白如雪，許穎穎，劉芳，杜時(shí)雨

中日友好醫(yī)院內(nèi)鏡中心，北京100029

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，2018年全球新發(fā)胃癌病例148.4萬。手術(shù)雖是胃癌最重要的治療方法，但晚期胃癌仍缺乏有效治療手段，即使采取綜合治療策略也有較大幾率出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，5年累積生存率也不足30%［1］。因此，尋找能有效評(píng)估患者病情進(jìn)展和預(yù)后生物學(xué)靶標(biāo)具有重要意義。微小RNA是一類非編碼RNA，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為［2］。近年大量研究報(bào)道，微小RNA-338-3p（miR-338-3p）在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，在不同腫瘤類型中發(fā)揮促癌基因或抑癌基因作用［3-4］。蛋白質(zhì)酪氨酸殘基的磷酸化是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路中重要環(huán)節(jié)，可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為，受蛋白酪氨酸磷酸酶（PTPs）和蛋白酪氨酸激酶（PTKs）調(diào)控［5］。蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）為PTPs家族一員，其與卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生和預(yù)后相關(guān)［6-8］。目前，關(guān)于miR-338-3p、PTP1B與胃癌的關(guān)系鮮有報(bào)道。2015年1月—2017年12月，我們觀察了胃癌組織中miR-338-3p、PTP1B的表達(dá)變化，并分析患者預(yù)后影響因素，以期為臨床有效評(píng)估患者病情進(jìn)展和預(yù)后提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取中日友好醫(yī)院接受手術(shù)治療的胃癌患者89例，男50例，女39例；年齡47～82（61.25±7.25）歲，其中≥60歲56例、<60歲33例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理檢查確診；②初次確診，術(shù)前未接受放化療等抗腫瘤治療者；③患者及家屬均知情研究；④病歷資料完整者；⑤可接受隨訪者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤者；②既往惡性腫瘤病史；③心、肝、腎功能嚴(yán)重受損者；④合并免疫系統(tǒng)疾病者。腫瘤直徑：≥5 cm 37例，<5 cm 52例；TNM分期［9］：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期53例；腫瘤分化程度：未分化9例，低分化19例，中分化48例，高分化13例；浸潤深度：T1 18例，T2 21例，T3 33例，T4 17例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移42例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47例。手術(shù)留取胃癌及癌旁（距離癌組織>5 cm）組織各89例份。本研究經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 胃組織中miR-338-3p、PTP1B檢測方法 取胃癌組織和癌旁組織標(biāo)本，TRIzol總RNA抽提試劑盒（無錫百泰克生物技術(shù)有限公司）提取組織中總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，Qiagen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海研卉生物科技有限公司）合成cDNA，加入引物0.6μL，miR-338-3p：5′-TGAGGGCAAGATGACAAA?GA-3，5′-GCCCTTGCACTTGATGGTAT-3；PTP1B：5′-TTCTGAGCTGGGCTTGTTGT-3′，5′-TGCAGCTA?AAATGCAAACCCAT-3′；miR-338-3p、PTP1B引物0.6μL（5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′，5′-CCAGTG-CAGGGTCCGAGGT-3）混勻。伯樂CFX96熒光定量PCR儀檢測，反應(yīng)條件：95℃、20 s，95℃、10 s，60℃、20 s，70℃、10 s，循環(huán)40次，分別以U6和GAP?DH做內(nèi)參校正，U6：5′-CTCGCTTCGGCAGCA?CATATACT-3′，5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT?GTC-3；GAPDH：5′-CGAGCCACATCGCTCAGA?CA-3′，5′-GTGGTGAAGACGCCAGTGGA-3；反應(yīng)結(jié)束后得到各管Ct，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-338-3p、PTP1B相對(duì)表達(dá)量。

1.3 胃癌患者術(shù)后隨訪方法 術(shù)后通過門診復(fù)查和電話方式隨訪3年，隨訪截止2020年12月，統(tǒng)計(jì)3年累積生存率，定義為手術(shù)至隨訪截止或死亡。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；偏態(tài)分布或方差不齊的計(jì)量資料以M（QL，QU）表示，組間比較采用Z檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法；Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)；多因素Cox回歸分析法分析胃癌患者預(yù)后不良影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌、癌旁組織中miR-338-3p、PTP1B相對(duì)表達(dá)量比較 胃癌組織中miR-338-3p、PTP1B相對(duì)表達(dá)量分別為0.870（0.470，1.485）、1.052±0.059，癌旁組織分別為3.590（2.435，4.570）、0.544±0.116，兩者比較，P均<0.05。

2.2 胃癌組織中miR-338-3p與PTP1B表達(dá)水平的相關(guān)性 胃癌組織中miR-338-3p與PTP1B表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（rs=-0.626，P<0.05）。

2.3 miR-338-3p、PTP1B表達(dá)水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-338-3p、PTP1B表達(dá)與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系見表1，由表1可知，miR-338-3p、PTP1B表達(dá)與胃癌TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P均<0.05）。

表1 miR-338-3p、PTP1B表達(dá)水平與胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4 miR-338-3p、PTP1B表達(dá)水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 以miR-338-3p中位數(shù)和PTP1B平均值為界將89例胃癌患者分為高、低表達(dá)組。miR-338-3p高表達(dá)組（43例，≥0.87）、miR-338-3p低表達(dá)組（46例，<0.87）3年累積生存率分別為76.74%（33/43）、47.83%（22/46），兩組比較，P<0.05；PTP1B高表達(dá)組（45例，≥1.05）、PTP1B低表達(dá)組（44例，<1.05）3年累積生存率分別為44.44%（20/45）、79.55%（35/44），兩組比較，P<0.05。

2.5 胃癌患者預(yù)后不良影響因素單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)果 隨訪3～36（20.59±8.37）個(gè)月，死亡34例，存活55例。死亡組男性22例（64.71%）、年齡≥60歲27例（79.41%）、腫瘤直徑≥5 cm 16例（47.06%）、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期28例（82.35%）、低未分化12例（35.29%）、浸潤深度T3～T4 24例（70.59%）、淋 巴 結(jié) 轉(zhuǎn) 移24例（70.59%）、miR-338-3p 0.392（0.141，0.633）、PTP1B 1.102±0.041，存活組分別為28例（50.91%）、29例（52.73%）、21例（38.18%）、25例（45.45%）、16例（29.09%）、18例（32.73%）、1.302（0.871，1.662）、1.022±0.053，兩組年齡≥60歲比例、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期比例、浸潤深度T3～T4比例、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比例及PTP1B表達(dá)水平、miR-338-3p表達(dá)水平比較，P均<0.05。以年齡（≥60歲=1，<60歲=0）、TNM分期（Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0）、浸潤深度（T3～T4=1，T1～T2=0）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有=1，無=0）、miR-338-3p、PTP1B為自變量，預(yù)后為因變量（死亡=1，存活=0），經(jīng)多因素Cox回歸分析，顯示TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高PTP1B表達(dá)水平為胃癌患者預(yù)后不良獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，高miR-338-3p表達(dá)水平為獨(dú)立保護(hù)因素（P均<0.05）。詳見表2。

表2 胃癌患者預(yù)后不良影響因素的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，也是全球第3大癌癥死亡原因，一般起源于胃黏膜細(xì)胞，與飲食習(xí)慣、Hp感染、遺傳、種族等因素有關(guān)，主要癥狀為腹痛，但早期常無癥狀，大多患者確診時(shí)已達(dá)中晚期（Ⅲ～Ⅳ期）［10］。早期胃癌的癌組織浸潤僅限于黏膜層和黏膜下層，治療相對(duì)容易，若癌癥浸潤胃壁、全層甚至出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，則需要聯(lián)合治療，但由于惡性程度較高，通常預(yù)后較差［11］。近年來，隨著分子病理學(xué)進(jìn)入臨床，臨床評(píng)估胃癌治療方案更加精細(xì)，通常在手術(shù)治療基礎(chǔ)上給予放化療、免疫治療、靶向治療等輔助治療，使得腫瘤治療效果升高，但目前以個(gè)體化精準(zhǔn)化為特征的免疫或靶向治療仍然沒有達(dá)到令人滿意的效果，基于基因譜和蛋白表達(dá)譜分類的分子病理學(xué)是胃癌輔助治療的新基礎(chǔ)［12-13］。因此尚需深入研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，以期改善個(gè)體化精準(zhǔn)化治療效果。

miRNA是一種單鏈非蛋白質(zhì)編碼RNA，由19～23個(gè)核苷酸組成，可結(jié)合靶mRNA的3′非翻譯區(qū)，調(diào)節(jié)60%的編碼基因，改變目標(biāo)基因表達(dá)，引起目標(biāo)mRNAs翻譯抑制和降解。盡管目前尚不明確大多數(shù)miRNAs功能作用，但諸多研究表明其參與了各種生理病理過程，包括細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，且大多位于腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)或基因區(qū)域，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［2］。miR-338位于人染色體17q25，染色體17q23～25為多種惡性腫瘤突變“熱點(diǎn)”，該染色體突變與腫瘤惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，提示miR-338可能參與了腫瘤惡性進(jìn)程［14］。miR-338-3p為miR-338成熟的miRNA序列，其在多種惡性腫瘤中呈異常表達(dá)。QIAN等［15］發(fā)現(xiàn)，宮頸癌中miR-338-3p表達(dá)明顯上調(diào)，可通過上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲。孫超等［16］認(rèn)為，腎癌中miR-338-3p表達(dá)明顯下調(diào)，可通過下T細(xì)胞生長因子4抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲。上述研究提示，miR-338-3p在不同腫瘤類型中發(fā)揮不同作用。本研究顯示，胃癌組織中miR-338-3p表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示miR-338-3p在胃癌中可能作為一種抑癌基因參與胃癌發(fā)生，與胃癌TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，符合近年研究報(bào)道［17］。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p高表達(dá)組術(shù)后3年累積生存率高于低表達(dá)水平組，且是患者預(yù)后不良的獨(dú)立保護(hù)因素，說明miR-338-3p可能成為胃癌患者預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物。神經(jīng)纖毛蛋白1可結(jié)合血管內(nèi)皮生長因子配體，促進(jìn)腫瘤新生血管生成和抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞生長、遷移、侵襲［18］。JIN等［19］通過生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)纖毛蛋白1為miR-338-3p直接調(diào)控靶基因，轉(zhuǎn)染miR-338-3p可抑制神經(jīng)纖毛蛋白1表達(dá)，抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，促進(jìn)其凋亡。

細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡等功能改變由信號(hào)傳導(dǎo)控制，其是由多條信號(hào)通路構(gòu)成的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，蛋白質(zhì)磷酸化和去磷酸化作為一種分子開關(guān)，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)程中發(fā)揮重要作用［20］。酪氨酸為蛋白質(zhì)磷酸化常見位點(diǎn)，PTKs和PTPs一起調(diào)控多種關(guān)鍵信號(hào)分子的酪氨酸磷酸化狀態(tài)，其中PTKs負(fù)責(zé)酪氨酸殘基的磷酸化，PTPs負(fù)責(zé)去磷酸化［5］。PTP1B為首個(gè)被分離、純化、克隆的PTP，最初研究發(fā)現(xiàn)其在機(jī)體代謝過程中發(fā)揮重要作用，隨著研究進(jìn)展，越來越多研究表明，PTP1B還參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展。如食管癌中PTP1B上調(diào)表皮生長因子受體表達(dá)增強(qiáng)癌細(xì)胞遷移和入侵能力，具有促癌基因作用［21］。JAK激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)通路激活是惡性淋巴瘤生存和增殖基礎(chǔ)，惡性淋巴瘤中PTP1B基因失活突變與JAK激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子信號(hào)通路降低或失活相關(guān)，說明PTP1B具有抑癌基因作用［22］。本研究顯示，胃癌組織中PTP1B表達(dá)水平高于癌旁組織，且與TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示PTP1B在胃癌中可能作為一種促癌基因參與胃癌發(fā)生，與胃癌TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PTP1B高表達(dá)組術(shù)后3年累積生存率低于低表達(dá)水平組，且為患者預(yù)后不良獨(dú)立危險(xiǎn)因素，說明PTP1B可能成為胃癌患者預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物。目前，尚不明確PTP1B在胃癌中促癌機(jī)制，但大量研究［23-24］顯示沉默PTP1B表達(dá)能顯著抑制胃癌生長、增殖、遷移、侵襲能力，推測與PTP1B去磷酸化后改變?cè)械鞍踪|(zhì)構(gòu)象，激活某些細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起胃癌細(xì)胞惡性進(jìn)程有關(guān)。

本研究還顯示，胃癌組織中miR-338-3p與PTP1B表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-338-3p與PTP1B可能共同影響胃癌病情進(jìn)展和預(yù)后。SUN等［25］通過miRanda和TaegetScan生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測顯示，PTP1B的3′非翻譯區(qū)中有兩個(gè)miR-338-3p潛在結(jié)合位點(diǎn)，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)在胃癌中miR-338-3p可負(fù)向調(diào)節(jié)PTP1B發(fā)揮抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移作用。進(jìn)一步驗(yàn)證了本研究結(jié)果。本研究結(jié)果還顯示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為胃癌患者預(yù)后不良獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，考慮與Ⅲ～Ⅳ期浸潤較深，已經(jīng)擴(kuò)散甚至轉(zhuǎn)移至其他器官，難以完全切除，因此術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)幾率高，預(yù)后差。

總之，胃癌組織中miR-338-3p表達(dá)水平降低，PTP1B表達(dá)水平升高，兩者均與胃癌TNM分期、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，高PTP1B表達(dá)水平是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，高miR-338-3p表達(dá)水平是胃癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立保護(hù)因素，兩指標(biāo)可能作為患者術(shù)后預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。