馬秀娟 郝曉瑩

胚胎停育是指胚胎死亡后滯留于宮腔內(nèi)未自然排出；也可經(jīng)婦科B超檢查表現(xiàn)為妊娠囊內(nèi)胎芽或胎兒形態(tài)不整，無胎心搏動，或表現(xiàn)為枯萎卵胚。近年來胚胎停育的發(fā)生率逐年增加，不僅給希望孕育生命的家庭帶來沉重的打擊，也成為影響廣大育齡期女性身心健康的重大公共衛(wèi)生問題。導(dǎo)致胚胎停育的因素有很多，其中備受關(guān)注的就是胚胎血管形成方面。為了更好了解胚胎停育的發(fā)生機制，為胚胎停育的發(fā)生提供有力的理論依據(jù)，本研究試圖通過研究胚胎停育絨毛組織中缺氧誘導(dǎo)因子-1a(hypoxia-inducible factor-1a，HIF-1a)、血管內(nèi)皮生長因子(ascular endothelial growth factor，VEGF)及組織蛋白酶S(cathepsin-S,CatS)的表達(dá)水平來探討它們在胚胎發(fā)育早期相對缺氧的環(huán)境中可能的作用。

對象與方法

1、研究對象

選取2018年3月28日—8月28日經(jīng)B超證實為胚胎停育，在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科門診行人工流產(chǎn)術(shù)者20例的絨毛組織作為胚胎停育組。納入條件：停經(jīng)49-70天，經(jīng)B超證實為宮內(nèi)妊娠，但胚胎無心管搏動且停止發(fā)育，近3月未服用激素類藥物；血常規(guī)、凝血功能正常；白帶常規(guī)無明顯異常；排除生殖解剖結(jié)構(gòu)異常及生殖道感染史；無傳染病史；雙方均否認(rèn)遺傳病史；經(jīng)染色體基因檢測排除染色體問題所致胚胎停止發(fā)育。排除條件：存在生殖器畸形；患有免疫系統(tǒng)疾病；孕期前3個月患有感染性疾病，使用過免疫抑制劑；合并內(nèi)分泌異常；近期有手術(shù)創(chuàng)傷史等。標(biāo)本采集時通過山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會審核、批準(zhǔn)，患者均知情并簽署同意書。

選取同時期經(jīng)B超證實為宮內(nèi)妊娠活胎，因非意愿妊娠在山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦產(chǎn)科門診要求行人工流產(chǎn)術(shù)的正常早孕婦女20例作為正常早孕組。胚胎停育組年齡：(28.5±2.6)歲，孕齡：(63.2±2.5)d；正常早孕組年齡：(27.5±2.3)歲，孕齡：(63.9±2.4)d。兩組患者在年齡、孕齡方面相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

2、標(biāo)本采集

取兩組患者經(jīng)人工流產(chǎn)術(shù)后的新鮮絨毛組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后，取新鮮絨毛組織5 g，液氮速凍后，存于-80 ℃冰箱備用。

3、實驗方法

(1)總RNA提取。分別取1 cm*1 cm絨毛于液氮中研磨成粉末后,用 Trizol 試劑法提取細(xì)胞總RNA,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA廠家)說明書要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄步驟操作,以獲得 cDNA。引物序列為①HIF-1a上游引物為TCTCCATCTCCTACCC，下游引物為CTCCTTTTCCTGCTCT，PCR產(chǎn)物為106bp。②VEGF上游引物為ATGGCAGAAGGAGGAGGG，下游引物為CGATTGGATGGCAGTAGC，PCR產(chǎn)物為82bp。③CatS上游引物為GGACTGGAGAGAGAAAGG，下游引物為TTGTAGGGATAGGAAGCG，PCR產(chǎn)物為264bp。④以β-Actin作為內(nèi)參照，β-Actin上游引物為ACACTGTGCCCATCTACG，下游引物為TGTCACGCACGATTTCC，PCR產(chǎn)物為153bp。每組標(biāo)本重復(fù)測量3次，取平均值后進(jìn)行統(tǒng)計分析。引物均購買自武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司。

(2)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(everse transcription— polymerase chain reaction,RT-PCR)測定胚胎停育組與正常早孕組絨毛中HIF-1a、VEGF及CatS mRNA的表達(dá)水平。檢測RT-PCR反應(yīng)體系為：總體積20 ul,上游引物和下游引物各5 mmol，模板DNA 1 ul，SYBR green I 染料10 ul，用雙蒸水補足至20 ul。熒光定量PCR 儀為：CFX-Connect 96。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min,95 ℃變性5 s，56 ℃退火10 s，72 ℃延伸25 s，共39個循環(huán),并且做熔解曲線分析(melt curving)。本研究的實驗數(shù)據(jù)采用2-△△Ct方法進(jìn)行分析，2-△△Ct表示胚胎停育組目的基因的相對表達(dá)量，即相對于正常早孕組目的基因的變化倍數(shù)。用內(nèi)參基因β-actin對目的基因的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。

4、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布的計量資料經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后再行統(tǒng)計分析；兩組間的比較選擇獨立樣本t檢驗，各指標(biāo)間相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1、RT-PCR檢測HIF-1a mRNA在胚胎停育組和正常早孕組絨毛中的表達(dá)水平

實驗中HIF-1a、β-actin的擴增曲線均達(dá)到平臺期，所取數(shù)值可以用于后面的實驗分析，HIF-1a和內(nèi)參基因β-actin的溶解曲線，均可見一個單峰，表明PCR產(chǎn)物HIF-1a、內(nèi)參基因β-actin PCR引物設(shè)計合理，無多聚體現(xiàn)象。

從圖1中可知，胚胎停育組與正常早孕組絨毛組織中均有HIF-1a mRNA表達(dá)，正常早孕組中HIF-1a mRNA相對表達(dá)量設(shè)為1，胚胎停育組HIF-1a mRNA相對表達(dá)倍數(shù)為0.3，表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 胚胎停育組與正常早孕組絨毛組織HIF-1a mRNA的相對表達(dá)量

2、RT-PCR檢測VEGF mRNA在胚胎停育組和正常早孕組絨毛中的表達(dá)水平：

實驗中VEGF的擴增曲線可達(dá)到平臺期，所取數(shù)值可以用于后面的實驗分析；其溶解曲線圖可見一個單峰，表明PCR產(chǎn)物VEGF PCR引物設(shè)計合理，無多聚體現(xiàn)象。內(nèi)參基因β-actin如前。

從圖2中可知，胚胎停育組與正常早孕組絨毛組織中均有VEGF mRNA表達(dá)，正常早孕組中VEGF mRNA相對表達(dá)量設(shè)為1，胚胎停育組VEGF mRNA相對表達(dá)倍數(shù)為0.5，表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 胚胎停育組與正常早孕組絨毛組織VEGF mRNA的相對表達(dá)量

3、RT-PCR檢測CatS mRNA在胚胎停育組和正常早孕組絨毛中的表達(dá)水平

實驗中CatS的擴增曲線達(dá)到平臺期，所取數(shù)值可以用于后面的實驗分析；其溶解曲線圖可見一個單峰，表明PCR產(chǎn)物CatS PCR引物設(shè)計合理，無多聚體現(xiàn)象。內(nèi)參基因β-actin如前。

從圖3中可知，胚胎停育組與正常早孕組絨毛組織中均有CatS mRNA表達(dá)，同樣正常早孕組中CatS mRNA相對表達(dá)量設(shè)為1，胚胎停育組CatS mRNA相對表達(dá)倍數(shù)為0.4，表達(dá)量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 胚胎停育組與正常早孕組絨毛組織CatS mRNA的相對表達(dá)量

4、HIF-1a、VEGF、Cathepsin S與CatS的相關(guān)性

胚胎停育組HIF-1a與VEGF之間、VEGF與Cathepsin S之間、HIF-1a與CatS之間均呈正相關(guān)(圖4A，B，C)。

圖4 HIF-1a、VEGF、Cathepsin S與CatS的相關(guān)性A：胚胎停育組HIF-1a與VEGF的相關(guān)性；B:胚胎停育組VEGF與Cathepsin S的相關(guān)性；C：胚胎停育組HIF-1a與CatS的相關(guān)性

討論

1、胚胎血管及缺氧環(huán)境的形成

胚胎血管形成發(fā)生在受精后約18天，開始于胎盤絨毛中，通過血管發(fā)生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)兩個連續(xù)的過程形成。

胎盤的初始步驟發(fā)生在低氧環(huán)境中。而低氧環(huán)境的形成是由于妊娠10～12周之前，細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞亞群進(jìn)入100～150個螺旋動脈形成滋養(yǎng)細(xì)胞栓[1]，使胚胎與母體循環(huán)相對分離，,盡管母體側(cè)氧分壓(Partial Pressure of Oxygen pO2)在90mmHg，胚胎側(cè)pO2值卻很少超過30mmHg[1],從而在正常胚胎發(fā)育過程中形成了低氧環(huán)境，有證據(jù)表明，維持低氧是保持胚胎細(xì)胞的多能狀態(tài)[4]，并刺激細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞的增殖、侵襲和重塑所必須[5]，同時也是保護(hù)自己免受氧化劑的傷害[3]。此外，低氧是生長的絨毛樹中血管生成的誘導(dǎo)物，參與胎盤的生長和血管形成[6]。

2、HIF-1a、VEGF與缺氧及血管形成的關(guān)系

缺氧可能導(dǎo)致胎盤和胚胎分化。 其中一個關(guān)鍵的氧傳感途徑涉及缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1a。 HIF-1a是被認(rèn)為是一個主分子開關(guān)，激活多個基因通路，使細(xì)胞能夠響應(yīng)低氧水平。多達(dá)10%的基因組可能被HIF激活。HIF-1a通常在氧氣存在下迅速降解，但隨著氧氣張力降至5%以下，其降解速度減慢，DNA結(jié)合活性穩(wěn)定增加[7]。被激活的靶基因可以誘導(dǎo)厭氧過程，減少耗氧，并促進(jìn)血管生成[8]。在許多因缺氧而上調(diào)的基因中，最主要的是VEGF，其在胚胎中主要與HIF-1a共定位。VEGF是最主要的可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、血管形成和增加血管通透性的因子。胚胎早期血管的形成對于胚胎正常發(fā)育至關(guān)重要，其形成不足將導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育。

已有動物研究顯示[9]在胚胎早期相對缺氧的微環(huán)境中有HIF-1a表達(dá)，其表達(dá)在絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞胞核，而且HIF-1a可以直接引起VEGF的改變，在此基礎(chǔ)上觀察了正常絨毛組織及胎停育絨毛組織中HIF-1a及VEGF的表達(dá)。本實驗結(jié)果顯示在正常絨毛組織中及胎停育絨毛組織中均有HIF-1a 的表達(dá)，而且胚胎停育絨毛組織中HIF-1a、VEGF的表達(dá)較正常早孕組明顯減少，提示在胚胎早期發(fā)育相對缺氧環(huán)境中，HIF-1a、VEGF的正常表達(dá)有利于胚胎早期胎盤血管的形成，而HIF-1a表達(dá)下降可以引起VEGF表達(dá)下降，從而可能使胚胎發(fā)育早期胎盤血管形成受到影響。從而致胚胎血管功能減低及形成缺陷，進(jìn)一步致胚胎停止發(fā)育。

3、CatS、VEGF與缺氧及血管形成的關(guān)系

血管形成對胚胎發(fā)育起重要作用。新血管形成的過程除了血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成，還離不開細(xì)胞外基質(zhì)重塑如內(nèi)皮細(xì)胞外基底膜的降解，其涉及各種蛋白水解酶系統(tǒng)[10]。其中最重要的就是半胱氨酸組織蛋白酶(cysteine cathepsin，CTS)，可使內(nèi)皮細(xì)胞外基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞穿透血管基底膜到周圍的間質(zhì)，進(jìn)而促使毛細(xì)血管生成。在內(nèi)皮細(xì)胞分泌的半胱氨酰組織蛋白酶家族的成員中CatS具有以上屬性，使其成為血管生成過程中基質(zhì)降解的良好候選物[11]。

缺氧環(huán)境下CatS的表達(dá)已有相關(guān)報道，在“腫瘤”缺氧條件下內(nèi)皮表達(dá)高水平的組織蛋白酶S轉(zhuǎn)錄物，而在常氧條件下在相同細(xì)胞中不存在此種現(xiàn)象[12]。最近Li等人研究顯示結(jié)扎小鼠左側(cè)股動脈誘導(dǎo)缺血缺氧環(huán)境，缺血缺氧應(yīng)激使CatS蛋白和體內(nèi)活性升高，有助于缺血缺氧誘導(dǎo)的新血管形成，CatS敲除導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的侵襲，增殖和血管形成缺陷[13]。 這些結(jié)果證實了缺氧環(huán)境下內(nèi)源性組織蛋白酶S過表達(dá)，有促血管生成的作用。因此人體妊娠早期母胎界面缺氧微環(huán)境下早期胎盤血管形成的過程中CatS是否也有表達(dá)？已有的動物研究顯示出妊娠早期羊的胚胎或子宮內(nèi)膜中有組織蛋白酶家族中CTSB、CTSD、CTSH、CTSK、CTSL、CTSS/CatS、CTSZ和CST3的表達(dá)[14]。本研究中觀察到正常絨毛組織及胚胎停育絨毛組織中均有CatS表達(dá)。本實驗結(jié)果還顯示胚胎停育組絨毛組織中CatS的表達(dá)較正常早孕組明顯減低,提示在胚胎發(fā)育早期相對缺氧的環(huán)境中CatS的正常表達(dá)有利于胎盤血管的形成，而CatS表達(dá)降低，可能致胚胎血管形成不足，進(jìn)一步致其停止發(fā)育。這可能和VEGF的表達(dá)下降有關(guān)，因為有研究發(fā)現(xiàn)VEGF刺激缺氧的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)后，組織蛋白酶S表達(dá)增加[12]，這與基因表達(dá)分析所示一致，如內(nèi)皮細(xì)胞在缺氧、低PH值的條件下表達(dá)高水平的CatS轉(zhuǎn)錄物，而同一內(nèi)皮細(xì)胞在常氧、正常PH值條件下不存在此現(xiàn)象。這提示VEGF的低表達(dá)會導(dǎo)致組織蛋白酶S表達(dá)下降，影響新生血管基質(zhì)重塑，最終影響新生血管形成。

4、胚胎早期胎盤血管形成中HIF-1a 、VEGF及CatS之間的關(guān)系

早期胚胎發(fā)育及血管形成需要相對缺氧環(huán)境，其中關(guān)鍵的氧傳感途徑涉及缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1a，它的(高)正常表達(dá)可以促進(jìn)VEGF的表達(dá)及活性升高，從而促進(jìn)胚胎血管的形成。而且目前研究顯示在VEGF的刺激下，CatS在mRNA和蛋白水平上調(diào)、活性增加[13]，說明VEGF的表達(dá)和CatS表達(dá)呈正相關(guān)。本研究結(jié)果也顯示在正常絨毛組織和胚胎停育絨毛組織中CatS表達(dá)與VEGF表達(dá)高度相關(guān)。由此可以看出，在胚胎發(fā)育早期胎盤血管形成的過程中，在HIF-1a因子的誘導(dǎo)下血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生VEGF ，在VEGF的刺激下，血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生CatS，有利于血管外基質(zhì)的重塑，在血管內(nèi)皮細(xì)胞形成和細(xì)胞外基質(zhì)的重塑下使胎盤新生血管形成。同時本實驗結(jié)果顯示胚胎停育組HIF-1a、VEGF及CatS的表達(dá)均較正常早孕組明顯減低，其三者之間呈正相關(guān)，提示三者的低表達(dá)導(dǎo)致早期胚胎胎盤血管生成受阻。提示在胚胎發(fā)育早期相對缺氧的環(huán)境中，HIF-1a、VEGF及CatS的正常表達(dá)在胚胎血管形成中可能起著至關(guān)重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)在胚胎早期絨毛組織發(fā)育過程中HIF-1a、VEGF及CatS均有表達(dá)；且三者之間有高度相關(guān)性；在胚胎停育絨毛組織中HIF-1a、VEGF及CatS表達(dá)水平明顯降低，提示了三者可能參與了胚胎停育發(fā)生過程，為胚胎停育發(fā)病機制研究提供了新思路。