秦鵬，柏玉冰，唐鋒，李洪權(quán)（.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，長沙 40007；2.株洲市食品藥品檢驗所，湖南 株洲 42000）

葉下珠為大戟科葉下珠屬植物葉下珠Phyllanthus urinariaL.的干燥全草，收載于各地方標準，性微苦、涼，歸肝、脾經(jīng)，具有清熱、利濕、解毒、消腫的功效[1-4]。葉下珠含有木脂素[5]、香豆素[6]、萜類[7-8]、黃酮[9]、酚酸[10]、有機酸[11]、生物堿[12]等成分，具有抗病毒[13]、抗腫瘤[14]、抗菌[15]、抗氧化[16]及護肝[17]等藥理作用。

根據(jù)已有活性研究可知，抗病毒的作用成分為柯里拉京等[18]，抗菌的作用成分為柯里拉京、沒食子酸和原兒茶酸等[19-20]，抗腫瘤的作用成分為柯里拉京、蘆丁、槲皮素和山柰酚等[21-23]，抗氧化的作用成分為柯里拉京、沒食子酸、原兒茶酸、槲皮素和山柰酚等[24-26]，護肝的作用成分為短葉蘇木酚等[27]。

為準確把握葉下珠的用法用量，對這些功效成分進行含量測定是必不可少的。目前已有研究中對這些成分建立了含量測定方法[28-33]，但這些方法仍有可改進之處，如在分析多成分時為達到一定分離度，信號采集時間較長[28-29]；單次分析成分數(shù)量較少[30-32]；方法靈敏度不高[33]等。這些都可能影響含量測定的高效性和準確性。而基于質(zhì)荷比分析的色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法幾乎不依賴于峰與峰之間的分離度，信號采集時間短，靈敏度高[34]，可優(yōu)化上述問題。且目前尚未發(fā)現(xiàn)有基于此方法對葉下珠中上述功效成分進行含量測定的相關(guān)報道。

因此，本研究特基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法建立葉下珠中7 種功效成分的含量測定方法，以期更高效、準確地測定其含量。

1 材料

1.1 試藥

槲皮素（純度：97.4%，批號：100081-200907）、山柰酚（純度：95.9%，批號：110861-200808）、蘆丁（純度：90.5%，批號：100080-200707）、原兒茶酸（純度：99.9%，批號：110809-201205）、沒食子酸（純度：91.5%，批號：110831-201906）（中國食品藥品檢定研究院）；柯里拉京（北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，純度：98.0%，批號：A0647）；短葉蘇木酚（長沙誠邦生物科技有限公司，純度：98.0%，批號：20032403）；乙腈、甲醇（色譜純，霍尼韋爾有限公司）；甲酸、乙酸銨（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。葉下珠樣品信息見表1。所有批次藥材經(jīng)株洲市食品藥品檢驗所胡冠宇主管藥師鑒定均為大戟科葉下珠屬植物葉下珠Phyllanthus urinariaL.的干燥全草。所有批次藥材均經(jīng)粉碎后過4 號篩，備用。

表1 樣品信息Tab 1 Information of sample

1.2 儀器

XSE 205DV 電子天平（精度：0.01 mg，梅特勒托利多儀器有限公司）；HNS-SY-150 超聲波儀（40 kHz，400 W，北京恒奧德儀器儀表有限公司）；Agilent 1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；QTRAP 4500 三重四極桿質(zhì)譜（上海愛博才思分析儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用 Welch xtimate C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），以含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫（0～6 min，10%→85%B；6～8 min，85%→95%B；8～8.5 min，95%→10%B；8.5～10.0 min，10%B），流速0.8 mL·min－1，采集時間為10 min，柱溫為30℃，進樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源（ESI），負離子掃描，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），離子源溫度：550 ℃，電噴霧電壓：－4500 V，氣簾氣：35.0 psi，離子源氣1：55 psi，離子源氣2：55 psi，碰撞氣：氬氣。各成分的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 負離子模式下7 種成分的保留時間及質(zhì)譜參數(shù)Tab 2 Retention time and UPLC-MS/MS parameters of the 7 components in the neagtive ion mode

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品儲備液 精密稱取不同質(zhì)量的柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸、沒食子酸對照品，置25 mL 棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得。經(jīng)含量折算，上述各對照品的質(zhì)量濃度分別為0.500、0.260、0.130、0.500、0.320、0.700、0.300 mg·mL－1。對照品總離子流和提取離子色譜圖見圖1。

圖1 葉下珠混合對照品總離子流和提取離子色譜圖Fig 1 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of Phyllanthus urinaria L.mixture reference

2.3.2 供試品溶液 取葉下珠粉末（粉碎后過4 號篩），置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇溶液40 mL，稱量，超聲（400 W，40 kHz）提取20 min，靜置至室溫，再稱量，用70%甲醇溶液補足減失的量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。葉下珠樣品總離子流和提取離子色譜圖見圖2。

圖2 葉下珠樣品總離子流和提取離子色譜圖Fig 2 Total ion current chromatogram and extracted ion chromatogram of Phyllanthus urinaria L.sample

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取“2.3.1”項下混合對照品儲備液適量，用70%甲醇溶液稀釋得系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液（柯里拉京：0.500～50.0 μg·mL－1；短葉蘇木酚：0.0260～2.60 μg·mL－1；槲皮素：0.001 30～0.130 μg·mL－1；山柰酚：0.005 00～0.500 μg·mL－1；蘆?。?.320～32.0 μg·mL－1；原兒茶酸：0.007 00～0.700 μg·mL－1；沒食子酸：0.300～30.0 μg·mL－1），按“2.1”和“2.2”項下條件進行測定，以質(zhì)量濃度C（ng·mL－1）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，計算7 個成分的線性回歸方程，結(jié)果見表3。

表3 線性關(guān)系結(jié)果(n＝7)Tab 3 Linearity of the 7 components (n＝7)

2.4.2 精密度試驗 取混合對照品溶液，按照“2.1”和“2.2”項下條件分別連續(xù)進樣6 次，記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒食子酸峰面積的RSD分別為0.65%、0.88%、0.72%、0.89%、0.76%、0.60%和0.73%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗 取同一批樣品（1 號樣品），稱取6 份，按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒食子酸峰面積的RSD分別為1.0%、1.2%、1.3%、1.5%、1.2%、1.4%和1.4%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批樣品（1 號樣品）的供試品溶液，分別于0、2、4、8 和12 h 進樣分析，記錄各成分峰面積并計算RSD。結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為2.0%、2.0%、2.0%、1.8%、2.5%、2.1%和1.9%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 加樣回收試驗 取已知含量的樣品（1 號樣品）6 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別加入絕對含量接近0.5 g 藥材所含含量的對照品溶液后，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，進樣分析，計算加樣回收率，結(jié)果柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒食子酸的平均回收率分別為98.6%、103.8%、100.4%、101.3%、100.8%、99.6%和98.1%，RSD分別為1.6%、1.3%、1.7%、2.2%、1.8%、2.0%和1.6%，表明本方法回收率良好。

2.5 樣品測定

精密稱取6 批次不同批號的葉下珠各2 份，分別按照“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”和“2.2”項下條件進樣測定，代入線性回歸方程計算7 種成分含量，結(jié)果見表4。

表4 6 批次樣品7 種成分的含量(μg·g－1，n＝2)Tab 4 Contents of the 7 components in 6 batches of samples (μg·g－1，n＝2)

3 討論

3.1 供試品溶液制備條件考察

3.1.1 提取溶劑的比較 本研究比較了30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇作為提取溶劑，以7 種成分的峰面積大小為判斷依據(jù)，確定最佳提取溶劑。結(jié)果當(dāng)甲醇濃度為70%時，7 種成分的峰面積均達到最大值。因此，選擇70%甲醇為提取溶劑。

3.1.2 提取時間的比較 本研究比較了10、20和30 min 的提取時間，以7 種成分的峰面積不再增加為判斷依據(jù)，確定最佳提取時間。結(jié)果7 種成分均在提取20 min 時達到最大值。而當(dāng)提取時間為30 min 時，部分成分含量不增反降，尤其是原兒茶酸和沒食子酸，這可能是由于隨著超聲時間的增加，水溫升高，促使部分酚酸被氧化。因此，20 min 為最佳提取時間。

3.1.3 提取體積的比較 本研究比較了30、40和50 mL 的提取體積，以7 種成分的峰面積與其提取所加入溶劑體積的乘積達到上限為判斷依據(jù)，確定最佳提取體積。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)提取體積為40 mL 時，其峰面積與提取時所加入溶劑的體積的乘積已經(jīng)達到上限，因此，40 mL 為最佳提取體積。

3.2 色譜條件優(yōu)化

3.2.1 色譜柱的選擇 本研究比較了兩種不同的色譜柱，Welch Xtimate C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）和Thermo Acclaim 120 C18（4.6 mm×150 mm，5 μm），以7 種成分的分子離子峰的保留性和峰形等因素為判斷依據(jù)，確定更為合適的色譜柱。根據(jù)試驗結(jié)果，兩款色譜柱均獲得了較為合適的保留時間和較好的峰形，但仍有區(qū)別。當(dāng)使用Thermo Acclaim 120 C18柱時，原兒茶酸、沒食子酸、短葉蘇木酚和柯里拉京峰稍有前延，槲皮素和山柰酚峰稍有拖尾；而當(dāng)使用Welch Xtimate C18色譜柱，峰形均未出現(xiàn)峰拖尾和前延的現(xiàn)象。因此，選擇Welch Xtimate C18色譜柱較為合適。

3.2.2 流動相系統(tǒng)的選擇 本研究比較了3 種不同的流動相系統(tǒng)，包括乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液和乙腈-含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，以7 種成分的分子離子峰的峰形為判斷依據(jù)，確定更為合適的流動相系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇乙腈-水作為流動相時，槲皮素、沒食子酸稍有拖尾；當(dāng)選擇乙腈-0.1%甲酸溶液水作為流動相時，短葉蘇木酚稍有拖尾；而選擇以乙腈-含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液作為流動相時，峰形均較為對稱。因此，選擇乙腈-含10 mmol·L－1乙酸銨的0.1%甲酸水溶液較為合適。

3.2.3 水相起始比例的選擇 本研究比較了水相90%、70%和50% 3 種不同起始比例，以7 種成分的分子離子峰的峰形為判斷依據(jù)，確定最佳水相起始比例。發(fā)現(xiàn)不同起始比例情況下，峰形差異較大。當(dāng)水相起始比例為90%時，各峰峰形較好；當(dāng)起始比例降低至70%時，7 種成分的峰形變差，出現(xiàn)不同程度的峰前延和拖尾現(xiàn)象；當(dāng)降低至50%時，峰前延和拖尾現(xiàn)象加劇，尤其是原兒茶酸、沒食子酸的峰前延和槲皮素、山柰酚峰拖尾現(xiàn)象，甚至，柯里拉京出現(xiàn)峰分叉的現(xiàn)象。因此，選擇90%的水相作為起始比例較為合適。

3.3 總結(jié)

綜上，基于上述供試液制備條件的考察、色譜條件的優(yōu)化、質(zhì)譜參數(shù)的建立及方法學(xué)考察等，本研究首次建立了葉下珠中柯里拉京、短葉蘇木酚、槲皮素、山柰酚、蘆丁、原兒茶酸和沒食子酸7 種成分的UPLC-MS/MS 含量測定方法。本方法的完成，可更為高效、準確地測定葉下珠中多種成分的含量，為基于這些成分的葉下珠藥用價值開發(fā)奠定了研究基礎(chǔ)。