胡雁萍，趙 迪，李煥茹，馮志毅，李 柯，馮素香*

1河南中醫(yī)藥大學(xué)；2呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心；3鄭州市中藥質(zhì)量控制與評價重點實驗室，鄭州 450046

女貞子為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實，味甘、苦、涼，入肝、腎經(jīng)，具有滋補肝腎、明目烏發(fā)之功效；可用于肝腎陰虛、眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明、內(nèi)熱消渴、骨蒸潮熱等[1]。女貞子中含有多種活性成分，如三萜類、環(huán)烯醚萜類、苯乙醇類、黃酮類、揮發(fā)油、糖類、氨基酸、甾醇類等[2,3]，具有抗糖尿病、抗腫瘤、護肝、抗氧化、抗炎、降糖、降脂、調(diào)節(jié)免疫等多種藥理作用，臨床上主要用于治療高脂血癥、骨質(zhì)疏松、結(jié)腸癌、肺癌、肝炎等疾病[4-8]。女貞子中的主要活性成分為環(huán)烯醚萜苷類，但女貞子的藥效并不靠個別成分含量決定[9]，女貞子中的苯乙醇類、黃酮類、環(huán)烯醚萜等成分因具有抗氧化、抗骨質(zhì)疏松等活性也被用于女貞子的質(zhì)量評價[10,11]，但仍然不夠完善，通過分析與女貞子發(fā)揮藥效相關(guān)的化合物群的含量才能真正評價女貞子藥材的質(zhì)量[11]。因此，本研究建立了同時測定女貞子中苯乙醇類(紅景天苷、松果菊苷)、黃酮類(槲皮素、芹菜素、蕓香苷、木犀草苷、木犀草素)和環(huán)烯醚萜類(橄欖苦苷、特女貞苷)等多種活性成分的含量測定方法，用于評價女貞子的品質(zhì)。

女貞子的炮制方法始見于宋代《瘡瘍》一書，女貞子傳統(tǒng)的炮制品沿用至今的有生品、酒制品，現(xiàn)代還增加了凈制品、蒸制品、鹽制品、醋制品等，臨床上常用生品和酒制品，女貞子生品清肝明目、滋陰潤燥，酒制后滋補肝腎作用顯著增強[12]。研究表明，女貞子酒制后補肝腎作用增強與女貞子中環(huán)烯醚萜苷類成分在炮制過程中發(fā)生水解轉(zhuǎn)化密切相關(guān)[13]，女貞子經(jīng)炮制后環(huán)烯醚萜類苷類成分和苯乙醇苷類成分含量降低，紅景天苷和苯乙醇苷元含量升高[14]。但是，這些研究比較零散，不具有系統(tǒng)性，不足以科學(xué)的評價女貞子炮制前后化學(xué)成分的變化。鑒于此，本研究采用UPLC-Q Exactive-Orbitrap高分辨質(zhì)譜建立同時測定女貞子中紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷的含量，分析不同產(chǎn)地女貞子中化學(xué)成分的分布規(guī)律，考察炮制前后女貞子中化學(xué)成分含量的變化，以期為規(guī)范女貞子飲片、炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜-四極桿-靜電軌道阱-高分辨質(zhì)譜儀(Q-Exactive，美國Thermo Scientific公司)；Xcalibur質(zhì)譜工作站；MS105DU型十萬分之一分析天平(瑞士梅特勒儀器有限公司)；AL204型萬分之一天平(梅特勒-托利多上海儀器有限公司)；KH-250E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Milli-Q POD超純水儀(Merck公司 德國)。

1.2 試藥

紅景天苷(批號：MUST-16041802，純度：98.96%)、蕓香苷(批號：MUST-16031712，純度：98.87%)、木犀草苷(批號：MUST-14060918，純度≥98%)、特女貞苷(批號：MUST-16021904，純度:98.01%)、橄欖苦苷(批號：MUST-16052512，純度：99.72%)、木犀草素(批號：MUST-14050411，純度≥98%)、芹菜素(批號：MUST-14050505，純度≥98%)、槲皮素(批號：MUST-15042714，純度：98.94%)、松果菊苷(批號：MUST-17030701，純度：98.88%)，均購自成都曼思特生物科技有限公司。甲醇、乙腈為色譜純，均購自美國Fisher公司；水為超純水；磷酸為分析純，購自洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司；黃酒(5年)購自浙江古越龍山紹興酒股份有限公司。

女貞子采集于不同地區(qū)，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)科謝小龍副教授鑒定為木犀科植物女貞LigustrumlucidumAit.的干燥成熟果實。樣品信息來源見表1，樣品均于2017年1月份采收。

表1 樣品信息 Table 1 Sample information

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

取22批不同產(chǎn)地女貞子藥材，按“2020版《中國藥典》四部通則0213燉法”進行女貞子藥材的炮制。炮制方法為：取女貞子藥材約100 g，加入黃酒20 g，拌勻，密閉悶潤4 h，在悶潤過程中，每隔半小時攪拌一次，置于蒸鍋中，密閉，蒸汽加熱燉制4 h，至女貞子呈黑褐色，取出，晾干備用。

2.2 供試品溶液的制備

取女貞子樣品粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，加80%的甲醇25 mL，稱定重量，超聲提取60 min(功率：700 W，頻率：40 kHz)，放至室溫，用80%的甲醇補足減失重量，濾過，蒸干。殘渣用80%的甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別取紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含1.92、3.63、0.69、17.23、17.98、0.61、0.23、0.60、5.18 mg的混合對照品溶液，備用。

2.4 色譜、質(zhì)譜條件

2.4.1 色譜條件

采用 Hypersll GOLD C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm，3 μm)，流動相為A：甲醇，B：0.1%(V/V)甲酸水溶液，梯度洗脫條件為：0～5 min：20%A；5～25 min：20%A→60%A，流速為0.2 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量5 μL。

2.4.2 質(zhì)譜條件

離子源為加熱電噴霧離子化源(HESI)，載氣為氮氣，鞘氣壓力3.5 Mpa(35 bar)，輔助氣壓力1.0 Mpa(10 bar)，噴霧電壓+3.50、-2.80 kV，毛細(xì)管溫度為350 ℃，輔助器加熱溫度200 ℃，分辨率為70 000，負(fù)離子模式掃描。對照品和女貞子樣品的LC-MS色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)及女貞子樣品的色譜圖(B)Fig.1 Chromatogram of reference substance (A) and sample of Ligustri Lucidi Fructus (B)注：1.紅景天苷；2.蕓香苷；3.木犀草苷；4.特女貞苷；5.橄欖苦苷；6.木犀草素；7.芹菜素；8.槲皮素；9.松果菊苷。Note:1.Salidroside;2.Rutin;3.luteolin-7-O-glucoside;4.Specnuezhenide;5.Oleuropein;6.Luteolin;7.Apigenin;8.Quercetin;9.Echinacoside.

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 檢測限與定量限

取各對照品溶液適量，加入甲醇溶液逐步稀釋，以信噪比3∶1時對應(yīng)待測物濃度為檢測限(LOD)，以信噪比10∶1時對應(yīng)待測物濃度為定量限(LOQ)進行測定，結(jié)果見表2。

2.5.2 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.3”項下混合對照品溶液，加甲醇分別稀釋2、5、10、20、50、100、200、500倍，制成一系列濃度的混合對照品溶液。分別精密吸取稀釋后混合對照品溶液5 μL，按照“2.4”項下條件測定，以各對照品峰面積(Y)對濃度(X)進行線性關(guān)系考察。

各個成分的線性回歸方程和線性范圍結(jié)果見表2，結(jié)果表明9個成分在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 9個成分線性實驗結(jié)果Table 2 Linear test results of nine components

2.5.3 精密度實驗

精密吸取同一混合對照品溶液，按照“2.4”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，分別計算紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷峰面積的RSD值，結(jié)果顯示，9個成分峰面積的RSD值分別為：0.89%、1.12%、0.92%、0.77%、0.42%、1.18%、1.08%、0.87%、0.78%，表明儀器的精密度良好。

2.5.4 重復(fù)性實驗

取S2女貞子樣品6份，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下色譜條件測定，計算各成分含量的RSD值，測得9個成分含量的RSD值分別為：1.83%、3.36%、1.37%、1.57%、1.05%、2.57%、1.62%、2.15%、1.14%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 穩(wěn)定性實驗

取S2女貞子樣品，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，按照“2.4”項下色譜條件分別在0、1、2、4、8、12、24 h進樣，分別計算紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷峰面積的RSD值。結(jié)果顯示，9個成分峰面積的RSD值分別為：1.43%、1.69%、0.93%、0.70%、1.91%、1.05%、1.30%、2.08%、0.79%。表明供試品溶液在室溫條件下24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.6 加樣回收率實驗

取已知含量的女貞子(S2)藥材粉末6份，約1 g，精密稱定，分別按照含量比為1∶1精密加入相應(yīng)量對照品溶液，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下條件測定，分別計算回收率及RSD值。實驗結(jié)果見表3，結(jié)果顯示各個成分加樣回收率的RSD值均<2.5%。表明該方法準(zhǔn)確性良好。

表3 9個成分加樣回收率實驗結(jié)果Table 3 Test results of recovery rate of nine components

續(xù)表3(Continued Tab.3)

續(xù)表3(Continued Tab.3)

2.6 含量測定

2.6.1 不同產(chǎn)地女貞子中9個成分含量測定

取不同產(chǎn)地的干燥女貞子樣品，每個樣品平行制備3份，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下條件測定9個成分的含量，其含量測定結(jié)果見表4。

表4 不同產(chǎn)地女貞子中9個成分含量測定結(jié)果(n=3)Table 4 Determination results of nine components in Ligustri Lucidi Fructus from different habitats(n=3)(mg/g)

2.6.2 不同產(chǎn)地女貞子炮制后9個成分含量測定

取不同產(chǎn)地女貞子樣品按照“2.1”項下方法炮制，按照“2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.4”項下條件測定女貞子中9個成分的含量，其結(jié)果見表5和圖2。

表5 炮制后女貞子樣品9個成分含量測定的結(jié)果(n=3)Table 5 Determination results of nine components in Ligustri Lucidi Fructus after processing(n=3)(mg/g)

圖2 女貞子炮制前后成分含量比較Fig.2 Comparative of components content of Ligustri Lucidi Fructus before and after processing

2.7 主成分分析

主成分分析(PCA)是一種可以將多個變量通過線性變換來選出較少個數(shù)重要變量的多元統(tǒng)計分析方法，可被用來考察多個變量之間的相關(guān)性。由于同一藥材中很多成分結(jié)構(gòu)相似且存在生源關(guān)系，所以其中成分的含量往往也存在相關(guān)性，主成分分析(PCA)則能夠?qū)哂邢嚓P(guān)性的變量進行降維[15]。將22批不同產(chǎn)地女貞子、不同產(chǎn)地女貞子炮制后的紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷等9種化學(xué)成分的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA14.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)得到主成分分析得分圖(見圖3)，不同產(chǎn)地、不同產(chǎn)地炮制后的女貞子樣品被分為2類。

圖3 不同產(chǎn)地(A)、不同產(chǎn)地炮制后(B)女貞子的PCA得分圖Fig.3 PCA scores of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A) and after processing (B)

2.8 偏最小二乘法判別分析

偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)采用分類響應(yīng)變量Y來提高類別間的分離，計算校正模型的數(shù)據(jù)包括校正誤差方根、交叉驗證誤差均方根以及測定的相關(guān)系數(shù)，采用SIMCA14.1軟件對22批不同產(chǎn)地女貞子、不同產(chǎn)地女貞子炮制后、不同產(chǎn)地女貞子炮制前后的9種化學(xué)成分的含量數(shù)據(jù)進行偏最小二乘判別分析。由圖4 PLS-DA得分圖可知，不同產(chǎn)地女貞子、不同產(chǎn)地女貞子炮制后的樣品可以分為2類，與主成分分析結(jié)果一致。VIP圖(見圖5、6)可以反映出每個成分在該模式下的貢獻程度，以VIP值>1為標(biāo)準(zhǔn)可知，特女貞苷、紅景天苷、木犀草苷、木犀草素、蕓香苷、橄欖苦苷、松果菊苷對產(chǎn)地劃分貢獻程度較大；特女貞苷、木犀草苷、蕓香苷、紅景天苷、木犀草素、松果菊苷對不同產(chǎn)地女貞子炮制后的劃分貢獻程度較大。木犀草苷、木犀草素、蕓香苷為不同產(chǎn)地女貞子炮制前后差異性的標(biāo)志物。

圖4 不同產(chǎn)地(A)和不同產(chǎn)地炮制后(B)女貞子PLS-DA的得分圖Fig.4 Score of PLS-DA of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A) and after processing (B)

圖5 不同產(chǎn)地女貞子(A)、不同產(chǎn)地女貞子炮制后(B)女貞子中9種成分的VIP值Fig.5 VIP values of nine components of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas (A) and after processing (B)

3 討論

3.1 不同產(chǎn)地女貞子含量測定結(jié)果分析

本研究通過建立LC-MS法測定女貞子中9個成分含量測定方法，對不同產(chǎn)地的女貞子成分的含量進行測定。2020年版《中國藥典》規(guī)定特女貞苷的限量不低于0.70%，在所測22批不同產(chǎn)地的女貞子藥材中，有3個產(chǎn)地(河南新鄉(xiāng)、河北保定、河南輝縣)的女貞子藥材中特女貞苷的含量低于2020年版《中國藥典》含量限度，占13.64%。其原因有待進一步研究。在不同產(chǎn)地中，河南鄭州、湖北當(dāng)陽、四川廣元、陜西楊凌、河南南陽、湖南長沙、湖南常德的紅景天苷和特女貞苷的含量較高，分別為0.986 2～1.544 0、12.850 0～18.106 6 mg/g。女貞子炮制后特女貞苷的含量明顯增加，均高于2020年版《中國藥典》含量限度。

圖6 不同產(chǎn)地女貞子炮制前后9種成分的VIP值Fig.6 VIP values of nine components of Ligustri Lucidi Fructus from different producing areas before and after processing

采用SIMCA14.1軟件對不同產(chǎn)地女貞子、不同產(chǎn)地炮制后的女貞子進行主成分分析，可將不同產(chǎn)地女貞子、不同產(chǎn)地女貞子炮制后各分為2大類，I類包括S2、S4、S6、S8、S13、S14、S15；Z2、Z4、Z6、Z8、Z13、Z14、Z15；II類包括S1、S3、S5、S7、S9、S10、S11、S12、S16～S22；Z1、Z3、Z5、Z7、Z9、Z10、Z11、Z12、Z16～Z22。由偏最小二乘判別分析中VIP圖可知，特女貞苷、木犀草苷、紅景天苷對產(chǎn)地劃分的貢獻程度較大，由分析結(jié)果可知，不同產(chǎn)地女貞子藥材質(zhì)量差異較大，這可能與藥材的生長環(huán)境差異有關(guān)，單純測定1或2種成分的含量不能有效反應(yīng)藥材的質(zhì)量，需要對女貞子的多種成分同時測定，才能全面的反映其內(nèi)在質(zhì)量[16]。

3.2 女貞子炮制前、后含量測定結(jié)果分析

女貞子炮制方法有多種，其中最常用的方法為酒制，酒制又有酒燉法和酒蒸法。本研究采用了酒燉法初步探討女貞子在炮制過程中成分含量的變化。女貞子經(jīng)酒燉后紅景天苷、特女貞苷、橄欖苦苷等含量明顯增加?？赡苡捎诰浦坪蟾淖兤浣M織結(jié)構(gòu)或成分的理化性質(zhì)，有利于成分的浸潤、溶解、置換、擴散等溶出過程的進行，產(chǎn)生助溶作用，提高有效成分的溶出率[17]，其具體影響因素有待于進一步深究。木犀草苷、木犀草素、蕓香苷對女貞子炮制前后的劃分貢獻較大，研究表明，女貞子炮制后，特女貞苷水解成紅景天苷，炮制后的女貞子中紅景天苷含量明顯增加[18]。

本研究通過超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法建立了不同產(chǎn)地、炮制前后的女貞子中紅景天苷、蕓香苷、木犀草苷、特女貞苷、橄欖苦苷、木犀草素、芹菜素、槲皮素、松果菊苷9個成分含量測定的方法，相對于紫外測定，本研究方法分離能力強，靈敏度高，定性分析結(jié)果可靠，檢測限低。不同產(chǎn)地女貞子藥材質(zhì)量差異較大可能與地域、氣候、土壤、生長年限和采收時間等因素有關(guān)，特女貞苷、木犀草苷、紅景天苷對產(chǎn)地劃分的貢獻程度較大。女貞子酒制后紅景天苷、特女貞苷、橄欖苦苷的含量明顯增加，可能由于酒制提高了有效成分的溶出率，具體原因有待深究。本實驗方法簡便、可靠，靈敏度高，為女貞子生品和炮制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善和提高提供了參考。