崔楠，朱小丹，花仲首，張景宏

本溪市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，遼寧本溪117000

宮頸癌是僅次于乳腺癌的第二大常見女性惡性腫瘤，也是第三大最常見的惡性腫瘤，每年導(dǎo)致265 700人死亡［1-2］。近年來隨著宮頸癌篩查手段的提升和乳頭瘤病毒的覆蓋率擴(kuò)大，早期診斷率顯著提高，但患者晚期生存率僅40%，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是限制療效和預(yù)后較差的重要因素，因此迫切需要了解宮頸癌內(nèi)在機(jī)制，以發(fā)展新的抗癌策略［3］。非編碼RNAs是一類不編碼蛋白質(zhì)的RNA，其可通過調(diào)節(jié)各種基因表達(dá)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［4-5］。同源盒基因D—反義鏈1（HOXD-AS1）是HOXD基因簇中的一種反義lncRNA，其在胃癌、甲狀腺癌等實(shí)體腫瘤中呈高表達(dá)，作為癌基因參與腫瘤發(fā)生發(fā)展［6-7］。微小RNA-133a-3p（miR-133a-3p）是一種高度保守的miRNA，其參與調(diào)控胃癌和骨肉瘤等實(shí)體腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等行為［8］。有研究［9］發(fā)現(xiàn)，lncRNA HOXD-AS1可以介導(dǎo)miR-133a-3p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡。因此，猜測(cè)lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達(dá)可能參與宮頸癌癌癥進(jìn)展，然而兩者與宮頸癌的關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。2015年1月—2017年12月，我們觀察了宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p的表達(dá)變化，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本溪市中心醫(yī)院收治的宮頸癌患者92例，年齡38～83（57.68±8.63）歲；≥60歲53例、<60歲39例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后（根治性或姑息性切除）病理檢查確診為宮頸癌；②初次確診，術(shù)前未接受任何內(nèi)分泌、放化療者；③臨床資料完整者；④患者及家屬均知情研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤者；②嚴(yán)重心、肝、腎等臟器疾病者；③血液系統(tǒng)疾病者；④全身感染性疾病者；⑤血液系統(tǒng)疾病者；⑥妊娠及哺乳婦女。病理類型：75例鱗癌，17例腺癌；腫瘤直徑：≥3 cm 50例，<3 cm 42例；腫瘤分化程度：低分化35例，中高分化57例；國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期［10］：Ⅰ～Ⅱ期53例，Ⅲ～Ⅳ期39例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移59例。手術(shù)留取宮頸癌及其癌旁（距離癌組織>5 cm）組織各92例份。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 宮頸組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p檢測(cè)方法 取宮頸癌及其癌旁組織標(biāo)本，剪碎并研磨，TRIzol總RNA抽提試劑盒（無錫百泰克生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：RP2401）提取組織中總RNA，Nano Drop 1000超微量分光光度計(jì)和凝膠電泳檢測(cè)RNA濃度、純度、完整性。Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海紅榮微再生物工程技術(shù)有限公司，貨號(hào)：RR036A）合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，lncRNA HOXD-AS1上游引物：5′-GGCTCTTCCCTAATGTGT?GG-3′，下游引物：5′-CTCTGGTTGGGTGACTGGTT-3′；miR-133a-3p上游引物：5′-CGAGCCTTTG?GTCCCCTTCAAC-3′，下游引物：5′-TCAACTGCTG?GTGTCGTGGAGTCGGC-3′；反應(yīng)體系：10μL SYBR GreenⅠMaster、1.0μL上游引物、1.0μL下游引物、2μL DNA模板、8.5μL RNase-Free H2O；反應(yīng)條件：95℃、30 s，95℃、5 s，60℃、35 s，72℃、30 s，循環(huán)40次。分別以GAPDH（上游引物：5′-GGTG?GTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物：5′-CCAAATTCGTTGTCATACCAGGAAATG-3′）、U6（上游引物：5′-CTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：5′-AAAATATGGAACGCTTCACG-3′）作內(nèi)參校正，2-ΔΔCt法計(jì)算組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析法；Kaplan-Meier曲線繪制生存率，組間生存率比較采用Logrank檢驗(yàn)；Cox回歸分析法分析宮頸癌患者預(yù)后不良影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌、癌旁組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量比較 宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p相對(duì)表達(dá)量分別為2.064±0.644、0.947±0.305，癌旁組織分別為1.044±0.275、1.572±0.563，兩者比 較，P均<0.05。

2.2 宮頸癌組織中l(wèi)ncRNAHOXD-AS1與miR-133a-3p表達(dá)的相關(guān)性 宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1與miR-133a-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.663，P<0.05）。

2.3 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1，由表1可知，lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達(dá)與宮頸癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均<0.05）。

表1 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）

表1 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系（±s）

臨床病理參數(shù)年齡≥60歲<60歲病理類型鱗癌腺癌腫瘤直徑≥3 cm<3 cm腫瘤分化程度低分化中高分化FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有 無53 39 75 17 50 42 35 57 53 39 33 59 lncRNA HOXD-AS1 2.104±0.696 2.009±0.570 2.086±0.653 1.966±0.610 2.165±0.688 1.943±0.572 2.228±0.599 1.963±0.655 1.918±0.533 2.271±0.734 2.352±0.693 1.903±0.559 miR-133a-3p 0.935±0.308 0.963±0.303 0.936±0.312 0.984±0.274 0.918±0.301 0.981±0.309 0.869±0.236 0.995±0.333 1.023±0.275 0.839±0.316 0.836±0.258 1.009±0.313

2.4 lncRNA HOXD-AS1、miR-133a-3p表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 以lncRNA HOXD-AS1、miR-

133a-3p均值將92例宮頸癌患者進(jìn)行分組，lncRNA HOXD-AS1≥2.064患者（40例）和lncRNA HOXDAS1<2.064患者（52例）術(shù)后3年總生存率分別為30.00%（12/40）、67.31%（35/52），兩者比較，P<0.05；miR-133a-3p≥0.947患者（45例）和miR-133a-3p<0.947患者（47例）術(shù)后3年總生存率分別為68.89%（31/45）、34.04%（16/47），兩者比較，P<0.05。

2.5 宮頸癌患者預(yù)后不良影響因素Cox回歸分析結(jié)果 所有患者出院后均通過門診或電話方式隨訪，隨訪2～36個(gè)月，中位22個(gè)月；死亡47例，存活45例。死亡患者年齡≥60歲35例（74.47%）、鱗癌40例（85.11%）、腫瘤直徑≥3 cm 28例（59.57%）、低分化23例（48.94%）、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期25例（53.19%）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例（59.57%）、lncRNA HOXD-AS1≥2.064 31例（65.96%）、miR-133a-3p≥0.947 14例（29.79%），存活患者年齡≥60歲18例（40.00%）、鱗癌35例（77.78%）、腫瘤直徑≥3 cm 22例（48.89%）、低分化12例（26.67%）、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期14例（31.11%）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例（11.11%）、lncRNA HOXD-AS1≥2.064 9 例（20.00%）、miR-133a-3p≥0.947 31例（68.89%），兩者年齡≥60歲比例、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期比例、淋巴結(jié) 轉(zhuǎn) 移 比 例、lncRNA HOXD-AS1≥2.064比例、miR-133a-3p≥0.947比例比較，P均<0.05。以年齡（≥60歲=1，<60歲=0）、FIGO分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有=1，無=0）、lncRNA HOXD-AS1（≥2.064=1，<2.064=0）、miR-133a-3p（≥0.947=1，<0.947=0）為自變量，隨訪時(shí)間為時(shí)間變量，預(yù)后（死亡=1，存活=0）為因變量，經(jīng)多因素Cox回歸分析，顯示FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、lncRNA HOXD-AS1≥2.064為宮頸癌患者預(yù)后不良獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，miR-133a-3p≥0.947為獨(dú)立保護(hù)因素（P<0.05）。詳見表2。

表2 宮頸癌患者預(yù)后不良影響因素的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，與人乳頭瘤病毒持續(xù)感染、性行為、分娩次數(shù)、多個(gè)性伴侶、多孕多產(chǎn)等有關(guān)，主要癥狀為陰道流血、不正常陰道排液、接觸性出血等，但早期常無明顯癥狀，大多患者確診時(shí)已達(dá)中晚期。盡管近年來宮頸癌篩查、手術(shù)、放療、化療取得了重大進(jìn)展，但晚期和復(fù)發(fā)宮頸癌患者的治療效果仍不令人滿意。腫瘤的生長(zhǎng)依賴一系列促癌基因的激活，阻斷這些通路中關(guān)鍵胞內(nèi)蛋白或膜受體，可發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及促進(jìn)凋亡作用，因此近年來出現(xiàn)了以腫瘤特異性分子靶標(biāo)為基礎(chǔ)的靶向和免疫療法，雖然顯著延長(zhǎng)了宮頸癌患者生存時(shí)間，但仍未達(dá)到最終效果，因此迫切需要進(jìn)一步深入研究其分子層面，以揭示新的治療靶點(diǎn)［11］。蛋白編碼基因一直是腫瘤研究熱點(diǎn)，人體中95%以上的蛋白編碼被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA，在RNA水平就可行駛各自生物學(xué)功能，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、凋亡等過程發(fā)揮重要調(diào)控作用。

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本>200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可通過影響表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平來調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖［4］。lncRNA HOXD-AS1位于人染色體2q31.2，進(jìn)化過程中高度保守，近年研究表明，其參與多種惡性腫瘤進(jìn)展［12-13］。SUN等［12］研究顯示，沉默lncRNA HOXD-AS1可通過絲裂原活化蛋白激酶激酶/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路抑制肝癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、遷移、侵襲。LI等［13］研究顯示，lncRNA HOXD-AS1可通過miR-520c-3p/v-myc禽骨髓細(xì)胞瘤病毒癌基因神經(jīng)母細(xì)胞瘤衍生同源體軸促進(jìn)膽管癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。本研究顯示，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與宮頸癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明lncRNA HOXD-AS1高表達(dá)參與了宮頸癌進(jìn)展。進(jìn)一步分析顯示，lncRNA HOXD-AS1≥2.064患者術(shù)后3年總生存率明顯降低，術(shù)后3年死亡增加1.217倍，說明lncRNA HOXD-AS1可作為宮頸癌患者預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物。Ras/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路在腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用，參與腫瘤異常增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移［14］。體外沉默裸鼠宮頸癌細(xì)胞lncRNA HOXD-AS1發(fā)現(xiàn)，宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力和Ras/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶的磷酸化明顯受抑，提示lncRNA HOXD-AS1可通過Ras/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲［15］。CHI等［16］也發(fā)現(xiàn)，對(duì)順鉑耐藥的宮頸癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1表達(dá)顯著上調(diào)，下調(diào)lncRNA HOXD-AS1表達(dá)可抑制順鉑耐藥宮頸癌細(xì)胞的耐藥。上述研究驗(yàn)證了本研究結(jié)果，也提示lncRNA HOXD-AS1可能成為宮頸癌新的治療靶點(diǎn)。

miRNA是一類內(nèi)源性長(zhǎng)約19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可結(jié)合mRNA的3′UTR導(dǎo)致mRNA裂解，降解或抑制蛋白質(zhì)翻譯，參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等調(diào)控［5］。miR-133a-3p是一個(gè)低氧調(diào)節(jié)的miRNA，在心臟中含量最豐富，因此其異常表達(dá)

多與心臟相關(guān)疾病有關(guān)，如心肌梗死、心房顫動(dòng)等［17-18］。近年研究［19-20］表明，miR-133a-3p還參與多種惡性腫瘤進(jìn)展，HE等［19］發(fā)現(xiàn)miR-133a-3p可通過抑制Ⅰ型膠原A1抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和入侵。LI等［20］的研究顯示，miR-133a-3p可通過調(diào)節(jié)叉狀頭轉(zhuǎn)錄因子3抑制胃癌增殖和自噬。本研究顯示，宮頸癌組織中miR-133a-3p表達(dá)明顯低于癌旁組織，且與FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明miR-133a-3p參與了宮頸癌進(jìn)展。進(jìn)一步分析顯示，miR-133a-3p≥0.947患者術(shù)后3年總生存率明顯提升，為術(shù)后預(yù)后不良獨(dú)立保護(hù)因素，說明miR-133a-3p也可作為宮頸癌患者預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路是促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和抑制凋亡的關(guān)鍵通路［21］。研究［9］發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-133a-3p表達(dá)可通過調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和促凋亡。lncRNA可作為內(nèi)源競(jìng)爭(zhēng)RNA競(jìng)爭(zhēng)占有胞內(nèi)微小RNA，海綿樣緩沖削減并干涉靶基因mRNA編碼蛋白能力［22］。本研究顯示，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1與miR-133a-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，說明二者可能共同影響宮頸癌患者預(yù)后。劉海娟等［9］通過miRcode數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)和雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)，miR-133a-3p與lncRNAHOXD-AS1的3′UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，lncRNA HOXD-AS1能負(fù)向調(diào)控宮頸癌細(xì)胞凋中miR-133a-3p表達(dá)影響細(xì)胞增殖和凋亡。相反FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的惡性程度增加，同時(shí)影響lncRNA HOXD-AS1和miR-133a-3p表達(dá)水平，進(jìn)而影響患者的預(yù)后狀態(tài)。

總之，宮頸癌組織中l(wèi)ncRNA HOXD-AS1表達(dá)升高，miR-133a-3p表達(dá)降低；兩者均與宮頸癌FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；lncRNA HOXD-AS1≥2.064為宮頸癌患者預(yù)后不良獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，miR-133a-3p≥0.947為其獨(dú)立保護(hù)因素；二者可能成為宮頸癌患者預(yù)后評(píng)估指標(biāo)。