鄭向榮，楊洪安，丁鋒

山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科，濟南250021

膠質(zhì)細胞瘤是一種常見的顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤，占所有顱內(nèi)腫瘤的50%以上，世界衛(wèi)生組織（WHO）根據(jù)其惡性程度及病理特征分為Ⅰ～Ⅳ級［1］。膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）是最常見、侵襲性最強、預(yù)后最差的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，屬于Ⅳ級膠質(zhì)瘤，即使采取手術(shù)切除+放化療的傳統(tǒng)綜合治療策略，中位生存期仍然不到18個月，3年生存率<10%［2-3］。目前，分子靶向治療是腫瘤治療研究領(lǐng)域中的熱點，而分子治療靶點的選擇是基礎(chǔ)和關(guān)鍵。牙周韌帶相關(guān)蛋白-1（Asporin）在骨與軟骨疾病進展中發(fā)揮重要作用，近年研究證實其能促進多種腫瘤的惡性進展，但在膠質(zhì)瘤中的研究鮮有報道。本研究觀察了Asporin在GBM組織中的表達變化，并分析其與GBM患者替莫唑胺（TMZ）耐藥和預(yù)后之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年10月—2015年10月山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院神經(jīng)外科收治并經(jīng)術(shù)后病理確診的GBM患者40例，男18例，女22例；年齡（52.3±10.1）歲；膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）陽性23例（57.5%），陰性17例（42.5%）；少突膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)錄因子-2（Olig-2）陽性16例（40.0%），陰性24例（60.0%）；P53陽性21例（52.5%），陰性19例（47.5%）；IDH1陽性13例（32.5%），陰性27例（67.5%）。另選10例高血壓腦出血患者，男5例，女5例；年齡（49.5±9.3）歲。手術(shù)留取GBM患者和高血壓腦出血患者（為減輕顱內(nèi)壓所切除的正常大腦組織）腦組織標本。本研究均經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書，且通過了山東第一醫(yī)科大學附屬省立醫(yī)院倫理委員會的評議。

1.2 主要試劑及儀器 Asporin抗體（Abcom公司，美國）；GAPDH抗體（中杉金橋公司，中國）；免疫組化試劑盒、蘇木素、檸檬酸鹽修復(fù)液、磷酸鹽緩沖液（PBS）、中性樹膠、DAB試劑盒（中杉金橋公司，中國）；一抗稀釋液（北京索萊寶公司，中國）；RIPA裂解液、PMSF、5×蛋白上樣緩沖液、1.5 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、10%SDS、30%Acr-bis、過 硫 酸 銨（APS）、1 mmol/L Tris-HCL（pH 6.8，碧云天公司，中國）；蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國）；脫脂奶粉（內(nèi)蒙古伊利公司，中國）；山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG（中杉金橋公司，中國）。ECL發(fā)光液、PVDF膜（Millipore公司，美國）；顯影液、定影液（樂凱膠片公司，中國）；膠片（柯達公司，美國）。

1.3 腦組織Asporin蛋白檢測 ①Western blotting法：提取GBM組織和正常腦組織的總蛋白，采用BCA蛋白定量分析試劑盒檢測蛋白濃度，蛋白變性后每個上樣標本采用40μg總蛋白，進行電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜后5%脫脂奶粉封閉，Asporin（1∶1 000）及GAPDH（1∶1 000）抗體4℃孵育過夜，次日洗膜后行二抗孵育，TBST洗膜后暗室曝光，采圖。用Image J軟件測量譜帶的光密度，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。②免疫組化染色法：對GBM組織和正常腦組織標本進行Asporin免疫組化染色，明確Asporin在正常腦組織和GBM標本組織中的表達情況。實驗方法簡述如下：切片、烤片、脫蠟并水化，高壓抗原修復(fù)，山羊血清封閉，抗體孵育，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，樹膠封片，免疫組化結(jié)果評分。染色評分根據(jù)陽性細胞比例得分和染色深度得分相乘得到［13］，沒有陽性染色計0分，1%～10%陽性細胞或淺黃色染色記1分，11%～50%陽性細胞或深黃色染色記2分，51～75%陽性細胞或棕色染色記3分，>75%陽性細胞或深棕色染色記4分；總分≤4為低表達，總分≥6為高表達。

1.4 Asporin表達與GBM患者TMZ耐藥關(guān)系分析 17例GBM患者進行了基因檢測，O6-甲基鳥嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）啟動子甲基化提示對TMZ敏感，MGMT啟動子未甲基化提示對TMZ耐藥。針對這17例患者行Asporin高低表達分組，通過χ2檢驗進行耐藥性分析。

1.5 Asporin表達與GBM患者預(yù)后關(guān)系分析 依據(jù)免疫組化染色得分將Asporin表達分為高、低表達組，總分≤4為低表達組，總分≥6為高表達組。然后采用Kaplan-Meier法比較Asporin高表達組、低表達組患者預(yù)后情況。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各腦組織Asporin表達比較 GBM組織、正常腦組織Asporin相對表達量分別為1.90±1.20、0.34±0.20，免疫組化染色得分分別為（8.01±4.38）、（2.00±1.15）分，兩者比較，P均<0.05。Asporin在各腦組織中的表達情況見圖1。

圖1 Asporin在各腦組織中的免疫組化染色圖像

2.2 Asporin表達與GBM患者TMZ耐藥的關(guān)系 17例GBM患者中12例患者MGMT啟動子未甲基化（對TMZ耐藥），5例患者MGMT啟動子甲基化（對TMZ敏感），耐藥者、敏感者Asporin相對表達量分別為3.07±0.61、1.04±0.18，兩者比較，P<0.05。17例GBM患者根據(jù)免疫組化染色評分分為Asporin高表達者（13例）、Asporin低表達者（4例），對TMZ耐藥例數(shù)分別為10、2例，兩者比較，P<0.05。

2.3 Asporin表達與GBM患者預(yù)后的關(guān)系 30例GBM患者根據(jù)Asporin染色評分分為高表達者（27例）、低表達者（13例），中位生存期分別為（12.0±0.7）、（23.0±3.9）個月，兩者比較，P<0.05。

3 討論

GBM是顱內(nèi)最常見、侵襲性最強、惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤，呈浸潤性、侵襲性生長，即使術(shù)中采取擴大切除的手段，往往也無法完全切除腫瘤，況且腦組織功能的重要性決定了大多數(shù)膠質(zhì)瘤僅能進行極其有限的擴大切除，還有相當數(shù)量的膠質(zhì)瘤侵犯了丘腦或腦干等重要部位，僅能切除部分腫瘤甚至無法手術(shù)治療［3-4］。TMZ是臨床治療GBM的標準一線化療藥，主要攻擊腫瘤細胞DNA，可引起DNA上MGMT發(fā)生甲基化，進而導(dǎo)致DNA交聯(lián)、斷裂，產(chǎn)生細胞凋亡，然而由于多數(shù)患者在化療過程中極易對TMZ化療產(chǎn)生耐藥，因此目前臨床上亟需尋找新的GBM治療靶點［5］。

Asporin是一種細胞外基質(zhì)蛋白，最初研究發(fā)現(xiàn)其在多種骨關(guān)節(jié)疾病中發(fā)揮重要作用。近年來，Asporin在腫瘤中的作用開始受到重視。多項研究證實，Asporin在多種腫瘤及腫瘤相關(guān)性纖維母細胞（CAFs）中呈高表達，并通過自分泌或旁分泌方式促進腫瘤的惡性發(fā)展［6-8］。SATOYOSHI等［6］發(fā)現(xiàn)，CAFs分泌的Asporin能通過活化CD44-Rac1信號軸增加胃癌細胞和CAFs自身的侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，Asporin在胰腺癌細胞和間質(zhì)中均呈高表達，其可通過自分泌和旁分泌兩種方式與胰腺癌細胞表面的CD44受體結(jié)合，激活A(yù)KT和ERK通路促進胰腺癌的侵襲和遷移［7］。上述研究表明，Asporin往往通過與CD44受體結(jié)合發(fā)揮生物學作用進而促進腫瘤的惡性進展。然而，Asporin在膠質(zhì)瘤中的表達及生物學功能目前尚無研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，Asporin在正常大腦組織中不表達，而在GBM組織中普遍呈中高表達，因此我們初步推測，Asporin有可能在GBM中發(fā)揮著重要的生物學功能，而后續(xù)的研究也進一步驗證了我們的推測。

MGMT是一種DNA修復(fù)酶，可通過轉(zhuǎn)移TMZ造成的DNA甲基化，避免TMZ導(dǎo)致的DNA發(fā)生交聯(lián)、斷裂，從而參與GBM對TMZ的耐藥，同時自身不可逆的失活，即“自殺式”修復(fù)機制［9］。研究［10-11］表明，MGMT啟動子甲基化的患者與未甲基化的患者相比能從TMZ化療中獲得的更好的治療效果，前者的中位生存期為21.7個月，而后者中位生存期僅為12.7個月，因此MGMT是目前臨床上預(yù)測TMZ是否耐藥的關(guān)鍵分子。本研究收集的40例GBM患者中17例患者曾行MGMT基因檢測，其中12例患者MGMT啟動子未甲基化，5例患者MGMT啟動子甲基化，Asporin在TMZ耐藥GBM患者中表達水平更高，且Asporin高表達與MGMT非甲基化間存在明顯的相關(guān)性，提示Asporin可能參與了GBM患者對TMZ耐藥生物學過程，但具體機制目前尚不清楚，有待進一步研究。進一步分析Asporin表達水平與GBM患者預(yù)后之間的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)Asporin表達水平越高，GBM患者預(yù)后越差。文獻［12］報道，CD44在GBM生長、復(fù)發(fā)和耐藥中起重要作用，檢測CD44表達水平可預(yù)測GBM的復(fù)發(fā)和耐藥。臨床上多數(shù)GBM患者在化療過程中會對TMZ產(chǎn)生耐藥，GBM患者術(shù)后中位生存期不到18個月，因此TMZ耐藥是臨床上亟待解決的問題，已成為近年來膠質(zhì)瘤領(lǐng)域的研究熱點［13-15］。目前研究初步發(fā)現(xiàn)，信號通路異常、非編碼RNA、DNA損傷修復(fù)機制、腫瘤微環(huán)境、信號通路異常、膠質(zhì)瘤干細胞學說、腫瘤細胞自噬等參與了替莫唑胺耐藥，但參與調(diào)控TMZ耐藥的具體機制尚未完全闡明，結(jié)合前期結(jié)果及相關(guān)文獻報道，我們推測Asporin可能通過CD44促進替莫唑胺耐藥，進而影響了GBM患者的預(yù)后，但具體機制有待進一步研究［16］。而進一步闡述TMZ的耐藥分子機制有助于提高TMZ對GBM患者的治療效果，為克服TMZ耐藥提供新的理論依據(jù)。

總之，GBM組織Asporin的表達升高，Asporin表達水平越高，對TMZ耐藥者越多，患者預(yù)后越差。