呂 珽，陳虹吟，湯 承,2，岳 華,2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041； 2.動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

哺乳動(dòng)物正呼腸孤病毒(mammalian orthoreovirus，MRV)屬于呼腸病毒科(Reoviridae)棘突呼腸病毒亞科(Spinareovirinae)正呼腸孤病毒屬(Orthoreovirus)，是一種雙鏈RNA病毒，其宿主譜極為廣泛，可感染豬、牛、綿羊、貓、犬、猴、狒狒、水貂、小鼠與蝙蝠以及人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物，呼吸道和腸道是病毒的主要感染部位[1]。MRV基因組大小約23 500 bp，分10個(gè)節(jié)段(L1～L3，M1～M3，S1～S4)。S1基因編碼σ1和σ1 s兩個(gè)蛋白，σ1為結(jié)構(gòu)蛋白，可決定MRV的血清型，與受體結(jié)合、組織嗜性以及血凝反應(yīng)密切相關(guān)[2-3]。根據(jù)中和試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果，MRV可分為4種血清型，其代表株分別為L(zhǎng)ang-T1L(MRV-1)、Jones-T2 J(MRV-2)、Dearing-T3D (MRV-3)與Ndelle-T4 N (MRV-4)。由于不同血清型的MRV在S1基因編碼的σ1蛋白中包含特定的氨基酸插入和缺失，導(dǎo)致不同血清型的MRV S1序列相似性較低，因此也可采用S1基因序列的進(jìn)化分析進(jìn)行基因分型，其結(jié)果與中和試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)分型結(jié)果是一致的[4-7]。

迄今為止，MRV-2已在人、蝙蝠、田鼠、獅子、白尾鹿、豬等多種宿主上發(fā)現(xiàn)并分離，具有廣泛的地域分布，包括中國(guó)、意大利、斯洛文尼亞等國(guó)家[8-12]。MRV-2與多種人類疾病相關(guān)，包括呼吸道感染、腦炎和腹瀉[13-14]。2003年，SARS疫情期間，在北京某醫(yī)院4例SARS患者的鼻咽拭子中也檢測(cè)到MRV-2陽(yáng)性，這些毒株可能起源于國(guó)內(nèi)的蝙蝠，并可引起獼猴和豚鼠嚴(yán)重呼吸道疾病[10-11,15-16]。最近，本實(shí)驗(yàn)室在腹瀉仔豬中分離到MRV-2，分離毒株能引起仔豬嚴(yán)重腹瀉[17]。綜上表明，MRV-2毒株可能對(duì)人和動(dòng)物有較強(qiáng)的致病性，其對(duì)公共衛(wèi)生的危害值得關(guān)注。

目前，已經(jīng)有很多牛源MRV病毒株分離的報(bào)道，分離毒株均為1型[18-21]。但是還未見(jiàn)MRV-2在牛上的分離報(bào)道。牦牛是青藏高原農(nóng)牧民不可或缺的生產(chǎn)生活資料，由于MRV在牛上的感染普遍，但對(duì)牛的危害尚不清楚，因此需要進(jìn)一步研究。本研究旨在是調(diào)查MRV在川西北牦牛上的感染情況，并對(duì)病毒進(jìn)行分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本與細(xì)胞系

72份牦牛犢牛腹瀉樣本于2018年6—8月采自川西北15個(gè)牧場(chǎng)(若爾蓋縣35份、紅原縣34份、阿壩縣13份)；15份血清樣本為2018年6月采自若爾蓋縣(7份)和紅原縣(8份)的腹瀉牦牛。所有樣本于-80 ℃保存?zhèn)溆?。用于分離病毒的Vero細(xì)胞系由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 核酸提取

300 μL處理好的樣本按照Trizol試劑說(shuō)明書(shū)提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，于-20 ℃保存。

1.3 樣本MRV RT-PCR檢測(cè)

采用文獻(xiàn)[22]報(bào)道的檢測(cè)MRV核酸的RT-PCR方法對(duì)提取的核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，靶基因?yàn)長(zhǎng)1，引物序列：5′-TTCACTCAGGCATTATCCGA-3′(上游引物)；5′-TCCGCTTCTGACTCCTGA-3′(下游引物)，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 陽(yáng)性樣本血清型鑒定

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的RT-PCR方法對(duì)MRV核酸陽(yáng)性樣本進(jìn)行血清型鑒定：5′-GGTCAAGGATTGGAAAAGACGG-3′(上游引物)，5′-CGAACTTACCAGATGCGAGGA-3′(下游引物)目的片段為601 bp。陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.5 病毒的分離純化和TCID50測(cè)定

將處理好的陽(yáng)性糞便樣本接種到Vero細(xì)胞上，按照本實(shí)驗(yàn)室報(bào)道的方法[17]進(jìn)行病毒的分離純化和TCID50測(cè)定。

1.6 病毒鑒定

1.6.1 分離株的RT-PCR鑒定 純化后的病毒液按照“1.3”的方法進(jìn)行核酸提取，按照“1.4”和“1.5”的方法進(jìn)行檢測(cè)，將PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì)。

1.6.2 病毒分離株電鏡觀察 收集病毒感染的細(xì)胞，1 500 r·min-1離心10 min，棄上清液，加入0.5%戊二醛固定，4 ℃靜置10 min，12 000 r·min-1離心13 min，棄上清，加入3%戊二醛固定液，送至成都里來(lái)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行透射電子顯微鏡觀察。

1.7 MRV2分離株基因組的擴(kuò)增

設(shè)計(jì)29對(duì)引物(表1)，對(duì)分離株基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化后交由生工生物工程有限公司測(cè)序。用DNAStar 7.0分析序列，ORF Finder工具預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框。

表1 擴(kuò)增MRV2基因組的引物信息

(轉(zhuǎn)下頁(yè) Carried forward)

1.8 序列比對(duì)和進(jìn)化分析

利用DNAStar 7.0軟件拼接序列并分析同源性。使用MEGA7.0對(duì)S1進(jìn)行多序列比對(duì)，并選取GenBank中登錄的MRV-1、MRV-2、MRV-3代表毒株的S1完整序列，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值為1 000。

2 結(jié) 果

2.1 牦牛樣本中MRV的檢測(cè)

72份牦牛腹瀉糞便樣本檢測(cè)出MRV陽(yáng)性樣本15份，陽(yáng)性率為20.83%；15份血清樣本檢出6份陽(yáng)性，檢出率為40%。6份血清陽(yáng)性樣本對(duì)應(yīng)的腹瀉糞便樣本中MRV均為陽(yáng)性。

2.2 臨床樣本中MRV血清型鑒定

采用本實(shí)驗(yàn)室特異性檢測(cè)MRV-2的RT-PCR方法，從15份MRV核酸陽(yáng)性樣本中擴(kuò)增出9個(gè)S1基因片段，來(lái)自6個(gè)牧場(chǎng)，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析，顯示為MRV-2的S1基因片段。6份陽(yáng)性血清核酸樣本中擴(kuò)增出的5個(gè)S1基因片段，來(lái)自3個(gè)牧場(chǎng)，測(cè)序結(jié)果也證實(shí)為MRV-2的S1基因片段。

本試驗(yàn)獲得的14條S1片段核苷酸長(zhǎng)度為601 bp(GenBank登錄號(hào)：MW149466-MW149479)，序列相似性為89.68%～100.00%，采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可見(jiàn)本試驗(yàn)獲得的14份的陽(yáng)性樣本S1片段核苷酸與MRV-2毒株聚為一支(圖1)，表明這14個(gè) 陽(yáng)性樣本為MRV-2。

2.3 病毒的分離和純化

陽(yáng)性樣本接毒24 h后出現(xiàn)細(xì)胞死亡，連續(xù)傳至第3代后，感染細(xì)胞于接毒12 h后出現(xiàn)穩(wěn)定病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變形、固縮、聚集、脫落。連續(xù)傳至第6代時(shí)，收獲病毒液進(jìn)行噬斑純化獲得1株純化毒株，命名為Yak/AB14/2018，病毒滴度為4×10-8.56TCID50·mL-1。

2.4 病毒分離株的鑒定

2.4.1 RT-PCR鑒定 采用“1.4”和“1.5”的方法檢測(cè)分離株，將PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析顯示為MRVL1基因和MRV-2S1基因的目的片段，證明分離獲得了牦牛源MRV-2病毒。

圖1 S1基因片段系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on S1 gene fragment

2.4.2 電鏡觀察 病毒培養(yǎng)物電鏡觀察可見(jiàn)病毒粒子在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈典型的晶格狀排列，該病毒無(wú)囊膜，直徑約70 nm，與正呼腸孤病毒科病毒的電鏡特征一致(圖2)。

圖2 透射電鏡觀察病毒粒子Fig.2 Particles observed by transmission electron microscope

2.5 MRV-2分離株基因組的擴(kuò)增和序列分析

使用29對(duì)引物分段擴(kuò)增獲得牦牛源MRV2分離株Yak/AB14/2018基因組，全長(zhǎng)23 587 bp，分為10個(gè)節(jié)段(L1～L3、M1～M3、S1～S4)(GenBank登錄號(hào)：MW652775-MW652783，MW149479)，所有病毒基因組中的片段均未檢測(cè)到重組事件。10個(gè)節(jié)段的長(zhǎng)度：L1 3 854 bp (1 267 aa)、L2 3 915 bp (1 289 aa)、L3 3902 bp (1 275 aa)、M1 2 304 bp (736 aa)、M2 2 206 bp (708 aa)、M3 2 241 bp (721 aa)、S1 1 434 bp(460 aa)、S2 1 331 bp(418 aa)、S3 1 198 bp (366 aa)、S4 1 196 bp (365 aa)；與4種血清型代表株的核苷酸相似度分別為88.1%～99.9%、74.6～99.6%、83.0%～100.0%、71.1%～99.9%、74.7%～100.0%、83.6～100.0%、38.2～98.8%、82.5～100.0%、84.9～100.0%、76.5%～99.2%；氨基酸相似度分別為96.7%～99.9%，90.6%～99.3%，97.5%～99.9%、79.2%～99.7%、93.9%～100.0%、94.9%～100.0%、16.8%～98.8%、97.1%～100.0%、96.4%～100.0%、96.4%～100.0%。每個(gè)基因節(jié)段與中國(guó)豬源毒株遺傳關(guān)系最近，證明本毒株與中國(guó)豬源毒株同源。

2.6 MRV-2分離株S1基因的分子特征

Yak/AB14/2018毒株的S1基因與MRV-2毒株的核苷酸相似性59.6%～98.8%，氨基酸相似性54.7%～98.8%，與國(guó)內(nèi)豬源MRV-2分離株(GenBanK登錄號(hào)：MN582426)的核苷酸和氨基酸相似性最高，而與其余國(guó)內(nèi)MRV-2毒株的核苷酸相似性為62.2%～65.1%，氨基酸相似性為55.8%～62.0%。與MRV-1毒株的核苷酸相似性為53.5%～54.4%，氨基酸相似性為28.9%～30.7%；與MRV-3的核苷酸相似性為38.2%～39.8%，氨基酸相似性為16.8%～17.3%。

Yak/AB14/2018毒株的S1基因(MW149479)編碼的σ1蛋白和國(guó)內(nèi)豬源MRV-2(MN582426)相比有8個(gè)氨基酸突變(R5V、R104G、L142S、A143G、S144F、R217K、P312S、I417V)；這兩個(gè)毒株與共同聚為一大支的其余4株MRV-2毒株(AY862138、AY862137、JN799419、KU195673)相比有9個(gè)共同的氨基酸突變(N40D、D90 N、D106 N、S154E、K246R、G251R、V301M、D314 N、Q340R)；這一大支的6個(gè)毒株與其他MRV-2毒株相比，有43個(gè)共同的氨基酸突變。

3 討 論

由于L1在不同血清型的MRV之間最為保守，常用作MRV的分子檢測(cè)靶標(biāo)[23]，本研究采用靶向L1基因的PCR方法，對(duì)牦牛腹瀉糞便和血清樣本進(jìn)行MRV檢測(cè)，檢出率為20.83%和40.00%，為當(dāng)?shù)貭倥８篂a防控提供參考。同時(shí)采用靶向S1的RT-PCR方法對(duì)MRV陽(yáng)性核酸進(jìn)行血清型分型，但由于S1基因的變異較大，目前，還沒(méi)有通用的分型引物，所以采用文獻(xiàn)[21]報(bào)道的方法定型失敗，因此自行設(shè)計(jì)引物進(jìn)行定型。本試驗(yàn)從牦牛腹瀉糞便中MRV2的檢出率為12.5%，占MRV陽(yáng)性樣本的60%，其余陽(yáng)性樣本定型失敗可能是由于序列變異大，綜上表明，MRV2是當(dāng)?shù)仃笈RV的優(yōu)勢(shì)流行株，其生物學(xué)意義還需進(jìn)一步研究。這些牦牛源MRV-2毒株S1基因與國(guó)內(nèi)豬源MRV2毒株(MN582426)、荷蘭人源(AY862138、AY862137)、奧地利豬源(JN799419)、加拿大人源(KU195673)MRV2毒株毒株(圖1)有共同區(qū)別于其它MRV-2毒株的氨基酸突變，表明進(jìn)化樹(shù)上這一大支的MRV2毒株具有廣泛的地理分布，其流行和公共衛(wèi)生意義需要進(jìn)一步關(guān)注。

本試驗(yàn)從牦牛腹瀉糞便中成功分離到1株MRV-2毒株，這是首次分離到牦牛源MRV-2毒株，為進(jìn)一步研究其生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。并成功獲得牦牛源MRV-2毒株的完整基因組，且每個(gè)基因節(jié)段的序列相似度結(jié)果顯示該分離株與國(guó)內(nèi)豬源毒株同源?，F(xiàn)有的資料表明，MRV-2與人的呼吸道疾病、腦炎和腹瀉等有關(guān)[13-14]，國(guó)內(nèi)也報(bào)道了從兒童的腹瀉糞便樣本和重癥呼吸道病人口咽拭子中分離到MRV-2[9,11,13]，而與Yak/AB14/2018同源的豬源毒株是重配毒株，其L2、S1、S4 3個(gè)基因節(jié)段與人源毒株同源，所以Yak/AB14/2018是否可感染人進(jìn)一步研究。該豬源毒株的S3基因來(lái)自國(guó)內(nèi)蝙蝠源，這與已有的研究報(bào)道蝙蝠可作為移動(dòng)病毒庫(kù)參與MRV在不同物種間循環(huán)的推測(cè)相符[24]。本分離株在牦牛和豬之間循環(huán)時(shí)蝙蝠可能起到了一定作用，但其具體方式不清楚，需要在牦牛和豬密度較大的地方開(kāi)展更多監(jiān)測(cè)活動(dòng)。

MRVS1基因編碼的結(jié)構(gòu)蛋白σ1具有獨(dú)立的宿主細(xì)胞結(jié)合能力，σ1的結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)病毒與細(xì)胞表面受體的結(jié)合[25]。σ1蛋白尾部插入到病毒衣殼中，起到錨定作用，而頭部和中間部分主要在與受體結(jié)合、吸附過(guò)程中發(fā)揮作用[26,27]。不同血清型的σ1蛋白頭部、體部與頭部結(jié)合區(qū)域內(nèi)有42個(gè)保守氨基酸位點(diǎn)[28]。與其他MRV-2毒株相比，Yak/AB14/2018有4個(gè)獨(dú)特的氨基酸突變(G104R、S142L、F144S、S312P)，其中1個(gè)(S312P)位于σ1蛋白受體結(jié)合區(qū)域。這些獨(dú)特的氨基酸突變是否與牦牛宿主和青藏高原獨(dú)特自然地理環(huán)境有關(guān)還需要進(jìn)一步研究。和Yak/AB14/2018聚為同一進(jìn)化分支的5株毒株(圖1)均為病人和患病動(dòng)物中分離到，并且這5個(gè)毒株氨基酸序列與其他MRV-2毒株相比，在σ1可能的受體結(jié)合區(qū)域有12個(gè)等同的氨基酸突變，其對(duì)σ1蛋白功能的影響需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

首次從牦牛腹瀉糞便和腹瀉牦牛血清中檢測(cè)到MRV，其中MRV-2是優(yōu)勢(shì)毒株，證明MRV可感染牦牛。從腹瀉糞便中成功地分離到1株MRV-2毒株，并成功獲得該毒株完整基因組，其S1基因編碼的蛋白有獨(dú)特的氨基酸突變，為進(jìn)一步研究牛源MRV-2的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果為深入了解MRV-2的流行病學(xué)和遺傳進(jìn)化提供了參考。