左健李婷李雅蘭1,肖倩文1,葛佳麗1, 王采集1,,3,4喬月華

1徐州醫(yī)科大學（江蘇221004）

2徐州醫(yī)科大學形態(tài)學科研實驗中心（江蘇221004）

3江蘇省人工聽覺工程實驗室（江蘇221004）

4徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院（江蘇221002）

5淮安市淮安醫(yī)院（江蘇223200）

耳鳴是指在沒有相應外界聲源情況下對聲音的主觀感知[1]。耳鳴發(fā)病率很高，嚴重的會引起患者焦慮和抑郁，這些負面情緒又會加重對耳鳴的感知，形成惡性循環(huán)[2,3]。耳鳴病因復雜，機制不清，目前尚無有效的耳鳴治療方法[4]。水楊酸已成為制備耳鳴模型最廣泛的藥物[5]。聽皮層是聽覺通路上的最高級中樞，水楊酸誘發(fā)耳鳴并伴有聽力損失，而這種聽覺剝奪會引起聽皮層的興奮性增加和/或抑制作用減弱，導致聽皮層神經自發(fā)放電活動增加及神經重塑，聽皮層神經元異常興奮[6-9]。

GABAA受體是大腦中樞中主要的抑制性受體[10]。五聚體通道可以由許多可能的亞基組成，但腦中最常見的組合由α1，β2和γ2亞基組成[11]。神經元中抑制性突觸的可塑性涉及調節(jié)亞細胞區(qū)室和質膜之間的GABAA受體運輸[12,13]。GABAA受體相 關 蛋 白（GABAA receptor-associated protein，GABARAP）可以在運輸過程中提供GABAA受體和細胞骨架之間的聯(lián)系，通過GABARAP與GABAA受體γ2亞基的胞內環(huán)結合并且與含γ2亞基GABAA受體免疫沉淀，同時與微管蛋白免疫沉淀相互作用[14-16]，從而將GABAA受體轉運至胞膜上。盡管文獻表明GABARAP參與神經元中GABAA受體的轉運，但GABARAP在耳鳴中的作用尚不清楚。因此，本研究采用長期注射水楊酸鈉建立大鼠耳鳴模型后，檢測聽皮層中GABARAP表達的變化，初步探討在耳鳴中的可能機制，為耳鳴機制研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

選擇成年雄性Sprague Dawley大鼠126只（徐醫(yī)大動物中心提供），清潔級，體重250-300g，大鼠無強聲暴露、耳毒性藥物等使用史,隨機分組。本實驗過程符合徐醫(yī)大動物中心動物管理條例規(guī)定。

1.1.2 實驗試劑

水楊酸鈉（美國Sigma公司s3007），GABARAP引物（生工生物工程有限公司），GAPDH引物（生工生物工程有限公司），BCA檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司P0010），兔多克隆抗GABARAP抗體（美國Novus公司NBP1-71771），鼠單克隆抗GAPDH抗體（美國Proteintech公司60004-1-ig）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制備

耳鳴模型分組基于先前的研究[17,18]。隨機分為7組：對照注射、慢性注射7天組；對照注射、慢性注射14天組；停藥后恢復3天組、7天組及14天組（對照組200mg/kg生理鹽水腹腔注射，于上午8時和下午4時各注射一次，按天數注射；實驗組200mg/kg水楊酸鈉腹腔注射，操作同上）。所有動物分別造模成功后于的第二天上午8時處死。

1.2.2 驚跳反射抑制（Pre-Pulse Inhibition，PPI）

耳鳴檢測參照以往研究[19]。隔音屏蔽室中檢測不同組別大鼠前脈沖驚跳刺激的PPI值來進行比較。所用PPI程序：在給予驚跳反射刺激（ASR）前，發(fā)放三種不同強度的前脈沖驚跳刺激75 dB SPL、80dB SPL和 85dB SPL（分別為 PPI2，PPI4和PPI8）。每次實驗，將大鼠置于65dB SPL白色背景噪聲中適應，先為大鼠隨機分配10次115dB SPL脈沖刺激，然后通過揚聲器30次隨機聲刺激（10次115dB SPL脈沖刺激、10次沒有前聲的驚跳反射刺激和10次前脈沖驚跳反射刺激）。根據公式PPI%=1-(ASR-PPI)/ASR×100%來計算前脈沖抑制率。

1.2.3 實時熒光定量PCR

每組6只大鼠用3%戊巴比妥那（30mg/kg）麻醉后，斷頭取腦迅速分離出聽皮層。采用Trizol法提取總RNA，根據PCR試劑盒說明書逆轉錄為cDNA。上海生工設計合成引物，引物序列為5’to 3’：GABARAP 上 游 TTGTCAACAATGTCATTC‐CACC， 下 游 TCTCTTTGTAGAATGGAACCCC；GAPDH上游 AGACAGCCGCATCTTCTTGT，下游CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT。PCR反應體系：EvaGreen 2x qPCR MasterMix 5μL，PCR Forward Primer(10μM)0.5μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.5μL，DNA 模板 1μL，dH20 3μL，總體積 10.0μL。各基因表達變化采用比較閾值法即計算2—△△CT。

1.2.4 Western Blot

每組6只大鼠麻醉后，斷頭取腦迅速分離出聽皮層。提蛋白，測蛋白濃度，電泳完后轉膜。封閉，4℃孵育多克隆抗GABARAP（1:1000）和鼠單克隆抗GAPDH（1:5000）搖床過夜。洗滌條帶，孵二抗，洗滌條帶，掃描條帶。選用GAPDH作為內參，并用Image J軟件分析。

1.2.5 免疫熒光

每組6只麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定。脫水包埋。冰凍切片16μm。抗原修復，漂洗，封閉，一抗孵育過夜。次日漂洗，孵二抗，再漂洗。加一滴免洗DAPI，封片，正置熒光顯微鏡下觀察拍照。每組計數18張腦片單位面積平均熒光強度，取其平均值。

1.2.6 統(tǒng)計

數據處理使用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。兩組間均數差異性比較使用獨立樣本t檢驗，多組間均數差異性比較使用單因素方差分析（Dunnett事后檢驗）。均數±標準差用于表示計量資料，P<0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 水楊酸鈉成功誘導大鼠耳鳴樣行為

不同組別大鼠的PPI值（）（圖1、表1）。與對照組比較，慢性注射7天組，PPI2、PPI4和PPI8均顯著升高（t=-7.033,P=0.002;t=-4.769,P=0.009;t=-4.881,P=0.008,P<0.05）。慢性注射14天組和停藥后恢復3天組較對照組，PPI2、PPI4和PPI8均顯著升高（F=8.516,P=0.046,P=0.009;F=9.742,P=0.046,P=0.000;F=2.667,P=0.027,P=0.006,P<0.05）；停藥后恢復7天組、14天組與對照組比較，PPI2、PPI4和PPI8無顯著差異（F=8.516,P=0.551,P=0.171;F=9.742,P=0.591,P=0.058;F=2.667,P=0.317,P=0.073,P>0.05）。前脈沖抑制率越大，驚跳反射被抑制就越小。耳鳴填補前脈沖刺激，從而減小前抑制作用。

圖1 水楊酸鈉對前脈沖抑制率的影響。A：慢性注射7天組大鼠的PPI抑制率；B：慢性注射14天組、停藥后恢復3天組、7天組及14天組大鼠的PPI抑制率；數值用均數±標準差表示；前脈沖刺激：PPI2：75dB SPL；PPI4:80dB SPL；PPI8：85dB SPL(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)Fig.1 Effect of sodium salicylate on pre-pulse inhibition.A:The PPI inhibition rate of rats in SS7d;B:The PPI inhibition rate of rats in SS14d,HF3d,HF7d and HF14d(Values are ex‐pressed as mean±SD;pre-pulse stimulation:PPI 2,75dB SPL;PPI4,80dB SPL;PPI8,85dB SPL(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,respectively)

表1 行為測量：不同組別間PPI值比較Table 1 Behavioral testing：Comparisons of PPI values among seven groups

2.2 GABARAP在聽皮層中mRNA的表達

慢性注射7天組與對照組相比，GABARAP mRNA表達無顯著差異（t=-0.376,P=0.732,P>0.05）；慢性注射14天組、停藥后恢復3天組、7天組和14天組與對照組的差異均無統(tǒng)計學意義（F=0.017,P=0.999,P=0.848,P=0.902,P=0.133,P>0.05）。（圖2）。

圖2 各組大鼠聽皮層中GABARAP mRNA的表達。A：SS7d組 GABARAP mRNA 表達無明顯變化（P>0.05）（n=6）；B：SS14d、HF3d、HF7d、HF14d組與NS14d組比較，GABARAP mRNA表達沒有差異性（P>0.05）（n=6）。Fig.2 GABARAP mRNA expression in the auditory cortex of each group of rats..A:No significant change in GAB‐ARAP mRNA expression in SS7d(P>0.05)(n=6);B:There was no difference in GABARAP mRNA expression between SS14d,HF3d,HF7d,HF14d and NS14d(P>0.05)(n=6).

2.3 GABARAP在聽皮層中蛋白的表達

慢性注射7天組與對照組相比，GABARAP蛋白表達升高（t=-2.403,P=0.037,P<0.05）；慢性注射14天組與對照組相比，GABARAP蛋白表達明顯升高（F=6.891,P=0.000,P<0.001），停藥后恢復3天組、7天組和14天組與對照組比較，GABARAP蛋白表達的差異沒有統(tǒng)計學意義（F=6.891,P=0.089,P=0.431,P=0.133,P>0.05）（圖3）。

圖3 各組大鼠聽皮層中GABARAP蛋白的表達A：慢性注射7天組GABARAP蛋白表達升高（*P<0.05）（n=6）；B：慢性注射14天組GABARAP蛋白表達明顯升高（***P<0.001）（n=6）；停藥后恢復3天組、7天組和14天組，GABARAP蛋白表達無明顯變化（P>0.05）（n=6）。Fig.3 GABARAP protein expression in the auditory cortex of each group of rats.A:The expression of GABARAP pro‐tein increased in SS7d(*P<0.05)(n=6);B:The expression of GABARAP protein was significantly higher in SS14d(***P<0.001)(n=6);There was no significant change in the expres‐sion of GABARAP protein in HF3d,HF7d and HF14d(P>0.05)(n=6)

2.4 GABARAP在聽皮層中熒光的表達

慢性注射7天組與對照組相比，GABARAP熒光表達升高（t=-3.315,P=0.008,P<0.05）；慢性注射14天組與對照組相比，GABARAP熒光表達明顯升高（F=8.616,P=0.000,P<0.001），停藥后恢復3天組、7天組和14天組與對照組比較，GABARAP熒光表達的差異沒有統(tǒng)計學意義（F=8.616,P=0.367,P=0.412,P=0.679,P>0.05）（圖4）。

圖4 各組大鼠聽皮層中GABARAP熒光的表達.。A：慢性注射7天組GABARAP平均熒光強度升高（*P<0.05）。B：慢性注射14天組GABARAP平均熒光強度明顯升高（***P<0.001）。停藥后恢復3天組、7天組和14天組與對照組比較，GABARAP平均熒光強度的差異沒有統(tǒng)計學意義（P>0.05）。數據用均數±標準差表示（n=6），標尺50μm，標記的標尺20μm。Fig.4 GABARAP fluorescence expression in the auditory cortex of each group of rats.A:The average fluorescence in‐tensity of GABARAP increased in SS7d(*P<0.05).B:The av‐erage fluorescence intensity of GABARAP was significantly increased in SS14d(***P<0.001).There was no significant dif‐ference in the mean fluorescence intensity of GABARAP be‐tween HF3d,HF7d and HF14d(P>0.05).The data were ex‐pressed as mean ± SD(n=6),and the scale was 50μm，the scale of marked ruler was 20μm.

3 討論

大劑量的水楊酸會引起人和動物強烈的耳鳴感。而PPI抑制率升高是動物耳鳴的表現(xiàn)[19]。PPI檢測反映了高級認知中樞對聽覺信息快速處理過程的調節(jié)[20]。與對照組相比，水楊酸鈉連續(xù)注射7天、14天組及停藥后恢復3天組大鼠的PPI抑制率顯著升高，這說明大鼠感知到了耳鳴。而停藥后恢復7天、14天組后大鼠PPI抑制率無明顯變化，表明耳鳴消失。Eggermont等人也指出，攝入大量的水楊酸會引起耳鳴和聽力下降，但是在停藥后這些癥狀會逐漸消失[21]。這與本研究一致，注射大劑量水楊酸鈉后，大鼠出現(xiàn)耳鳴，停藥恢復后大鼠耳鳴慢慢消失。

大腦中抑制性神經傳遞主要由通過GABAA受體介導作用的[22]。突觸后膜中GABAA受體的數量直接控制GABA能突觸傳遞的功效[23]。GABAA受體的運輸是調節(jié)抑制性突觸可塑性途徑的重要組成部分[24]。GABAA受體相關蛋白（GABARAP）對含有γ2亞基的GABAA受體的影響主要有兩個方面：（1）調節(jié)離子通道的特性，可能是通過促進受體的聚集；（2）可能通過增加受體的細胞內運輸來調節(jié)細胞表面表達[25]。過表達GABARAP將會增加細胞膜表面GABAA受體的表達水平，相反，干擾GABARAP與GABAAR的γ2亞基絲氨酸磷酸化位點結合，則會導致GABAA受體表達水平的降低[24,26]。聽皮層過度興奮是耳鳴的感知基礎，在本實驗中，長期注射水楊酸鈉誘導的耳鳴大鼠聽皮層中GABARAP的mRNA表達沒有變化，可能水楊酸鈉并不影響GABARAP的轉錄水平。而水楊酸鈉慢性注射7天、14天組，耳鳴大鼠聽皮層中GAB‐ARAP的蛋白和熒光表達都顯著升高；停藥后恢復3天、7天及14天組，GABARAP的蛋白和熒光表達無顯著差異。這表明，在水楊酸誘導的耳鳴大鼠聽皮層中，GABARAP表達增高，間接導致細胞膜表面的GABAA受體的表達水平升高。水楊酸鈉誘發(fā)耳鳴會伴隨聽皮層的興奮活動增加，這可能會導致抑制性受體GABAA受體的反饋性升高，來彌補興奮性受體的興奮毒作用，并隨著耳鳴的恢復GABAA受體逐漸恢復正常。GABARAP也與gephyrin相互作用，gephyrin與微管結合，并且已知是將甘氨酸和GABAA受體錨定在質膜上的重要成分[27,28]。GABARAP不僅運輸GABAA受體，而且運輸GABAA受體功能所需的其他蛋白質，例如gephy‐rin[25]。在長期水楊酸鈉應用的耳鳴大鼠聽皮層中，GABARAP的表達增加也可能是其他運輸GABAA受體功能的蛋白質數量升高導致的。

總之，長期水楊酸鈉應用導致大鼠耳鳴，這與聽皮層中轉運蛋白GABARAP表達增多有關。然而，在水楊酸鈉誘導的動物耳鳴中，GABARAP運輸GABAA受體的確切信號通路過程還需要進一步的研究來證實。