楊保軍，梁琪*

1(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省功能乳品工程實(shí)驗(yàn)室(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué))，甘肅 蘭州，730070)

干酪中蛋白質(zhì)含量為25%～35%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，且以酪蛋白為主(約占總蛋白含量的80%)，酪蛋白根據(jù)結(jié)構(gòu)主要分為4種：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，比例為4∶1∶4∶1[1]。肽是蛋白質(zhì)降解過(guò)程中暫存的中間產(chǎn)物，在干酪成熟期間蛋白質(zhì)受到發(fā)酵劑乳酸菌自溶以及氨肽酶活性變化的影響，產(chǎn)生具有功能活性的小分子多肽[2]。乳源活性肽主要源自αs1-酪蛋白，其次為β-酪蛋白和αs2-酪蛋白，少部分來(lái)自κ-酪蛋白，一般由2～20個(gè)氨基酸發(fā)生縮合反應(yīng)形成肽鏈，且分子質(zhì)量<6 kDa[3]，按肽片段所含氨基酸個(gè)數(shù)可將其分為小肽(<7種氨基酸)、中等肽(7～25種氨基酸)和大肽(>25種氨基酸)。肽通常作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生積極影響，在調(diào)節(jié)人體心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等方面生理功效顯著[4]。肽的結(jié)構(gòu)特征，如肽鏈長(zhǎng)度、氨基酸組成、肽的物化特征(如氨基酸殘基的疏水性、分子電荷和側(cè)鏈)等都會(huì)影響其生物活性功能。但目前關(guān)于干酪源生物活性肽構(gòu)效關(guān)系的研究仍然較少，且按照傳統(tǒng)方法篩選和表征干酪中蛋白質(zhì)降解肽功能活性的時(shí)間較長(zhǎng)。一些生物信息學(xué)網(wǎng)址、肽數(shù)據(jù)庫(kù)和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析軟件等的使用極大縮短了肽功能活性預(yù)測(cè)和表征的周期。藥效團(tuán)模型、分子對(duì)接等生物信息學(xué)技術(shù)是針對(duì)大規(guī)模小分子進(jìn)行虛擬篩選的重要途徑，分子動(dòng)力學(xué)模擬工具能夠動(dòng)態(tài)描述分子的運(yùn)動(dòng)狀況，為分子水平解釋肽與受體蛋白相互作用提供理論參考。因此本文整理了以往文獻(xiàn)中關(guān)于干酪源生物活性肽功能活性與其所對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)特征之間的構(gòu)效關(guān)系，并就生物信息學(xué)技術(shù)在肽領(lǐng)域的應(yīng)用做了闡述，以期為干酪源生物活性肽的篩選、功能活性預(yù)測(cè)、表征和深度開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 干酪源多肽的產(chǎn)生

干酪是需要經(jīng)過(guò)發(fā)酵成熟的乳制品，在干酪發(fā)酵成熟過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生降解，干酪pH、鹽含量、成熟條件、發(fā)酵劑等均影響蛋白質(zhì)降解[5]。蛋白質(zhì)降解可分為兩步：(1)凝乳酶以及原乳中蛋白酶(纖溶酶和組織蛋白酶)降解乳中的αs-酪蛋白、β-酪蛋白，產(chǎn)生水不溶性大肽和水溶性肽[6]；(2)大肽和中等肽受細(xì)胞外、細(xì)胞包膜相關(guān)蛋白酶和發(fā)酵劑、附屬發(fā)酵劑蛋白酶降解形成小肽，細(xì)胞包膜裂解后釋放肽酶，肽酶促使小肽的降解和游離氨基酸的生成[7](圖1)。不同蛋白酶(不同切割位點(diǎn))作用于不同類型的酪蛋白(不同水解方式)會(huì)產(chǎn)生多條不同氨基酸序列的肽段，肽的功能活性與肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)(肽鏈長(zhǎng)短、氨基酸序列和組成、二硫鍵位置和數(shù)目)密切相關(guān)，因此不同干酪中蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的生物活性肽具有豐富的種類和功能，尤其在促進(jìn)人體健康、維持生理功能等方面具有重要作用[8]。

圖1 酪蛋白的降解途徑Fig.1 The degradation pathway of casein

2 干酪源肽的功能活性及其結(jié)構(gòu)特征

許多研究表明，活性肽段在蛋白質(zhì)氨基酸序列中以無(wú)活性狀態(tài)存在，但可通過(guò)酶解或微生物發(fā)酵等方式被釋放出來(lái)，發(fā)揮生物活性功能[9]。干酪蛋白質(zhì)來(lái)源、蛋白質(zhì)預(yù)處理方式(例如超聲和脈沖電場(chǎng)處理等)、肽酶的類型和水解條件等因素均會(huì)改變蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功效以及所產(chǎn)生肽的類型[10]，表1為部分干酪水溶性提取物(water-soluble extracts, WSE)的功能活性及其所對(duì)應(yīng)特征肽段的氨基酸序列。

表1 部分干酪水溶性提取物的功能活性Table 1 Functional activity of some cheese water-soluble extracts

2.1 ACE抑制活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系

ACE含有維持活性的Zn2+和Cl-，是腎素-血管緊張素和激肽-激肽釋放酶2個(gè)體系的關(guān)鍵性酶[16]。ACE抑制肽一方面是指抑制ACE將血管緊張素Ⅰ向血管緊張素Ⅱ(可使血壓升高)轉(zhuǎn)換，另一方面是指抑制ACE對(duì)舒緩激肽的破壞作用，從而達(dá)到降血壓目的[17]。2000—2016年，人們相繼在Gouda干酪[18]、雙歧桿菌發(fā)酵制得的低脂肪Festivo干酪[19]、生牛乳制作的white-brined干酪[20]、市售的Cheddar干酪[21]和墨西哥Cotija干酪[22]中發(fā)現(xiàn)了降血壓肽。SAITO等[18]在檢測(cè)的眾多干酪(8-mo-aged 24-mo-aged Gouda, Emmental, Blue, Camembert, Edam, Havarti)中發(fā)現(xiàn)8個(gè)月齡的Gouda干酪肽段顯示出對(duì)收縮壓的最強(qiáng)抑制作用(-24.7 mm Hg)和對(duì)血管緊張素I轉(zhuǎn)化酶的強(qiáng)烈抑制活性(75.7%)。RYHANEN等[19]也觀察到同樣的現(xiàn)象，F(xiàn)estivo干酪中肽的ACE抑制活性隨著干酪成熟時(shí)間和蛋白水解程度的變化而變化。STEPHANIE等[12]對(duì)3種澳大利亞市售Cheddar干酪的肽提取物進(jìn)行研究以后發(fā)現(xiàn)不同分子質(zhì)量肽組分的IC50存在差異，與分子質(zhì)量>10 kDa和分子質(zhì)量>5 kDa的組分相比較，分子質(zhì)量<5 kDa的肽組分具有更高的ACE抑制率。就肽的氨基酸鏈長(zhǎng)短而言，ACE抑制肽一般含有2～12個(gè)氨基酸殘基[23]。大多數(shù)研究表明降血壓肽具有典型的N端和C端氨基酸殘基(例如N端含有甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸，C端含有脯氨酸、酪氨酸和色氨酸)，這種結(jié)構(gòu)有助于肽和ACE結(jié)合，而亮氨酸可以提高ACE抑制效果，從而起到更好的降壓作用[24]。此外，肽的疏水性也會(huì)對(duì)其ACE抑制活性產(chǎn)生重要影響，如果肽的親水性過(guò)高，則會(huì)使得ACE抑制肽無(wú)法接近ACE活性部位，從而導(dǎo)致其活性較弱或無(wú)活性。SOLEYMANZADEH等[25]鑒定出具有ACE抑制作用的肽MYDYPQR(MR7)，研究發(fā)現(xiàn)該肽含有4個(gè)疏水性氨基酸、2個(gè)極性氨基酸和1個(gè)帶電氨基酸，肽的疏水性達(dá)57.14%，顯示出適度的疏水性，由于肽與ACE活性位點(diǎn)的結(jié)合與疏水性氨基酸有著本質(zhì)關(guān)系，造成MR7具有高的ACE抑制活性(0.002 3～0.027 g/L)。但ACE抑制肽的抑制能力顯然不能單純用肽鏈長(zhǎng)短、肽的分子質(zhì)量大小和氨基酸組成等來(lái)解釋，ACE抑制肽的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，其空間構(gòu)象也會(huì)有差別，這會(huì)影響肽與ACE活性位點(diǎn)的結(jié)合，進(jìn)而影響其ACE抑制能力，因此ACE抑制肽的立體構(gòu)象與其抑制能力的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

2.2 抗氧化活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系

抗氧化肽一般由5～16個(gè)氨基酸殘基組成，研究發(fā)現(xiàn)食源性抗氧化肽具有減緩人體衰老、降低人體癌癥患病率的功能，同時(shí)具有安全性強(qiáng)、水溶性好、致敏性低等優(yōu)點(diǎn)[26]。肽的抗氧化性主要與其組成、結(jié)構(gòu)和疏水性有關(guān)，王波[27]利用Caco-2細(xì)胞模型研究了肽組分的分子質(zhì)量大小、電荷性、疏水性對(duì)肽在小腸上皮細(xì)胞吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及生物利用度的影響，發(fā)現(xiàn)當(dāng)肽組分分子質(zhì)量<1kDa、帶有負(fù)電荷且是弱疏水性時(shí)，其吸收率和抗氧化性保留率值高，而且生物利用度顯著。相關(guān)研究已經(jīng)表明在意大利Stracchino軟質(zhì)干酪[28]、新鮮山羊乳干酪[29]和Cheddar干酪[12-13]中發(fā)現(xiàn)了具有抗氧化作用的生物活性肽，Stracchino軟質(zhì)干酪經(jīng)胃腸系統(tǒng)消化后，六肽(例如EAMAPK和AVPYPQ)含量高，抗氧化活性強(qiáng)，水牛乳和普通牛乳Cheddar干酪中提取的多肽均對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的自由基具有抑制作用。大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如纈氨酸或亮氨酸，并且序列中含有脯氨酸、組氨酸、酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等氨基酸[30]，有研究者認(rèn)為疏水性氨基酸的數(shù)量也會(huì)影響肽的功能活性，比如MENDIS等[31]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)抗氧化肽中含有2個(gè)苯丙氨酸和其殘基時(shí)，該肽具有更高的抗氧化活性；同時(shí)還有研究表明，當(dāng)抗氧化肽中含有芳香族氨基酸、酸性氨基酸以及堿性氨基酸時(shí)，抗氧化肽的活性會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)[32]，比如在帶有芳香族氨基酸色氨酸的環(huán)狀抗氧化肽中，由于色氨酸具有提供活性氫供體的能力，所以該抗氧化肽的活性較大[33]。此外，肽的分子質(zhì)量大小也是影響肽抗氧化活性的重要因素之一，TIMON等[34]的研究指出不同凝乳酶干酪中分子質(zhì)量<3 kDa的多肽都具有抗氧化作用，且主要源自αs1-酪蛋白。影響干酪源抗氧化肽抗氧化活性強(qiáng)弱的因素是多樣的，干酪中的抗氧化肽除了經(jīng)人體消化產(chǎn)生外，主要源自干酪成熟過(guò)程中的蛋白質(zhì)降解。分離、鑒定干酪中的抗氧化肽，探索干酪源抗氧化肽的形成機(jī)理和構(gòu)效關(guān)系，對(duì)開(kāi)發(fā)抗氧化肽含量高和抗氧化活性強(qiáng)的干酪產(chǎn)品具有積極作用。

2.3 抗菌活性與結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系

抗菌肽是由生物體產(chǎn)生的一種小分子陽(yáng)離子型活性肽，來(lái)源廣泛，而且相對(duì)分子質(zhì)量較小，具有生物活性功能的多肽長(zhǎng)度大多集中在21～30氨基酸[35]。自1974年HILL等[36]用凝乳酶水解牛乳αs1-酪蛋白得到了第一個(gè)抗菌肽(Isracidine)以來(lái)，眾多學(xué)者相繼用胰蛋白酶酶解牛乳酪蛋白得到抗菌肽Casocidin-I和Trip等，用胃蛋白酶酶解牛乳酪蛋白得到抗菌肽(Cp1)(對(duì)應(yīng)于αs1-酪蛋白99～109位殘基)和抗菌肽(Cp2)(對(duì)應(yīng)于αs2-酪蛋白183～207位殘基)。BARZYK等[37]、SEDAGHATI等[38]研究發(fā)現(xiàn)肽的疏水性對(duì)抗菌活性有影響，抗菌肽的N末端富含親水性氨基酸殘基，如賴氨酸、精氨酸等，C末端富含疏水性氨基酸殘基，如丙氨酸、甘氨酸，且通常被酰胺化，這是抗菌肽具有抗菌活性的關(guān)鍵因素之一[26]。此外，抗菌肽結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性受肽鏈長(zhǎng)度的影響，從而抑菌活性也受到肽鏈長(zhǎng)度的影響。PHAMBU等[39]通過(guò)傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)、掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)、熱重分析(thermogravimetric analysis, TGA)及差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry, DSC)研究表明理想的肽鏈長(zhǎng)度(含有6個(gè)氨基酸殘基的肽)可以增加分子內(nèi)氫鍵作用，從而保持肽鏈的穩(wěn)定性，進(jìn)而與陰離子的脂質(zhì)更好結(jié)合，發(fā)揮更強(qiáng)的抑菌作用。THéOLIER等[14]研究了加拿大5種市售干酪(Mozzarella, Gouda, Swiss, old Cheddar，medium Cheddar)脫鹽純化的水溶性提取物后發(fā)現(xiàn)，只有Mozzarella和Gouda干酪的水溶性提取物對(duì)ListeriaivanoviiHPB28和大腸桿菌MC4100有明顯的抗菌作用。FONTENELE等[40]研究了Coalho干酪酪蛋白衍生肽的生物活性后發(fā)現(xiàn)，β-酪蛋白肽(193～209)具有免疫調(diào)節(jié)、抗微生物和降壓活性，β-酪蛋白(58～72)，β-酪蛋白(193～202)，αs1-酪蛋白(85～91)，αs1-酪蛋白(1～9)以及αs2-酪蛋白(189～197)是具有降壓活性的肽片段，αs1-酪蛋白(1～23)是一種具有免疫調(diào)節(jié)活性和抗菌活性的肽片段，這些結(jié)果被確定為巴西干酪的權(quán)威性標(biāo)志。FIALHO等[41]借助MALDI-TOF/TOF、MASCOT Daemon與UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合對(duì)3種市售Minas干酪中提取的可溶性肽進(jìn)行測(cè)序和鑒定，發(fā)現(xiàn)起源于αs1-酪蛋白的肽序列PKHPIKHQ、RPKHPIKHQG、RPKHPIKHQGLPQ和RPKHPIKHQGLPQE是屬于Isracidine的片段，另外發(fā)現(xiàn)了2種β-酪蛋白衍生的新抗菌肽序列HQPHQPLPPT和MHQPHQPLPPT，但它們的生物學(xué)活性仍然未知?？咕牡目咕钚院艽蟪潭热Q于肽的結(jié)構(gòu)特征(尤其是二級(jí)結(jié)構(gòu))，目前對(duì)不同酪蛋白來(lái)源干酪抗菌肽抗菌活性的研究比較多，但局限于一級(jí)結(jié)構(gòu)且其構(gòu)效關(guān)系并不十分清楚，結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物信息學(xué)的發(fā)展為干酪源抗菌肽立體構(gòu)象和抗菌活性關(guān)系的研究提供了技術(shù)支持。

3 生物信息學(xué)技術(shù)在肽領(lǐng)域的應(yīng)用

肽的化學(xué)結(jié)構(gòu)信息與其生物活性密切相關(guān)，多肽的氨基酸組成和序列信息對(duì)其生物活性具有重要影響[42]。隨著生物活性肽構(gòu)效關(guān)系的深入研究，許多乳源蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)和活性肽氨基酸序列得到闡明，但隨機(jī)選擇肽段研究其生物學(xué)活性和分子機(jī)制又具有盲目性?；谟绊戨墓δ芑钚缘慕Y(jié)構(gòu)特征和理化因素，可以借助一些生物信息學(xué)網(wǎng)址提供的軟件和藥效團(tuán)模型等對(duì)大量肽片段進(jìn)行虛擬篩選，利用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬等生物信息學(xué)技術(shù)研究活性肽與受體蛋白之間相互作用的動(dòng)態(tài)變化功過(guò)程和分子機(jī)制。表2為蛋白質(zhì)降解肽理化分析時(shí)常用的生物信息學(xué)網(wǎng)址。

表2 肽功能活性研究時(shí)常用的在線生物信息學(xué)工具Table 2 Online bioinformatics tools commonly used in peptide functional activity research

4 總結(jié)和展望

綜上研究表明，干酪源生物活性肽的功能活性與肽段的分子質(zhì)量大小、肽鏈長(zhǎng)短、氨基酸序列及組成和疏水性等結(jié)構(gòu)特征密切相關(guān)。近年來(lái)乳源生物活性肽在理論研究上表現(xiàn)突出，新序列的干酪源多肽不斷被發(fā)現(xiàn)，但由于種種原因并未真正應(yīng)用到實(shí)際產(chǎn)品的生產(chǎn)加工過(guò)程中，且大部分活性肽的功能活性研究仍然局限于一級(jí)結(jié)構(gòu)和體外模型，體內(nèi)研究相對(duì)較少。因此，采用紅外光譜、核磁共振氫譜及圓二色譜等多種相關(guān)技術(shù)鑒定干酪源活性肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行更深入的體外研究，借助蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)、肽數(shù)據(jù)庫(kù)和分子對(duì)接軟件等生物信息學(xué)方法和技術(shù)，從分子水平揭示不同生物活性功能肽段與受體蛋白之間相互作用的分子機(jī)制，將理論模擬與實(shí)驗(yàn)過(guò)程有機(jī)結(jié)合，進(jìn)一步探究干酪源生物活性肽的酶切位點(diǎn)和作用機(jī)理，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提高干酪源生物活性肽在機(jī)體內(nèi)的靶向性和穩(wěn)定性，這對(duì)確保其成功的作為功效因子開(kāi)發(fā)制備功能食品，以此來(lái)改善人體健康具有重要意義。