孫毅 劉雅琳 劉曉莉 孫麗麗 潘持國(guó) 張斌

山東省康復(fù)研究中心（山東省康復(fù)醫(yī)院）（濟(jì)南250109）

耳聾是由遺傳因素或環(huán)境因素導(dǎo)致的生理機(jī)能缺陷，嚴(yán)重影響人類健康和生活質(zhì)量。耳聾可以由單個(gè)基因位點(diǎn)突變或多基因位點(diǎn)突變引起，也可以由環(huán)境因素或基因和環(huán)境因素共同導(dǎo)致[1]。研究發(fā)現(xiàn)65%的耳聾是由遺傳因素引起的[2]。隨著對(duì)新生兒聽力篩查工作的開展，常規(guī)聽力學(xué)篩查逐漸顯現(xiàn)一定的局限性，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)藥物性耳聾和遲發(fā)性耳聾。因此，遺傳性耳聾基因篩查聯(lián)合聽力篩查尤為重要。本研究利用NGS Panel技術(shù)對(duì)山東地區(qū)新生兒進(jìn)行遺傳性耳聾基因檢測(cè)，相比于質(zhì)譜檢測(cè)方法和微陣列芯片檢測(cè)方法，該方法可覆蓋更多致聾基因和致聾位點(diǎn)，有利于實(shí)現(xiàn)早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)、早康復(fù)的長(zhǎng)效機(jī)制，為政府制定聽力殘疾防控體系提供科學(xué)依據(jù)，最終達(dá)到防聾減殘、提高人口素質(zhì)的目標(biāo)[3]。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

研究對(duì)象樣本主要來源于2019年4月至2019年10月，在山東省內(nèi)各地分娩的新生兒1056例，篩查前已明確告知聽力篩查和遺傳性耳聾基因檢測(cè)的相關(guān)知識(shí)，監(jiān)護(hù)人或家屬簽訂知情同意書。

1.2 聽力檢測(cè)方法

新生兒出生2-3天后，在自然睡眠狀態(tài)或喂奶安靜狀態(tài)下，在環(huán)境噪聲小于40dB（A）的房間內(nèi)，分娩醫(yī)院使用耳聲發(fā)射（Oto-acoustic Emissions,OAE）進(jìn)行聽力篩查，由儀器自動(dòng)判讀“通過”或“不通過”，聽力初篩未通過的新生兒，需要42天后進(jìn)行復(fù)篩。復(fù)篩未通過會(huì)將檢測(cè)結(jié)果告知家長(zhǎng)，并要求3月齡時(shí)進(jìn)行聽力學(xué)診斷。

本研究聽力損失程度以聽性腦干反應(yīng)（audi‐tory brainstem response，ABR）檢測(cè)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。ABR波Ⅴ反應(yīng)閾值≤30dB nHL為聽力正常的標(biāo)準(zhǔn)，波Ⅴ反應(yīng)閾值為31～ 50dB nHL視為輕度聽力損失，波Ⅴ反應(yīng)閾值為51～ 70dB nHL視為中度聽力損失，波Ⅴ反應(yīng)閾值為71～ 90dB nHL視為重度聽力損失，波Ⅴ反應(yīng)閾值＞90dB nHL視為極重度聽力損失。

1.3 耳聾基因檢測(cè)方法

新生兒出生2天后，由各助產(chǎn)機(jī)構(gòu)使用特定采血卡，采集新生兒足跟血2個(gè)血斑，每個(gè)血斑直徑不得小于8mm，常溫下自然晾干，分別裝入自封袋內(nèi)。實(shí)驗(yàn)室負(fù)責(zé)對(duì)標(biāo)本質(zhì)量進(jìn)行驗(yàn)收，驗(yàn)收合格后郵寄至北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司進(jìn)行18個(gè)遺傳性耳聾基因100個(gè)位點(diǎn)NGS Panel檢測(cè)，并在10個(gè)工作日內(nèi)將檢測(cè)結(jié)果反饋至新生兒出生分娩機(jī)構(gòu)。最后聯(lián)合聽力篩查結(jié)果和遺傳性耳聾基因檢測(cè)結(jié)果，隨訪新生兒聽力損失發(fā)生情況。

1.4 檢測(cè)流程

北京博奧醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司實(shí)驗(yàn)室首先進(jìn)行核酸提取，使用多重PCR技術(shù)一次性對(duì)GJB2，SLC26A4，GJB3，MYO15A，TECTA，DIABLO，COCH，DSPP，GPR98，DFNA5，TMC1，MT-CO1，MT-RNR1，MT-TH，MT-TS1，MT-TL1，PRPS1，MYO7A，18個(gè)致聾基因的100個(gè)已知致病位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于陽(yáng)性結(jié)果，使用Sanger測(cè)序復(fù)核結(jié)果后再進(jìn)行報(bào)告發(fā)放。

2 結(jié)果

2.1 聽力檢測(cè)結(jié)果分析

在1056例新生兒中，其中聽力篩查未通過者5人（0.47%），經(jīng)聽力學(xué)診斷確診聽力損失患兒3人（見表2），占篩查未通過的60.00%。其中，1例右耳中度聽力損失，左耳輕度聽力損失，另外2例單獨(dú)左耳輕度聽力損失。

2.2 基因檢測(cè)結(jié)果分析

對(duì)1056例新生兒全部進(jìn)行18個(gè)遺傳性耳聾基因100個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)耳聾基因突變者77例，檢出率為7.29%（見表1）。通過檢測(cè)結(jié)果分析顯示SLC26A4基因雜合突變檢出37例，檢出率為3.50%；GJB2基因突變檢出30例，檢出率2.84%，其中雜合突變29例，復(fù)合雜合突變1例；GJB3基因雜合突變檢出8例，檢出率0.76%；線粒體12SrRNA基因均質(zhì)突變1例，檢出率0.10%。SLC26A4基因突變合并線粒體12SrRNA基因突變的雙基因突變檢出1例。在3個(gè)聽力損失患兒中遺傳性耳聾基因檢測(cè)陽(yáng)性2例，分別為SLC26A4基因c.2168A＞G雜合突變和GJB2基因c.176-191del16/c.253T＞C復(fù)合雜合突變，陰性1人。

表1 1056例新生兒中100個(gè)致聾基因突變的攜帶率Table 1 Carrier frequency of 100 hotspot mutations 1056 randomly-selected cases

表2 兒童基本信息及聽力結(jié)果Table 2 Demographic information and audiological diagnoses of subjects

3 討論

耳聾是影響人類健康和造成人類殘疾的常見疾病。目前研究主要針對(duì)少數(shù)常見的與耳聾相關(guān)的基因中有限的熱點(diǎn)突變位點(diǎn)，只有少數(shù)能通過檢測(cè)尋找突變[4]。本研究采用NGS Panel的方法，檢測(cè)與耳聾相關(guān)的18個(gè)遺傳性耳聾基因中的100個(gè)致聾位點(diǎn)。如此大范圍的基因檢測(cè)覆蓋率有效的彌補(bǔ)了常規(guī)檢測(cè)方法的不足，不僅對(duì)耳聾相關(guān)基因突變頻率的預(yù)期更加準(zhǔn)確，也可以為醫(yī)務(wù)工作者對(duì)患者明確病因提供更加可靠的檢測(cè)結(jié)果。

3.1 耳聾基因攜帶者檢出結(jié)果分析

本研究共檢測(cè)山東地區(qū)新生兒1056例，耳聾基因篩查突變者77例，檢出率7.29%。高敏等對(duì)1737名孕婦進(jìn)行18個(gè)遺傳性耳聾基因100個(gè)致聾位點(diǎn)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)遺傳性耳聾攜帶率7.25%[5]，本研究結(jié)果與其報(bào)道基本一致。Shui lian Chen等對(duì)近年來全國(guó)各地區(qū)報(bào)道的18篇新生兒遺傳性耳聾基因檢測(cè)的文獻(xiàn)進(jìn)行meta分析，發(fā)現(xiàn)全國(guó)各地新生兒遺傳性耳聾基因攜帶率為4.70%[6]。王秋菊等對(duì)近年來全國(guó)出生的110余萬例新生兒進(jìn)行遺傳性耳聾基因檢測(cè)結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)遺傳性耳聾基因在新生兒中的攜帶率為4.78%[7]。兩項(xiàng)研究結(jié)果表明，在我國(guó)常見的遺傳性耳聾基因攜帶率基本一致。在此之前，山東地區(qū)學(xué)者報(bào)道了本地的遺傳性耳聾基因攜帶率，孫磊報(bào)道山東省濟(jì)寧市新生兒耳聾基因陽(yáng)性檢出率為5.60%[8]。本研究的遺傳性耳聾基因陽(yáng)性檢出率高于孫磊報(bào)道的5.60%，原因可能是檢測(cè)的目的致聾基因數(shù)量、方法及突變位點(diǎn)存在差異。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前我國(guó)最常見的耳聾基因檢測(cè)為9項(xiàng)、15項(xiàng)耳聾基因芯片檢測(cè)和20項(xiàng)飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)。每個(gè)地區(qū)檢測(cè)結(jié)果顯示，GJB2基因與SLC26A4基因變異攜帶率較接近[9]。參考孫磊報(bào)道數(shù)據(jù)（SLC26A4基因突變攜帶率2.19%），發(fā)現(xiàn)本研究的SLC26A4基因檢出率增加最明顯，增加率占總檢出率的17.97%（1.31%/7.29%）。孫磊、王秋菊等的檢測(cè)方法為飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)和耳聾基因芯片技術(shù)，對(duì)中國(guó)人常見GJB2、GJB3、SLC26A4和線粒體12srRNA等4個(gè)耳聾易感基因進(jìn)行檢測(cè)。本研究的檢測(cè)方法為NGS Panel法，對(duì)18個(gè)遺傳性耳聾基因100個(gè)致聾位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。因此造成本研究遺傳性耳聾基因攜帶檢出率高于孫磊等報(bào)道的5.60%及王秋菊等報(bào)道的4.78%。

3.2 遺傳性耳聾基因攜帶者等位基因檢出率分析

依據(jù)檢測(cè)結(jié)果中遺傳性耳聾基因攜帶者等位基因分析，本研究中SLC26A4基因的c.IVS7-2A＞G位點(diǎn)突變檢出率最高，為1.80%（19/1056），其次分別為c.2168A＞G 位點(diǎn)0.66%（7/1056），c.697G>C位點(diǎn) 0.28%(3/1056)，c.1174A>T、c.2027T>A 位點(diǎn)0.19%（2/1056），c.1975G>C、c.439A>G、c.259G>T、IVS16-6G＞A位點(diǎn)0.10%（1/1056）。學(xué)者研究報(bào)道，SLC26A4基因含有21個(gè)外顯子，在我國(guó)，約96%的前庭水管擴(kuò)大由此基因突變致病，在歐美國(guó)家僅有40%左右。說明在中國(guó)人群中SLC26A4基因型與表型關(guān)系更密切。許暉雁等的研究分析表明此基因的突變患者人工耳蝸術(shù)后聽力言語(yǔ)康復(fù)效果普遍較好，并且SLC26A4基因突變是獨(dú)立的預(yù)后因素[10]。在中國(guó)聾病人群中最常見的突變位點(diǎn)為 c.IVS7-2A>G，其次為 c.2168A>G[11]。2019 年Mahbobeh等對(duì)中東伊朗地區(qū)聾人基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SLC26A4基因的檢出率為6.39%，其中以c.1334T>G位點(diǎn)最為常見[12]。因此表明SLC26A4基因位點(diǎn)突變存在著明顯的地域和種族差異。本研究結(jié)果與我國(guó)前人研究結(jié)果一致，主要突變位點(diǎn)為c.IVS7-2A>G。

GJB2基因突變發(fā)生頻率最高位點(diǎn)是c.235delC，突變率為1.80%（19/1056），其它位點(diǎn)依次 為 c.299_300delAT位 點(diǎn) 0.47%（5/1056）、c.176del16位點(diǎn)0.38%（4/1056）、c.94C＞T位點(diǎn)0.10%（1/1056）。GJB2基因突變?cè)诒睔W猶太教徒、高加索人中，出現(xiàn)頻率較多的基因位點(diǎn)突變分別是c.35delG、c.167delT 和 c.235delC[13]。 在 亞 洲 ，c.235delC是最常見的位點(diǎn)突變，突變率為5.22%，戴樸等在2009年對(duì)2063例中國(guó)非綜合征性耳聾患者進(jìn)行GJB2基因突變頻譜研究發(fā)現(xiàn)，c.235delC突變位點(diǎn)最為常見，占GJB2基因致聾突變的68.9%，其次為c.299_300delAT[14]。本研究GJB2基因致聾位點(diǎn)與戴樸等的研究一致，突變頻率最高位點(diǎn)分別為c.235delC和c.299_300delAT。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)罕見致病位點(diǎn)c.94C＞T[15]，但本研究的突變檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于戴樸等的報(bào)道，原因在于本研究的對(duì)象為新生兒，前人研究多集中在聽障人群。

3.3 聽力篩查情況及基因陽(yáng)性聽力學(xué)特點(diǎn)

本研究新生兒聽力篩查特點(diǎn)，在1056例新生兒中聽力篩查未通過者5人，占全部人數(shù)的0.47%。經(jīng)聽力學(xué)診斷，確診聽力損失患兒3人，其中2人耳聾基因檢測(cè)陽(yáng)性。發(fā)現(xiàn)GJB2基因復(fù)合雜合突變患者1例，聽力學(xué)診斷結(jié)果顯示，右耳中度聽力損失，左耳輕度聽力損失，經(jīng)過隨訪發(fā)現(xiàn)聽力保持穩(wěn)定，未出現(xiàn)聽力再次下降。文獻(xiàn)報(bào)道，GJB2基因純合或復(fù)合雜合突變的兒童聽力損失程度以重度為主[16]，需長(zhǎng)期跟蹤隨訪。本研究中3例聽力篩查未通過的新生兒中，有1例通過18個(gè)致聾基因檢測(cè)，結(jié)果未見異常，表明可能存在檢測(cè)位點(diǎn)之外的基因突變，所以耳聾基因檢測(cè)并不能取代聽力篩查。但若不進(jìn)行基因檢測(cè)，由遺傳性因素導(dǎo)致的耳聾患者不能明確病因，以及耳聾基因攜帶個(gè)體不會(huì)被跟蹤隨訪，可能會(huì)對(duì)其父母再生育和他們的后代造成影響。目前耳聾疾病沒有理想的治療措施，但新生兒耳聾基因檢測(cè)是聽力篩查的重要補(bǔ)充，聽力篩查與耳聾基因聯(lián)合篩查可最大限度地早期發(fā)現(xiàn)聾病人群[17]。聽力檢測(cè)通過組的2名嬰兒被檢測(cè)出帶有MT-CO1:m.7444G>A突變，應(yīng)一生停用氨基糖苷類抗生素，以避免藥物誘發(fā)性聽力受損。特別是我們發(fā)現(xiàn)聽力檢測(cè)通過組的一名嬰兒同時(shí)也帶有其他基因突變。我們建議其盡早注意聽覺易感性變化，并且關(guān)注聽力健康。

4 結(jié)論

基因突變具有隨機(jī)性、不定向性、多害少利等特點(diǎn)，因此，本研究利用NGS Panel檢測(cè)技術(shù)對(duì)山東地區(qū)1056例新生兒進(jìn)行檢測(cè)，旨在提高檢測(cè)率，了解該地區(qū)可能致聾基因攜帶情況，為山東省新生兒耳聾的積極干預(yù)和治療提供了指導(dǎo)，為耳聾相關(guān)基因突變頻率的準(zhǔn)確估計(jì)提供了依據(jù)。