李燦杰,林定釵,許偉濱,蔡俊星,王文志,張玉波,2,李藥蘭,王國才*
1暨南大學中藥及天然藥物研究所;2暨南大學基礎醫(yī)學與公共衛(wèi)生學院藥理學系,廣州 510632
爵床科(Acanthaceae)爵床屬(Justicia)植物全球約600種,主要分布在熱帶地區(qū),包括印度、非洲和南美巴西等[1];根據爵床屬植物的化學成分和藥理活性研究的報道,該屬植物富含木脂素、三萜、黃酮及脂肪酸等化合物,顯示出明顯的抗腫瘤、抗病毒和抗炎活性[2-5],具有廣闊的開發(fā)潛力。
長萼爵床Justiciacalycina(Nees)主要分布在南美洲亞馬遜熱帶雨林地區(qū)[6],其藥用部位為干燥全草,作為厄瓜多爾地區(qū)的藥用植物之一,在當?shù)赜糜谥委煾忻翱人?、結膜炎、濕疹和癬瘡等。據文獻報道,長萼爵床新鮮葉子和花中富含精油,通過GC-MS進行成分測定鑒定出63種化合物,主要成分是單萜和倍半萜[7],而對該植物化學成分進行系統(tǒng)研究的報道較少。為了合理開發(fā)利用該植物資源,為其藥用作用提供科學依據,本實驗對長萼爵床全草95%乙醇提取物進行化學成分研究,并對分離得到的化合物進行抗RSV、HSV-1活性篩選和抗炎活性篩選。
SHIMADZU LC-2030C 3D型分析型高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司);CBM-20- A型制備型高效液相色譜儀(日本SHIMADZU公司);Agilent 6210 ESI/TOF型(美國Agilent公司)質譜儀;JASCO V-550可見光/紫外光譜儀(日本JASCO公司);Bruker AV-400/AV-500/AV-600 MHz型(德國Bruker公司)核磁共振波譜儀;JASCO FI/IR-480 Plus Fourier transform型紅外光譜儀(日本JASCO公司);Cosmosil 5C18-MS-II(4.6 mm × 250 mm,5 μm)分析色譜柱;Cosmosil 5C18-MS-II色譜柱(20 mm × 250 mm,5 μm)制備色譜柱;柱色譜硅膠(80~100目、200~300目,青島海洋化工廠);Sephadex LH-20色譜填料(瑞典Pharmacia 公司);ODS色譜填料(德國Merck公司);硅膠GF254薄層板(煙臺化學工業(yè)研究所);色譜純甲醇(山東禹王公司);其余試劑均為山東禹王公司分析純試劑。
實驗所用長萼爵床藥材于2018年1月采自南美洲厄瓜多爾亞馬遜熱帶雨林地區(qū),經暨南大學藥學院周光雄教授鑒定為爵床科爵床屬植物長萼爵床Justiciacalycina(Nees) 的干燥全草,標本(No.20180130)存于暨南大學中藥及天然藥物研究所。
1.2.1 提取分離
取干燥長萼爵床全草2.0 kg,粉碎,用95%乙醇滲漉提取3次,合并提取液后減壓濃縮,得到總浸膏100.0 g。將總浸膏進行硅膠柱層析(200~300目),以二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100,V/V)梯度洗脫,經TLC以及高效液相分析后合并得到5個餾分(Fr.1~5)。Fr.1經ODS柱層析以甲醇-水體系(40∶60→100∶0,V/V)梯度洗脫,再經制備型高效液相色譜分離純化后得到化合物4(9.3 mg)、5(6.5 mg)和6(7.5 mg)。Fr.2經Sephadex LH-20柱色譜以二氯甲烷-甲醇(1∶1)分離純化,再經制備型高效液相色譜分離純化后得到化合物13(10.0 mg)、14(10.0 mg)、15(4.1 mg)。Fr.3經制備型高效液相色譜分離純化后得到化合物7(8.2 mg)、8(4.8 mg)和9(5.3 mg)。Fr.4經ODS柱層析以甲醇-水體系(10∶90→100∶0,V/V)梯度洗脫,再經Sephadex LH-20柱色譜以二氯甲烷-甲醇(1∶1)分離純化,最后經制備型高效液相色譜分離純化后得到化合物1(6.3 mg)、2(7.6 mg) 和3(10.4 mg)。Fr.5經制備型高效液相色譜分離純化后得到化合物10(10.2 mg)、11(11.8 mg)和12(6.6 mg)?;衔?~15的化學結構如圖1所示。
1.2.2 抗RSV及HSV-1活性篩選
以呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)和單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus type 1,HSV-1)為研究對象,以10 μM利巴韋林(ribavirin)為抗RSV活性測試陽性藥物組,以10 μM阿昔洛韋(aciclovir)為抗HSV-1活性測試陽性藥物組,對分離得到的化合物在濃度為3.125、6.25、12.5、25、50、100 μM的濃度下,進行抗RSV和HSV-1活性篩選。
抗RSV活性測試所用的Hep-2細胞(抗HSV-1活性測試采用Vero細胞)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,于37 ℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并長成細胞單層。棄去細胞培養(yǎng)液,每孔加入50 μL樣品和50 μL 100 × TCID50的病毒稀釋液,設置陽性藥物組、病毒對照組和細胞對照組,置37 ℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48~72 h,待病毒對照組完全病變后,記錄各組病毒病變情況。
1.2.3 抗炎活性篩選
采用Griess法檢測對LPS誘導下RAW 264.7巨噬細胞分泌NO的抑制作用。RAW 264.7巨噬細胞接種于96孔細胞培養(yǎng)板中,37 ℃、5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并長成細胞單層后加入100 μL不同濃度的待測樣品(其濃度分別為3.125、6.25、12.5、25、50、100 μM),培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后加入100 μL的LPS(1 μg/mL),同時設置陽性對照組、模型組和空白對照組,繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將上清液與等體積的Griess試劑混合,用酶聯(lián)免疫檢測儀測定混合物在550 nm處的吸光度,同時采用MTT法測定細胞毒性。
化合物1白色針晶(CHCl3);mp.214~216 ℃;濃硫酸-香草醛反應顯藍紫色。ESI-MS:m/z449 [M+Na]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:4.68(1H,s,H-29a),4.57(1H,s,H-29b),3.19(1H,dd,J= 11.2,4.8 Hz,H-3),2.37(1H,m,H-19),1.68(3H,s,H-30),1.03(3H,s,H-28),0.97(3H,s,H-27),0.94(3H,s,H-26),0.83(3H,s,H-25),0.79(3H,s,H-24),0.76(3H,s,H-23);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:38.9(C-1),27.6(C-2),79.2(C-3),39.0(C-4),55.4(C-5),21.1(C-6),34.4(C-7),41.0(C-8),50.6(C-9),37.3(C-10),18.5(C-11),25.3(C-12),38.2(C-13),43.0(C-14),27.6(C-15),35.7(C-16),43.2(C-17),48.5(C-18),48.1(C-19),151.1(C-20),30.0(C-21),40.2(C-22),28.1(C-23),19.5(C-24),16.3(C-25),16.1(C-26),14.7(C-27),15.5(C-28),109.5(C-29),18.1(C-30)。以上數(shù)據與文獻[8]報道基本一致,故鑒定化合物1為羽扇豆醇。
化合物2白色針晶(CHCl3);mp.171~173 ℃;濃硫酸-香草醛反應顯藍紫色。ESI-MS:m/z435 [M+Na]+。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.15(1H,m,H-7),5.16(1H,dd,J= 15.2,8.8 Hz,H-22),5.03(1H,dd,J= 15.1,8.8 Hz,H-23),3.60(1H,m,H-3),1.03(3H,d,J= 6.6 Hz,H-21),0.85(3H,d,J= 6.4 Hz,H-27),0.80(3H,m,H-26),0.79(3H,m,H-19),0.55(3H,m,H-18);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:37.3(C-1),31.6(C-2),71.2(C-3),38.1(C-4),40.4(C-5),29.8(C-6),117.6(C-7),139.7(C-8),49.6(C-9),34.4(C-10),21.7(C-11),39.6(C-12),43.4(C-13),55.3(C-14),23.2(C-15),28.7(C-16),56.1(C-17),12.2(C-18),13.2(C-19),41.0(C-20),21.2(C-21),138.3(C-22),129.6(C-23),51.4(C-24),32.0(C-25),21.5(C-26),19.1(C-27),25.6(C-28)。以上數(shù)據與文獻[9]報道基本一致,故鑒定化合物2為α-菠甾醇。
化合物3淡黃色油狀物(CH3OH);濃硫酸-香草醛反應顯棕黑色。ESI-MS:m/z409 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz,CD3OD)δ:5.99(1H,d,J= 15.6 Hz,H-7),5.90(1H,s,H-4),5.74(1H,dd,J=15.6,7.2 Hz,H-8),4.56(1H,m,H-9),4.31(1H,d,J= 7.8 Hz,H-1′),2.61(1H,d,J= 17.0 Hz,H-2a),2.20(1H,d,J= 17.0 Hz,H-2b),1.97(3H,s,H-13),1.31(3H,d,J= 6.5 Hz,H-10),1.06(3H,s,H-11),1.04(3H,s,H-12);13C NMR(125 MHz,CD3OD)δ:42.4(C-1),50.8(C-2),201.2(C-3),127.1(C-4),167.1(C-5),80.0(C-6),133.8(C-7),133.7(C-8),74.6(C-9),22.2(C-10),19.5(C-11),23.5(C-12),24.7(C-13),101.3(C-1′),75.0(C-2′),78.2(C-3′),71.7(C-4′),78.4(C-5′),62.8(C-6′)。以上數(shù)據與文獻[10]報道基本一致,故鑒定化合物3為corchoionoside C。
化合物4淡黃色油狀物(CH3OH);濃硫酸-香草醛反應顯紫色。ESI-MS:m/z401 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.64~7.01(6H,m,Ar-H),4.85(1H,m,H-7),4.30(1H,m,H-8),3.85(2H,m,H-9),3.81(3H,s,3′-OCH3),3.80(3H,s,3-OCH3),3.56(2H,m,H-9′),2.61(3H,t,J= 7.8 Hz,H-7′),1.77~1.81(2H,m,H-8′);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:134.2(C-1),114.0(C-2),147.0(C-3),147.3(C-4),115,7(C-5),121.1(C-6),86.7(C-7),74.2(C-8),62.3(C-9),138.2(C-1′),111.8(C-2′),148.8(C-3′),151.9(C-4′),119.7(C-5′),121.9(C-6′),35.7(C-7′),32.8(C-8′),62.3(C-9′),56.4(3-OCH3),56.5(3′-OCH3)。以上數(shù)據與文獻[11]報道基本一致,故鑒定化合物4為1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-2-[4-(3- hydroxypropyl)-2-methoxy- phenoxy]-1,3-propanediol。
化合物5無色油狀物(CH3OH);濃硫酸-香草醛反應顯藍紫色。ESI-MS:m/z383 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:6.97(1H,d,J= 1.4 Hz,H-2′),6.83(1H,d,J= 1.6 Hz,H-3′),6.79(1H,s,H-2),6.77(1H,s,H-6′),6.74(1H,s,H-5),5.51(1H,d,J= 6.1 Hz,H-7′),3.87(3H,s,H-5′),3.83(3H,s,H-3),3.80(1H,m,H-9a),3.59(2H,t,J= 6.2 Hz,H-9′),3.49(1H,m,H-9b),2.65(1H,t,J= 7.4 Hz,H-7),1.84(1H,m,H-8),1.81(2H,m,H-8′);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:135.0(C-1),110.7(C-2),149.2(C-3),147.7(C-4),116.3(C-5),119.9(C-6),89.1(C-7),55.6(C-8),65.1(C-9),130.1(C-1′),114.3(C-2′),145.4(C-3′),147.7(C-4′),137.1(C-5′),118.1(C-6′),35.9(C-7′),33.0(C-8′),62.4(C-9′),56.9(3-OCH3),56.5(3′-OCH3)。以上數(shù)據與文獻[12]報道基本一致,故鑒定化合物5為4-(2,3-dihydro-3-hydroxymethyl-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxy-benzofuran-2-yl)-2-methoxyph-enol。
化合物6白色粉末(CHCl3);濃硫酸-香草醛反應顯棕黑色。ESI-MS:m/z251 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.52(1H,d,J= 16.0 Hz,H-11),7.49~7.51(2H,m,H-2,H-6),7.34~7.39(3H,m,H-3,H-4,H-5),6.60(1H,d,J= 16.0 Hz,H-10),5.97(1H,d,J= 2.2 Hz,H-7),5.54(1H,d,J= 2.2 Hz,H-8),3.84(3H,s,H-14);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:135.3(C-1),127.6(C-2),129.1(C-3),129.7(C-4),129.1(C-5),127.6(C-6),136.2(C-7),118.7(C-8),158.9(C-9),101.6(C-10),89.0(C-11),163.7(C-12),171.5(C-13),56.1(C-14)。以上數(shù)據與文獻[13]報道基本一致,故鑒定化合物6為5-styrylfuran-2- carboxylic acid methyl ester。
化合物7淡黃色針晶(CHCl3);mp.83~85 ℃;濃硫酸-香草醛反應顯綠色。ESI-MS:m/z201 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:9.66(1H,d,J= 7.7 Hz,H-1),7.38(1H,d,J= 15.8 Hz,H-3),7.13(1H,s,H-2′),7.07(1H,d,J= 8.1 Hz,H-6′),6.97(1H,d,J= 8.1 Hz,H-5′),6.56(1H,dd,J= 15.9,7.8 Hz,H-2),3.95(3H,s,3′-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:193.7(C-1),115.1(C-2),153.2(C-3),126.6(C-1′),124.2(C-2′),147.1(C-3′),149.1(C-4′),109.6(C-5′),126.6(C-6′),56.2(3′-OCH3)。以上數(shù)據與文獻[14]報道基本一致,故鑒定化合物7為ferulyl aldehyde。
化合物8無色油狀物(CHCl3);ESI-MS:m/z317 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:5.35(4H,m,H-9,H-10,H-12,H-13),3.66(3H,s,1′-OCH3),2.76(2H,t,J= 5.9 Hz,H-11),2.30(2H,t,J= 7.5 Hz,H-2),2.05(4H,m,H-8,H-14),1.61(2H,m,H-3),1.25~1.38(8H,m,H-4,H-7,H-15,H-17),0.88(3H,t,J= 6.9 Hz,H-18);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:174.6(C-1),34.3(C-2),22.8(C-3),29.3(C-4),29.3(C-5),29.6(C-6),29.8(C-7),27.4(C-8),130.3(C-9),128.1(C-10),25.9(C-11),128.3(C-12),130.4(C-13),27.4(C-14),29.4(C-15),31.7(C-16),22.8(C-17),14.3(C-18),51.6(1′-OCH3)。以上數(shù)據與文獻[15]報道基本一致,故鑒定化合物8為亞油酸甲酯。
化合物9無色油狀物(CHCl3);ESI-MS:m/z319 [M+Na]+。1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)δ:5.24(1H,t,J= 6.3 Hz,H-2),3.92(2H,d,J= 6.3 Hz,H-1),1.91(1H,m,H-4),1.55(3H,s,H-17),1.36(2H,m,H-5),1.34(1H,m,H-6a),1.30(2H,m,H-7),1.26(1H,m,H-6b),1.23(4H,m,H-9,H-13),1.16(3H,m,H-8a,H-10a,H-12a),1.07(2H,m,H-14),1.03(3H,m,H-8b,H-10b,H-12b),0.84(6H,d,J= 6.7 Hz,H-16,H-20),0.81(6H,d,J= 6.8 Hz,H-18,H-19);13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)δ:57.5(C-1),125.3(C-2),135.5(C-3),39.2(C-4),24.6(C-5),36.0(C-6),32.0(C-7),36.8(C-8),23.8(C-9),36.8(C-10),32.1(C-11),36.6(C-12),24.2(C-13),38.8(C-14),27.4(C-15),22.4(C-16),15.8(C-17),19.6(C-18),19.6(C-19),22.5(C-20)。以上數(shù)據與文獻[16]報道基本一致,故鑒定化合物9為3,7,11,15-tetra- methylhexadec-2-en-1-ol。
化合物10白色蠟狀固體(CHCl3);ESI-MS:m/z301 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:5.28~5.42(6H,m,H-9,H-10,H-12,H-13,H-15,H-16),2.80(2H,m,H-11,H-14),0.97(3H,t,J= 7.6 Hz,H-18);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:179.6(C-1),34.2(C-2),24.8(C-3),29.2(C-4),29.2(C-5),29.7(C-6),29.3(C-7),27.4(C-8),132.1(C-9),127.3(C-10),25.7(C-11),128.4(C-12),128.4(C-13),25.8(C-14),127.9(C-15),130.4(C-16),20.7(C-17),14.4(C-18)。以上數(shù)據與文獻[17]報道基本一致,故鑒定化合物10為α-亞麻酸。
化合物11白色晶體(CHCl3);mp.218~220 ℃;濃硫酸-香草醛反應顯紫色。ESI-MS:m/z441 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:6.11(1H,m,H-14),5.60(1H,d,J= 2.0 Hz,H-13),4.40(1H,m,H-8),4.32(1H,m,H-6),3.75(1H,m,H-4),2.19(1H,dd,J= 13.1,4.1 Hz,H-15),1.82(2H,m,H-16),1.67(2H,m,H-10),1.60(2H,d,J= 5.8 Hz,H-9),1.52(2H,m,H-5),1.50(2H,m,H-17),1.24(2H,dd,J= 11.2,5.1 Hz,H-2),1.06(3H,s,H-20),1.04(6H,s,H-19,H-22),0.82(3H,s,H-1),0.75(3H,s,H-18);13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:20.3(C-1),37.6(C-2),83.0(C-3),66.6(C-4),48.7(C-5),66.8(C-6),68.7(C-7),76.2(C-8),46.9(C-9),44.4(C-10),75.7(C-11),202.6(C-12),120.4(C-13),165.2(C-14),50.1(C-15),40.2(C-16),29.0(C-17),17.1(C-18),20.9(C-19),23.8(C-20),26.1(C-21),29.9(C-22)。以上數(shù)據與文獻[18]報道基本一致,故鑒定化合物11為3,7,11,15-tetramethyl-n-octadac-13-en-3,4,6,7,8,11-hexol-12-one。
化合物12白色針晶(CH3OH),mp.214~215 ℃;與三氯化鐵反應生成黃色無定形沉淀。ESI-MS:m/z161 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.48(2H,d,J= 8.1 Hz,H-2,H-6),6.77(2H,d,J= 8.1 Hz,H-3,H-5);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:122.8(C-1),131.7(C-2),115.8(C-3),163.6(C-4),115.8(C-5),131.7(C-6),169.3(C-7)。以上數(shù)據與文獻[19]報道基本一致,故鑒定化合物12為對羥基苯甲酸。
化合物13白色固體(CHCl3);三氯化鐵反應呈紫色。ESI-MS:m/z191 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:10.95(1H,s,4-OH),7.74(1H,d,J= 8.5 Hz,H-6),6.39(1H,d,J= 6.3 Hz,H-5),6.36(1H,s,H-3),3.91(3H,s,7-OCH3);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:105.8(C-1),162.1(C-2),103.1(C-3),163.7(C-4),107.8(C-5),131.9(C-6),170.3(C-7),52.0(7-OCH3)。以上數(shù)據與文獻[20]報道基本一致,故鑒定化合物13為2,4-二羥基苯甲酸甲酯。
化合物14白色粉末(CHCl3);濃硫酸-香草醛反應顯棕黑色。ESI-MS:m/z171 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ:7.79(1H,d,J= 15.8 Hz,H-3),7.56(2H,m,H-2′,H-6′),7.42(3H,m,H-3′,H-4′,H-5′),6.47(1H,d,J= 15.8 Hz,H-2);13C NMR(100 MHz,CDCl3)δ:171.1(C-1),117.3(C-2),147.1(C-3),134.2(C-1′),129.1(C-2′),128.5(C-3′),130.8(C-4′),128.5(C-5′),129.1(C-6′)。以上數(shù)據與文獻[21]報道基本一致,故鑒定化合物14為桂皮酸。
化合物15白色粉末(CH3OH);ESI-MS:m/z177 [M+Na]+。1H NMR(400 MHz,CD3OD)δ:7.45(1H,d,J= 8.6 Hz,H-6),7.42(1H,s,H-2),6.82(1H,d,J= 8.4 Hz,H-5);13C NMR(100 MHz,CD3OD)δ:123.2(C-1),115.8(C-2),146.0(C-3),151.5(C-4),117.7(C-5),123.9(C-6),170.3(C-7)。以上數(shù)據與文獻[22]報道基本一致,故鑒定化合物15為3,4-二羥基苯甲酸。
對長萼爵床中分離得到的15個化合物的抗RSV和HSV-1活性進行篩選,分別以利巴韋林、阿昔洛韋為陽性對照。結果顯示,化合物1~15均未表現(xiàn)出抗RSV和HSV-1活性(IC50> 100 μM)。
本試驗采用Griess法檢測對LPS誘導下RAW 264.7巨噬細胞分泌NO的抑制作用。結果表明,化合物1~7、14對LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞分泌NO的釋放均顯示一定的抑制作用。結果如表1所示。
表1 化合物1~15抗炎活性篩選結果Table 1 Anti-inflammatory activities of compounds 1-15 = 3)
本實驗對厄瓜多爾藥用植物長萼爵床中的化學成分進行了研究,對其95%乙醇提取物進行了化合物的分離和鑒定,從中分離、鑒定出了15個化合物,包括三萜類、木脂素類、脂肪酸類、苯甲酸類化合物及其他類化合物,所有化合物均是首次從該植物中分離得到。本實驗深入地了解該植物的化學成分,提供了長萼爵床更為豐富的化學信息。據文獻報道[2-5],該屬植物有抗病毒活性和抗炎活性,本文對分離得到的15個化合物的抗RSV和HSV-1活性進行測試,與陽性對照組相比,化合物1~15均未表現(xiàn)出抗RSV和HSV-1活性;經抗炎活性篩選發(fā)現(xiàn),化合物1~7、14有較好的抑制NO生成的活性。對于長萼爵床中抗病毒、抗炎活性的化學成分還需進一步的探索與研究,為更好地開發(fā)利用該植物、豐富該植物化學成分的種類和探究其有效活性成分奠定了一定的理論基礎。