鄧佳麗，李 曉，安玉艷，林澤崑，汪良駒,2*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2青島海德坤生物科學(xué)研究院，青島 266200

無花果(FicuscaricaL.)屬于?？崎艑伲且环N常見的暖溫帶落葉果樹，也是人類馴化栽培最早的果樹之一[1]。1990年，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)與江蘇省腫瘤防治研究所合作研究證明，無花果具有明顯的抗癌效應(yīng)[2]，全國(guó)性的無花果產(chǎn)業(yè)開始蓬勃發(fā)展起來?，F(xiàn)在，無花果除了加工成果酒、果干、果醬等食品外，其醫(yī)藥保健特別是抗癌藥用仍然像謎一樣吸引人們[3]。只有把這種價(jià)值開發(fā)利用起來，這種古老的果樹才能真正造福于人類。

無花果富含多種醫(yī)藥活性成分，如黃酮[4]、苯甲醛[5]、多糖等[6]，其根、莖、葉、果、乳汁均可納入傳統(tǒng)藥源。許多研究者致力于從植物中提取天然多糖，認(rèn)為它們具有提高免疫活性[7]、降血糖[8]、抗腫瘤[9]等醫(yī)療功效。在無花果上，也有學(xué)者把其抗癌活性歸結(jié)為多糖組份，在Guo等[10]報(bào)道中，無花果果實(shí)多糖具有抗氧化活性，且能顯著抑制人體肝癌HepG2和胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)。Jiang[11]證實(shí)，無花果葉片多糖對(duì)人體肺癌細(xì)胞A549、宮頸癌細(xì)胞Hela、肝癌細(xì)胞HepG2均有不同程度的抑制效果。因而，無花果多糖可望用于人體腫瘤防治。但是，無花果品種眾多，特性各異，是不是所有品種多糖都具有抑癌活性，需要試驗(yàn)判明。另外，無花果葉片大，數(shù)量多，可以制作無花果茶[12]。但是，無花果茶品制作及飲用過程，主要考慮的是口感，很少涉及多糖在人體保健中作用。實(shí)際上，經(jīng)高溫?zé)崴莸臒o花果茶湯含有一定量多糖。這是無花果產(chǎn)品開發(fā)中有待探討的問題。前人對(duì)無花果多糖的研究多集中于果實(shí)，對(duì)葉片多糖研究尚少。不同品種間葉片多糖抑癌活性未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)首先分離提取純化三個(gè)不同品種不同月份無花果葉多糖，然后，利用MTT法比較了不同來源多糖對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制活性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究無花果葉多糖對(duì)癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)和機(jī)理，以期為無花果品種葉片綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

無花果品種由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院汪良駒教授鑒定。2019年7月至11月間，每月于江蘇省常州市圣王果蔬有限公司無花果園采摘‘布蘭瑞克’和‘瑪斯義陶芬’新梢中部成熟葉片，南京市浦口區(qū)翔辰家庭農(nóng)場(chǎng)無花果園采摘‘波姬紅’葉片。洗凈后，在110 ℃烘箱中殺青10 min，在80 ℃條件下烘干，磨碎成粉，過60目篩，以備多糖提取之用。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培養(yǎng)基(Lot No:AF29546226)、1×PBS緩沖液(Lot No:AF29511325)為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清FBS(Lot No:2232246)和0.25%胰蛋白酶(Lot No:2120734)來自Gibco公司；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別二甲基亞砜DMSO(Lot No:1209M0312)、MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)細(xì)胞增殖抑制試劑盒(Lot No:20200728)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(Lot No:20200825)、細(xì)胞周期DNA含量檢測(cè)試劑盒(Lot No:20200728)、活性氧ROS檢測(cè)試劑盒(Lot No:20201123)來自北京索萊寶生物科技有限公司；RNA simple Total RNA Kit試劑盒來自天根生化科技有限公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Lot No:G492)來自ABM公司。

1.2.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermo Electron Corporation)；倒置顯微鏡(Leica)；流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6 Ⅱ)；多功能酶標(biāo)儀(BioTek)；高速冷凍離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 多糖制備與精制

取無花果葉干粉1 kg，按1∶15物液比添加去離子水，在80 ℃熱水中浸提8 h。真空抽濾收集濾液。經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，添加無水乙醇，使乙醇濃度調(diào)至75%。4 ℃靜置過夜，離心收集沉淀，得到粗多糖。而后，經(jīng)AB-8大孔樹脂和Sevage法脫色除蛋白，3 kD透析袋透析，去除小分子寡糖，保留10個(gè)以上單糖組成的多糖，冷凍干燥成固體備用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人體胃癌SGC-7901細(xì)胞由中國(guó)藥科大學(xué)倪孟祥教授提供，培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI培養(yǎng)基上，置于37 ℃、5%CO2恒溫箱中。

1.3.3 無花果葉多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制影響

1.3.3.1 多糖品種月份篩選

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞溶液(濃度為1×105/mL)100 μL加到96孔板中，培養(yǎng)4 h至細(xì)胞貼壁，棄上清液。將不同品種不同月份的無花果葉精制多糖(2 mg/mL)溶液添加到細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄除培養(yǎng)基后，加入90 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，再培養(yǎng)4 h。棄除孔內(nèi)溶液后，加入110 μL DMSO，水平晃動(dòng)10 min，使晶體充分溶解，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度，以(1-OD樣品/OD空白)×100%作為癌細(xì)胞增殖抑制率。該試驗(yàn)生物學(xué)重復(fù)3次以上。

1.3.3.2 多糖濃度篩選

將無花果多糖濃度設(shè)置為0.5、1、2、4 mg/mL，按照上述方法測(cè)定不同濃度多糖對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制率。

1.3.4 細(xì)胞形態(tài)觀察

將SGC-7901細(xì)胞均勻鋪在6孔板中，用不同濃度多糖處理，培養(yǎng)48 h后在倒置光學(xué)顯微鏡(10×物鏡)下觀察SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.5 細(xì)胞周期分析

收集多糖處理48 h后的培養(yǎng)細(xì)胞，用PBS洗滌，經(jīng)300 g離心5 min，去除上清液，再用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，加入體積分?jǐn)?shù)為70%預(yù)冷乙醇500 μL固定，4 ℃過夜。染色前用PBS洗去固定液，250 g離心3 min。在細(xì)胞沉淀中加入100 μL RNase A 溶液，充分混勻，37 ℃水浴30 min。再加入400 μL PI染色液混勻，4 ℃避光孵育30 min后使用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm紅色熒光下檢測(cè)20 000以上細(xì)胞的細(xì)胞周期，用Flow Jo分析不同階段細(xì)胞比例[13]。

1.3.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集多糖處理48 h的培養(yǎng)細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌，300 g離心5 min，棄上清。用1 mL Binding Buffer(1×)懸浮細(xì)胞，300 g離心10 min，棄上清。用Binding Buffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106個(gè)/mL。吸取100 μL重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC溶液，混勻后在室內(nèi)避光處孵育10 min。加入5 μL PI，再孵育5 min。加入PBS至500 μL，輕輕混勻，在流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)515 nm的通道中檢測(cè)FITC，在發(fā)射波長(zhǎng)560 nm的通道中檢測(cè)PI。每次檢測(cè)10 000個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)low Jo分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3.7 細(xì)胞活性氧(ROS)含量檢測(cè)

收集多糖處理48 h后的培養(yǎng)細(xì)胞，離心去除培養(yǎng)液，按照1∶1 000比例，用無血清RPMI培養(yǎng)液稀釋10 mmol/L的熒光探針DCFH-DA，使熒光探針最終濃度為10 μmol/L。向細(xì)胞溶液中加入1 mL稀釋后的DCFH-DA溶液，充分混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育25 min。此期，每隔5 min顛倒混勻，使細(xì)胞與探針充分接觸。之后，用無血清培養(yǎng)基洗滌，以去除未進(jìn)入細(xì)胞中的探針。最后，將裝載好探針的細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀上在激發(fā)光波長(zhǎng)500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm的通道中收集10 000個(gè)細(xì)胞，F(xiàn)low Jo分析細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

1.3.8 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)

利用RNA simple Total RNA Kit試劑盒提取SGC-7901細(xì)胞RNA，利用微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA18S和26S條帶完整性。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。以該cDNA為模板，用RT-qPCR法測(cè)定p53、Bax、Bcl-2基因以及與細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如表1。

表1 用于 RT-qPCR 分析的引物序列Table 1 Oligonucleotide sequences for primers used in RT-qPCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次以上試驗(yàn)重復(fù)平均值，并做單因素或雙因素方差分析和Duncan氏顯著性測(cè)驗(yàn)。當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著；當(dāng)P< 0.01時(shí)，認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 無花果葉片多糖對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)

2.1.1 不同品種不同月份多糖對(duì)SGC-7901增殖的抑制效應(yīng)

3個(gè)無花果品種7～11月份的葉片多糖在2 mg/mL濃度下處理SGC-7901細(xì)胞48 h后，不同處理對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)均表現(xiàn)出一定程度抑制效應(yīng)(圖1)。從雙因素方差分析結(jié)果看，不同品種多糖對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制有極顯著差異(F > F0.01)，其中‘布蘭瑞克’對(duì)癌細(xì)胞增殖抑制率最高，總平均值為29.12%，極顯著高于后兩者(P< 0.01)?！Ъt’和‘瑪斯義陶芬’的平均抑制率分別為21.89%和19.37%，沒有顯著差異(P> 0.05)。從月份上看，7月和9月對(duì)細(xì)胞抑制效果最佳，且兩者抑制率相似，而8月、10月和11月的抑制率極顯著低于7月和9月(P< 0.01)。從具體品種和具體月份上看，布蘭瑞克9月多糖的抑制率最高，在2 mg/mL濃度下達(dá)到46.67%，極顯著高于其他品種或月份(P< 0.01)。其次是7月份‘布蘭瑞克’和‘瑪斯義陶芬’葉片，其抑癌率分別為32.92%和31.62%。其他月份多糖樣品對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率均小于30%，其中，‘瑪斯義陶芬’11月份葉片抑制率最低，僅有13.98%。這些結(jié)果為不同品種月份無花果葉片采集提供了理論依據(jù)。另外，介于‘布蘭瑞克’9月份葉片多糖抑癌率最高，可以選作后續(xù)試驗(yàn)的試材。

圖1 不同品種和不同月份無花果葉片多糖(2 mg/mL) 對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)Fig.1 Inhibition of leaf polysaccharides in a dosage of 2 mg/mL of three Fig varieties harvested in different months on SGC-7901 cell proliferation注：圖中相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:The same letters in the Figure represent no significant difference at P = 0.05 level.

2.1.2 ‘布蘭瑞克’無花果9月份葉片多糖抑制SGC-7901細(xì)胞增殖的濃度效應(yīng)

圖2顯示，0.5、1、2、4 mg/mL四個(gè)濃度‘布蘭瑞克’無花果葉片多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)。隨著多糖濃度增加，細(xì)胞增殖抑制率增加，相關(guān)系數(shù)r= 0.938*，達(dá)到P= 0.05顯著水平。當(dāng)多糖濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率為52.92%。

圖2 不同濃度無花果多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制率Fig.2 Inhibition of Fig polysaccharide in different concentrations on the proliferation of SGC-7901 cell line注：圖中不同字母代表在P = 0.05水平上差異顯著。Note:The different letters above the bars in the Figure represent significant difference at P = 0.05 level.

2.2 無花果葉片多糖對(duì)癌細(xì)胞形態(tài)的影響

通過倒置顯微鏡可以觀察無花果葉片多糖處理后SGC-7901細(xì)胞形態(tài)。如圖3，經(jīng)多糖溶液處理48 h后，對(duì)照細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞密度高，而處理細(xì)胞密度隨著多糖濃度增加而迅速下降，說明細(xì)胞增殖受到顯著抑制。其次，經(jīng)多糖溶液處理的細(xì)胞，死亡細(xì)胞數(shù)量增加，細(xì)胞形態(tài)從梭形逐漸變圓，細(xì)胞粘附性降低，表明無花果多糖導(dǎo)致胃癌SGC-7901細(xì)胞死亡。

圖3 不同濃度無花果多糖處理后SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化Fig.3 Morphological change of SGC-7901 cells treated by Fig polysaccharide in different concentrations注：A～E分別為0、0.5、1、2和4 mg/mL無花果多糖處理。Note:A-E are 0,0.5,1,2 and 4 mg/mL Fig polysaccharide treatment,respectively.

2.3 無花果葉片多糖阻滯SGC-7901細(xì)胞周期效應(yīng)

癌細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞分裂周期來實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞周期阻滯意味著細(xì)胞增殖受阻。圖4為流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的SGC-7901細(xì)胞周期結(jié)果。從中可以看出，隨著無花果葉片多糖濃度增加，處于G1期的細(xì)胞比例逐漸減少，當(dāng)多糖濃度達(dá)1 mg/L時(shí)，差異達(dá)到P= 0.05顯著水平。相反，處于S期細(xì)胞比例隨著多糖濃度上升而上升，當(dāng)濃度為1 mg/L時(shí)，差異達(dá)到P= 0.05顯著水平。如果濃度為2 mg/L時(shí)，S期細(xì)胞比例比對(duì)照高出25.13%，暗示著大量細(xì)胞阻滯于S期。與此不同的是，G2期細(xì)胞比例在多糖濃度在0～2 mg/L之間，沒有顯著差異(P> 0.05)，只有多糖濃度達(dá)4 mg/L時(shí)，G2期細(xì)胞比例顯著高于低濃度多糖處理，暗示著高濃度多糖處理將導(dǎo)致部分細(xì)胞周期在G2期受阻。整體上看，無花果葉片多糖處理將SGC-7901細(xì)胞周期阻滯在S期，細(xì)胞增殖因此受到抑制。

圖4 不同濃度無花果多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響Fig.4 Influence of Fig polysaccharide in different concentrations on the cycle of SGC-7901 cells注：A～E分別為0、0.5、1、2和4 mg/mL無花果多糖處理48 h后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的細(xì)胞周期圖；F為不同濃度多糖處理后三個(gè)細(xì)胞周期階段的細(xì)胞所占的百分率，圖中相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:A-E are the cell cycles detected by flow cytometry after Fig polysaccharide treatments in 0,0.5,1,2 and 4 mg/mL,respectively,for 48 h,and F is the cell percentage at different stages of cell cycles.The same letters in the Figure represent no significant difference at P = 0.05 level.

2.4 無花果葉片多糖促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡

為了了解無花果多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響，使用Annexin-V/PI試劑通過流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖5，其中象限Q1、Q2、Q3、Q4分別代表壞死、凋亡晚期、正常和凋亡早期細(xì)胞數(shù)量。在不同濃度多糖處理下，凋亡早期細(xì)胞百分率與對(duì)照相比沒有顯著差異，但是凋亡晚期細(xì)胞百分率隨著多糖濃度增加而上升。當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，處理比對(duì)照高出37.87%(P< 0.01)。當(dāng)多糖濃度達(dá)到4 mg/mL，處理比對(duì)照高出150%。另一方面，無花果多糖處理的死亡細(xì)胞比例增加，而且這種效應(yīng)在多糖濃度為0.5 mg/mL就存在(P< 0.05)，但是，在1、2、4 mg/mL間沒有差異。整體上看，活細(xì)胞百分率隨著多糖濃度上升而下降。當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，處理為對(duì)照的91.50%(P< 0.05)。多糖濃度達(dá)4 mg/mL時(shí)，處理降為對(duì)照的74.03%。這些結(jié)果表明，無花果多糖顯著促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡，降低活細(xì)胞比率。

2.5 無花果葉片多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞活性氧含量的影響

圖6結(jié)果顯示，不同濃度無花果葉片多糖處理促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加。當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，處理細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度比對(duì)照高出2.32倍；當(dāng)多糖濃度為4 mg/mL時(shí)，處理比對(duì)照高出5.58倍。顯然，無花果葉片多糖誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞ROS含量急劇上升是其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要原因。

2.6 無花果葉片多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

Bax是一種促細(xì)胞凋亡基因。圖7A結(jié)果顯示，無花果葉多糖處理顯著促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞Bax表達(dá)上調(diào)。這種效應(yīng)在多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)就顯著存在(P< 0.05)。當(dāng)濃度為2 mg/mL時(shí)，處理基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高出95%。類似地，p53為人體抑癌基因。該基因表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。圖7A顯示，除了無花果葉片多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，p53的相對(duì)表達(dá)顯著降低對(duì)照外，其他濃度多糖處理的p53相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照(P< 0.05)，說明一定濃度無花果多糖處理可以上調(diào)p53表達(dá)。相反，Bcl-2為抑制細(xì)胞凋亡基因。隨著無花果多糖濃度上升，SGC-7901細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)量逐漸下降。當(dāng)多糖濃度為1 mg/mL時(shí)，處理效應(yīng)達(dá)到P= 0.05顯著水平。當(dāng)多糖濃度達(dá)4 mg/mL時(shí)，處理Bcl-2相對(duì)表達(dá)量只有對(duì)照的1/4，說明無花果多糖處理抑制了促癌基因表達(dá)。

圖7 不同濃度無花果多糖處理對(duì)SGC-7901細(xì)胞基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of Fig polysaccharide in different concentrations on the gene expressions of SGC-7901 cells注：A：細(xì)胞凋亡相關(guān)基因；B：細(xì)胞周期相關(guān)基因。同一基因相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:A:Apoptosis-related genes;B:Cell cycle-related genes.The same letters in each gene represent no significant difference at P = 0.05 level.

為闡明無花果多糖抑制SGC-7901細(xì)胞增殖效應(yīng)與細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系，本試驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)以及細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinase，CDKs)編碼基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果如圖7B。隨著無花果葉片多糖濃度上升，兩類基因表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。其中，Cyclin B在mRNA水平下表達(dá)量受多糖濃度調(diào)節(jié)的效應(yīng)最為明顯。當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，處理組表達(dá)量降為對(duì)照的66.21%；當(dāng)多糖濃度為4 mg/mL時(shí)，只有對(duì)照的18.71%。Cyclin D1基因表達(dá)對(duì)多糖濃度也比較敏感，但是只有多糖濃度達(dá)2 mg/mL時(shí)，處理效應(yīng)才達(dá)到P= 0.05顯著水平。此時(shí)，處理的相對(duì)表達(dá)量只有對(duì)照的44.00%。類似地，Cyclin E基因?qū)o花果多糖處理也相當(dāng)敏感，而且在0.5 mg/mL多糖處理時(shí)，相對(duì)表達(dá)量降至對(duì)照的62.81%(P< 0.05)。此后，隨著多糖濃度增加，下降幅度更大。當(dāng)多糖濃度為4 mg/mL時(shí)，處理組僅為對(duì)照的31.86%，但由于標(biāo)準(zhǔn)誤較大，它與0.5 mg/mL處理間沒有顯著差異。另一方面，無花果葉片多糖抑制SGC-7901細(xì)胞周期蛋白依賴激酶基因CDKs表達(dá)。從圖7B可以看出，無論是CDK1，還是CDK2或者CDK6，經(jīng)多糖處理后，基因表達(dá)量均明顯下降。就CDK1而言，0.5 mg/mL多糖處理的抑制效應(yīng)沒有達(dá)到P= 0.05顯著水平，但當(dāng)多糖濃度達(dá)到1 mg/mL后，處理組基因表達(dá)量只有對(duì)照的70.86%(P< 0.05)。對(duì)CDK2來說，基因表達(dá)水平隨著多糖濃度上升而下降。0.5 mg/mL多糖處理的效應(yīng)就達(dá)到P= 0.05顯著水平。當(dāng)多糖濃度達(dá)到2或4 mg/mL時(shí)，基因表達(dá)水平約為對(duì)照的60%。類似地，基因CDK6表達(dá)對(duì)無花果葉片多糖處理也非常敏感。當(dāng)多糖濃度為0.5 mg/mL時(shí)，CDK6的相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照的46.37%(P<0.05)。當(dāng)多糖濃度升到4 mg/mL時(shí)，相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的21.42%。這些結(jié)果說明，無花果葉多糖顯著降低細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)。這對(duì)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡來說是至關(guān)重要的。

3 討論

業(yè)已證明，無花果多糖具有體外抗氧化活性[10]，能夠降血糖[8]，增強(qiáng)免疫力[7]，并具有抗腫瘤[11]等醫(yī)藥功效。Jiang[11]提出，無花果多糖對(duì)宮頸癌Hela和肝癌HepG2細(xì)胞都有明顯抑制活性，但對(duì)肺癌A549細(xì)胞的抑制活性較弱，說明無花果多糖對(duì)不同腫瘤細(xì)胞抑制效應(yīng)不同。Guo等[10]證明，無花果多糖不同組分對(duì)人體肝癌HepG2、胃癌SGC-7901、結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞均有明顯的抑制作用。其中2 mg/mL多糖組分-3對(duì)胃癌7901細(xì)胞的抑制率為54.49%。本文結(jié)果與此類似。當(dāng)‘布蘭瑞克’品種葉片多糖濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率為46.67%(見圖1)；濃度為4 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)52.92%(見圖2)。再次證明，無花果多糖具有明顯的抑癌活性，適當(dāng)濃度的多糖處理可以顯著抑制癌細(xì)胞增殖，導(dǎo)致細(xì)胞死亡(見圖3)。

前人有關(guān)無花果多糖及其抑癌活性研究很少涉及品種和采樣時(shí)間。但是，植物內(nèi)含物活性會(huì)因品種和時(shí)間的不同而不同。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，4個(gè)品種無花果葉片提取物均有降血糖作用，但不同品種對(duì)肝糖原的影響存在差異。本試驗(yàn)也獲得類似結(jié)果。我們發(fā)現(xiàn)，不同無花果品種、不同采集時(shí)間的葉片多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制活性存在明顯差異(見圖1)。在2 mg/mL試驗(yàn)體系中，‘布蘭瑞克’的平均抑制率最高，‘波姬紅’次之，‘瑪斯義陶芬’最后，說明‘布蘭瑞克’品種葉片更適合于多糖開發(fā)。另外，該品種9月份葉片多糖抑癌活性最高，7～8月其次，10～11月最次。這些結(jié)果為無花果葉片多糖抑癌功效的開發(fā)利用以及原料選擇提供了一定理論依據(jù)。

前人關(guān)于無花果多糖抗腫瘤的機(jī)理研究側(cè)重于抗氧化活性[10]或者免疫功能提高[7,11]。然而本文觀察到，無花果多糖處理將引起SGC-7901細(xì)胞內(nèi)ROS含量上升。這一效應(yīng)在0.5 mg/mL無花果多糖處理后便顯著存在，并且隨著多糖濃度上升而上升。當(dāng)多糖濃度為4 mg/mL時(shí)，處理細(xì)胞ROS含量比對(duì)照高出5.5倍(見圖6)，說明無花果多糖抑癌活性可能是通過誘導(dǎo)癌細(xì)胞ROS上升來促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的。這一觀點(diǎn)也符合目前流行的看法。比如，Halliwell[15]提出，過量ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜、脂質(zhì)、DNA的氧化損傷。Brosche等[16]認(rèn)為，氧化應(yīng)激與細(xì)胞凋亡有著密切相關(guān)性。Ding等[17]利用外源H2O2證明，活性氧能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。最近有人證明，黃芪多糖誘導(dǎo)人胃癌MGC-803凋亡過程中能誘導(dǎo)細(xì)胞ROS增加[18]。據(jù)此看來，本文觀察到的無花果多糖誘導(dǎo)ROS上升是其抑癌的重要方面。

本試驗(yàn)首次觀察到無花果多糖誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細(xì)胞凋亡(見圖3)。經(jīng)處理細(xì)胞其活細(xì)胞數(shù)量隨著多糖濃度上升而下降，凋亡晚期和死細(xì)胞數(shù)量顯著增加(見圖5)。進(jìn)一步觀察表明，無花果葉片多糖抑癌效應(yīng)可能與其抑制細(xì)胞周期有關(guān)。從圖4可以看出，無花果多糖對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的抑制效應(yīng)主要體現(xiàn)在S期。隨著多糖濃度上升，停滯在S期的細(xì)胞數(shù)量顯著上升。曾報(bào)道，柑桔皮多糖對(duì)移植性腹水瘤H22細(xì)胞增殖的抑制作用也表現(xiàn)在細(xì)胞周期的S期[19]，枸杞多糖抑制宮頸癌Hela細(xì)胞周期則在S期和G2/M期[20]。以上結(jié)果說明，細(xì)胞周期受阻，特別是S期DNA合成受阻可能是無花果多糖抑制癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。

業(yè)已明確，細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)以及細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinases,CDKs)在細(xì)胞周期中起到核心調(diào)控作用[21]。不同生物體內(nèi)存在著幾十種Cyclins，能與不同種類CDKs構(gòu)成Cyclin-CDK復(fù)合體，在細(xì)胞周期的不同階段起到激酶作用，誘發(fā)蛋白磷酸化，調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[22]。CDK2/Cyclin E復(fù)合體在G1晚期和S期高度表達(dá)。如果CDK2表達(dá)減弱，則S期啟動(dòng)受阻[23]。Cyclin D1/CDK4/CDK6蛋白復(fù)合物處在CDK2/Cyclin E復(fù)合物上游，也對(duì)G1/S期細(xì)胞分裂起調(diào)控作用[24]。Zhong等[25]發(fā)現(xiàn)，桑黃多糖抑制人體結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖時(shí)，大量細(xì)胞停滯在S期，同時(shí)，CDK2和Cyclin E蛋白表達(dá)水平下降。Ma等[13]研究表明，山楂多糖抑制人體結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖時(shí)也能誘導(dǎo)CDK1、CDK2、Cyclin A1、Cyclin D1和Cyclin E1基因表達(dá)下調(diào)。本試驗(yàn)結(jié)果與此類似。我們觀察到無花果多糖抑制人體胃癌SGC-7901細(xì)胞周期停滯于S期，同時(shí)細(xì)胞周期蛋白基因表達(dá)顯著下調(diào)(見圖7B)。經(jīng)無花果多糖處理的SGC-7901細(xì)胞CDK1、CDK2、CDK6、Cyclin B、Cyclin D1和Cyclin E基因表達(dá)顯著下降(見圖7B)。也許，正是細(xì)胞周期蛋白編碼基因表達(dá)受抑，無花果多糖阻滯細(xì)胞周期，從而抑制癌細(xì)胞增殖。

除了上述Cyclins和CDKs外，無花果葉片多糖處理還影響到抑癌基因p53和Bax以及促癌基因Bcl-2的表達(dá)(見圖7A)。在這三個(gè)基因中，Bax與Bcl-2屬于同一基因家族，其中，Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞周期，而Bax與Bcl-2形成二聚體，當(dāng)Bax高表達(dá)時(shí),Bax會(huì)自身形成同源二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡[26]。曾報(bào)道，白花蛇舌草多糖處理HepG2細(xì)胞導(dǎo)致Bcl-2基因表達(dá)量下降[27]；生姜多糖處理HepG2細(xì)胞導(dǎo)致Bax和p53等基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)下調(diào)Bcl-2基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]。我們把無花果多糖濃度、SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率與Bax、Bcl-2以及p53相對(duì)表達(dá)量做兩兩相關(guān)分析后發(fā)現(xiàn)，無花果多糖濃度與增殖抑制率的相關(guān)系數(shù)r= 0.938*，細(xì)胞增殖抑制率與Bcl-2相對(duì)表達(dá)量的相關(guān)系數(shù)r= -0.932*，但其它幾項(xiàng)指標(biāo)之間的相關(guān)性沒有達(dá)P= 0.05顯著水平。這暗示，雖然無花果多糖能夠誘導(dǎo)抑癌基因Bax和p53表達(dá)上調(diào)，但從濃度效應(yīng)上看，促癌基因Bcl-2表達(dá)下調(diào)可能更為重要。

綜上所述，本文分析了不同品種不同月份無花果葉多糖對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)‘布蘭瑞克’無花果品種9月份葉片多糖的抑制率最高。隨著多糖濃度上升，癌細(xì)胞增殖受抑，密度和粘附性下降，細(xì)胞形態(tài)從梭形變?yōu)閳A形，活細(xì)胞減少，死亡細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞比例上升。抑癌機(jī)理研究表明，無花果葉多糖將細(xì)胞周期阻滯在S期以及少量的G2期，促癌基因Bcl-2以及細(xì)胞周期相關(guān)基因(Cyclins和CDKs)表達(dá)下調(diào)，抑癌基因(Bax和p53)表達(dá)上調(diào)，細(xì)胞內(nèi)活性氧積累增加。這些都是無花果多糖促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的重要原因。這些結(jié)果為無花果葉片采集與抗癌藥物開發(fā)提供了一定理論依據(jù)。另外，目前已經(jīng)開發(fā)出的無花果茶[12]，主要是以葉片為原料，在熱水沖泡過程中應(yīng)該可以把無花果多糖浸提出來，但是它們是否具有抑癌活性，還有待進(jìn)一步研究。