和全身藥物。局部用藥以抗菌為主，配合超聲潔治和刮治，通過(guò)較深層部位的局部和持續(xù)給藥，提高基礎(chǔ)治療的作用[2]。

中醫(yī)學(xué)以辯證理論為基礎(chǔ)對(duì)牙周炎進(jìn)行治療，內(nèi)外兼顧不僅能夠抗菌消炎，還能提高自身免疫力，受到學(xué)者們的重視[3]。葛根素（Puerarin，C21H20O9）是豆科植物野葛[（Pueraria lobata(Willd.)Ohwi）]的干燥根中最主要的活性成分之一，屬于異黃酮類(lèi)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，葛根素同時(shí)具有抗炎、骨保護(hù)等活性且具有較高的生物安全性。本課題采用正畸鋼絲結(jié)扎和牙齦卟啉菌感染的方法建立慢性牙周炎小鼠模型，通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)小鼠牙周組織的生長(zhǎng)情況及外周血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎癥指標(biāo)濃度的變化，研究葛根素對(duì)慢性牙周炎小鼠的治療作用。并進(jìn)一步通過(guò)蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）實(shí)驗(yàn)來(lái)探究葛根素治療慢性牙周炎的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12周齡的健康C57BL/6J雄性小鼠共40只，體質(zhì)量為22～25 g，由上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[動(dòng)物許可證號(hào):SCXK（滬）2019-0009]。購(gòu)入小鼠后，在飼養(yǎng)室內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1周，自由進(jìn)水、進(jìn)食。飼養(yǎng)室內(nèi)空氣流通、環(huán)境整潔，室溫22～24℃，相對(duì)濕度約為50%，每日光照及黑暗時(shí)間各12 h。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 葛根素（批號(hào)110752-201814）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，批號(hào)1800308）購(gòu)自阿拉丁試劑（上海）有限公司；注射用0.9%氯化鈉溶液（批號(hào)1802260703）和水合氯醛（分析純，批號(hào)20190126）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；牙齦卟啉菌液由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系鑒定和提供；緩沖液、十二烷基磺酸鈉 （sodium dodecyl sulfate，SDS）、30%聚丙烯酰胺、Tris（pH 8.8與pH 6.8）、10×電泳液、50×TAE、ECL發(fā)光顯影液均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D Systems公司；p38MAPK和P-p38MAPK抗體（一抗）來(lái)自美國(guó)Abcam生物科技公司；標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）的甘油醛-3-磷酸脫氫 酶 （glyceraldehyde-3-phosphate dehyolrogenase，GAPDH）抗體來(lái)自美國(guó)Sigma生物科技公司；脂多糖（lipopdysaccharide，LPS）和蛋白提取試劑盒購(gòu)自索萊寶生物科技有限公司。

1.2.2 主要儀器設(shè)備 牙齦分離器、牙周探針等手術(shù)器械（杭州奧索醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)）；直徑0.2 mm的正畸結(jié)扎鋼絲（杭州奧索醫(yī)療器械有限公司，中國(guó)）；Read Max1900型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Bio Tek公司，加拿大）；DYY-1C型凝膠成像系統(tǒng)（北京六一儀器廠，中國(guó)）；TE77XP型半干轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)（Hoefer公司，美國(guó)）；PowerPack HV型電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)）；熒光顯微鏡（Nikon公司，日本）；KZ-III-F型低溫高速組織研磨器（武漢塞維爾生物科技有限公司，中國(guó)）；低溫型高速離心機(jī)（Beckman公司，美國(guó)）。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物建模與分組 實(shí)驗(yàn)小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后進(jìn)行隨機(jī)分組，每組8只，共分為對(duì)照組、模型組、葛根素低劑量組、葛根素中劑量組、葛根素高劑量組。建立慢性牙周炎小鼠模型：除對(duì)照組外，用新鮮配置的已過(guò)濾的10%水合氯醛溶液按照0.01 mL/g的劑量對(duì)其余各組小鼠進(jìn)行腹腔注射的全身麻醉。麻醉成功后，將小鼠置于超凈工作臺(tái)中固定，用牙齦分離器剝離小鼠左側(cè)上頜第一磨牙處的牙齦組織，使局部牙齦受到刺激產(chǎn)生炎性水腫，以便進(jìn)行結(jié)扎操作。剝離操作每天1次，連續(xù)進(jìn)行2 d。從建模第3天起，用0.2 mm正畸結(jié)扎鋼絲將小鼠右側(cè)上頜第一、第二磨牙的牙頸部進(jìn)行牢固結(jié)扎，截?cái)喽嘤嘣z，將鋼絲末端盡量向牙根方向靠近并壓入齦溝內(nèi)部，每天檢查結(jié)扎的情況，確保扎絲長(zhǎng)期牢固，避免出現(xiàn)松動(dòng)。分別在建模第3、5、7和9天時(shí)，將2μL牙齦卟啉菌液和15μL 1 mg/mL的LPS 0.9%氯化鈉溶液均勻注射到小鼠的牙周。建模3周后進(jìn)行灌胃給藥。將葛根素混懸于0.5%的CMC-Na溶液中進(jìn)行灌胃給藥，葛根素低、中、高劑量組小鼠的灌胃劑量分別為150、300、600 mg/kg，灌胃容積為0.03 mL/g。對(duì)照組和模型組小鼠灌胃給藥等量0.5%的CMC-Na溶液，給藥溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，每天1次，共治療2周。

1.3.2 ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度 每組小鼠用10%的水合氯醛麻醉后進(jìn)行眼底取血，血樣靜置于離心管中，禁止振蕩，4℃離心5 min，離心半徑為7.5 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，取上清液用于后續(xù)試驗(yàn)檢測(cè)。取出冰箱中的ELISA試劑盒恢復(fù)至室溫后，按照酶聯(lián)免疫試劑盒操作說(shuō)明書(shū)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定血清樣品在450 nm處的吸光度值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.3.3 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá) 各實(shí)驗(yàn)組小鼠取血清后用脊椎脫臼法進(jìn)行處死，置于超凈工作臺(tái)上固定后，用75%的乙醇擦拭唇周及口腔，分離上頜骨，用已滅菌的解剖剪取左側(cè)上頜骨第一、第二磨牙周?chē)l緣以下2 mm的牙齦及牙周組織，在磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）中清洗2遍，并剪成細(xì)小的碎片。將每組小鼠的組織碎片均勻混合一起，于-4℃的條件下用組織研磨器進(jìn)行研磨，用組織蛋白抽提試劑盒進(jìn)行蛋白提取。采用蛋白質(zhì)定量（bicin choninic acid，BCA）法測(cè)定各組樣品的蛋白濃度，計(jì)算并制備含等量蛋白的樣品。每組樣品按蛋白量的5∶1加入上樣緩沖液（loading buffer）并煮沸定性，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

制作十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電脈（sodium dodecyl sulfate ployacryl mide gel electropho resis，SDS-PAGE）凝膠進(jìn)行電泳分離蛋白質(zhì)，然后用半干轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。在5%的脫脂奶粉中封閉1 h，用PBS在搖床上洗膜3次，每次10 min。用一抗進(jìn)行封閉，一抗的濃度分別為p38MAPK（1∶1 000）、P-p38MAPK（1∶1 000），4℃下進(jìn)行孵育過(guò)夜。次日用PBST（磷酸鹽緩沖液）在搖床上洗膜3次，每次10 min。加入與一抗種屬對(duì)應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，在低速搖床上室溫孵育1 h。用PBST洗膜3次，方法同上。使用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色發(fā)光，凝膠成像系統(tǒng)拍照，用Image Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，以GAPDH作為內(nèi)參，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，Quantity One軟件進(jìn)行圖像分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠臨床表現(xiàn)及牙周組織生長(zhǎng)情況

對(duì)照組小鼠牙齦表面呈現(xiàn)淡粉色，質(zhì)地堅(jiān)韌、富有彈性，探診時(shí)無(wú)出血現(xiàn)象。模型組小鼠出現(xiàn)牙周炎癥狀，牙齦有明顯紅腫、肥大，牙齦組織松軟，甚至出現(xiàn)潰瘍現(xiàn)象，探診出血明顯，并伴有自發(fā)出血傾向。葛根素低劑量組小鼠的牙齦有中度的炎性癥狀，出現(xiàn)發(fā)紅、光亮和腫脹現(xiàn)象，牙周探診有輕微出血。與模型組比較，葛根素中、高劑量組小鼠牙周炎癥狀明顯改善，牙齦顏色和形態(tài)有輕微不明顯變化，牙周探診無(wú)出血現(xiàn)象。

2.2 各組大鼠外周血清中TNF-α、IL-1β和IL-6濃度測(cè)定

與對(duì)照組比較，模型組小鼠外周血清中TNFα、IL-1β和IL-6濃度顯著高（P<0.01）。與模型組比較，葛根素低、中、高劑量組小鼠體內(nèi)血清中TNFα、IL-1β和IL-6的濃度顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠外周血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平比較Figure 1 The peripheral serum levels of TNF-α,IL-1β,and IL-6 in mice in each experimental group

2.3 Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組小鼠牙周組織中p38MAPK和P-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.001）。與模型組比較，葛根素低、中、高劑量組小鼠牙周組織中P-p38MAPK蛋白的表達(dá)量顯著降低（P＜0.01）；葛根素低、中、高劑量組小鼠牙周組織中p38MAPK蛋白的表達(dá)量降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠牙齦及牙周組織中P-p38MAPK和p38MAPK蛋白的表達(dá)Figure 2 Effect of Puerarin on the expression of the Pp38MAPK and p38MAPK protein in mice periodontal tissue

3 討論

慢性牙周炎發(fā)生發(fā)展的主要致病因素為局部刺激和細(xì)菌感染。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎法結(jié)合細(xì)菌感染建立慢性牙周炎小鼠模型。首先，在進(jìn)行結(jié)扎之前牙齦剝離是為了模擬牙齦的局部刺激，造成牙周軟組織的急性水腫，便于進(jìn)行結(jié)扎操作。其次，結(jié)扎材料選擇正畸結(jié)扎鋼絲取代常規(guī)的線結(jié)扎法，能夠保證結(jié)扎的牢固性。鋼絲末端深入齦溝內(nèi)部，容易造成食物嵌塞，為后期牙周炎發(fā)生、發(fā)展創(chuàng)造了必要基礎(chǔ)條件。除此之外，牙菌斑生物膜細(xì)菌及其產(chǎn)物是慢性牙周炎的始動(dòng)因子，與慢性牙周炎關(guān)系密切[4]。牙齦卟啉菌屬于革蘭陰性厭氧菌，也是目前研究最廣且證據(jù)充分的重要的牙周致病菌之一[5]。LPS是革蘭陰性菌外膜中的主要結(jié)構(gòu)成分，具有廣泛的生物活性，也是引起牙周炎重要的毒力作用因子之一[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)在建模的第3、5、7和9天進(jìn)行牙周注射牙齦卟啉菌液和LPS 0.9%氯化鈉溶液，能夠?qū)⒀乐苤虏【ㄖ苍谒拗鞯倪m當(dāng)部位，抑制或逃避了宿主的防御功能，從而引起牙齒支持組織的慢性炎癥及破壞[7]。

慢性牙周炎與全身系統(tǒng)性疾病具有密切聯(lián)系，由于慢性牙周炎患者的牙周組織處于慢性炎癥的持續(xù)感染狀態(tài)，造成血清中炎癥指標(biāo)也隨之上升[8]。TNF-α是活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的具有多種生物學(xué)活性的糖蛋白及多功能的炎性因子，具有多種免疫調(diào)節(jié)功能。研究[9-12]表明，TNF-α能夠激活前破骨細(xì)胞成熟為破骨細(xì)胞，減少骨基質(zhì)鈣化，最終引起牙槽骨吸收，與牙周炎發(fā)生和牙周炎的破壞程度密切相關(guān)。另外，牙周致病菌還可以通過(guò)其他途徑分泌IL-6和TNF-α[13]。細(xì)胞因子IL-6和TNF-α能夠發(fā)揮協(xié)同作用，共同參與牙槽骨的吸收和破壞。細(xì)胞因子IL-1β作為機(jī)體免疫功能的重要判斷指標(biāo)，不僅在基礎(chǔ)免疫研究方面具有重要的作用，在探索疾病發(fā)病機(jī)制和療效判斷等方面也具有重要的應(yīng)用價(jià)值[14]。本研究中選取實(shí)驗(yàn)小鼠血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6作為檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)果顯示以上炎癥指標(biāo)均顯著升高，表示慢性牙周炎小鼠建模成功。

p38MAPK是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)最重要的成員之一，在細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和器官發(fā)育等許多方面[15]。當(dāng)受到細(xì)菌、脂多糖、滲透性應(yīng)激和生理性應(yīng)激時(shí)，p38MAPK能夠被激活而發(fā)生核轉(zhuǎn)位，即從細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而對(duì)許多轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶進(jìn)行磷酸化，從而發(fā)揮激活的作用[16]。激活的p38MAPK即P-p38MAPK，其活性增強(qiáng)，能夠激動(dòng)激活轉(zhuǎn)錄因子1和2、肌細(xì)胞增強(qiáng)因子，促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌，促進(jìn)和增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[17]。Western Blot研究結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，模型組小鼠牙周組織細(xì)胞中p38MAPK和P-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，葛根素低、中、高劑量組小鼠牙周組織細(xì)胞中的p38MAPK和P-p38MAPK蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。該結(jié)果表明，葛根素經(jīng)灌胃后能夠通過(guò)抑制p38MAPK的磷酸化，從而使其活性降低，進(jìn)而減少促炎因子分泌，降低TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，減輕炎癥反應(yīng)，緩解小鼠的牙周炎癥狀。

綜上所述，葛根素能顯著減輕慢性牙周炎小鼠的炎癥反應(yīng)，改善牙周炎癥狀，而且其可能通過(guò)p38MAPK信號(hào)通路發(fā)揮治療作用。