張志恒，白 薈，申美倫，馬相影，李柔茜，金簫笛，高 利

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030)

嚙齒和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在發(fā)育期使用麻醉藥、鎮(zhèn)靜藥會(huì)引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞凋亡增多，導(dǎo)致神經(jīng)發(fā)生、突觸傳遞及脂質(zhì)代謝發(fā)生異常，這也可能與其晚年的認(rèn)知和行為異常有關(guān)[1]。在發(fā)育關(guān)鍵期對(duì)幼齡動(dòng)物進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間(大于6 h)單次麻醉或較短時(shí)間多次麻醉可能會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生影響[2]。氯胺酮是一種非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體拮抗劑，麻醉效果良好且起效快，對(duì)于急慢性疼痛的動(dòng)物均有效[3-5]。氯胺酮能夠引起未成熟或幼齡動(dòng)物神經(jīng)細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性[6]。單次或低劑量給予氯胺酮不會(huì)引起發(fā)育期大鼠神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能的改變，而高劑量重復(fù)注射或延長(zhǎng)暴露時(shí)間便會(huì)觀察到神經(jīng)細(xì)胞的退變[7]。Slikker等[8]將氯胺酮肌注到妊娠122 d、5日齡 及35日齡的恒河猴中，幼齡組均產(chǎn)生了神經(jīng)毒性。在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的這種暴露與腦部發(fā)育異常、認(rèn)知功能下降有關(guān)[9]。

尋求更安全有效的麻醉方式至關(guān)重要，如何降低氯胺酮對(duì)發(fā)育期動(dòng)物的毒性引起了廣泛關(guān)注。對(duì)于幼齡動(dòng)物而言，理想的麻醉藥應(yīng)具備以下特點(diǎn)：起效迅速、作用持續(xù)時(shí)間短、給藥途徑簡(jiǎn)單、副作用小及鎮(zhèn)痛效果良好[10]。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，在獸醫(yī)臨床實(shí)踐中具有良好的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮作用，且無呼吸抑制作用，但可引起副交感神經(jīng)興奮、心動(dòng)過緩和低血壓。右美托咪定和氯胺酮具有互補(bǔ)的藥理作用。右美托咪定可降低氯胺酮麻醉引起的心血管及精神方面的不良反應(yīng)[11]。氯胺酮和右美托咪定的組合可產(chǎn)生有效的鎮(zhèn)靜作用，使動(dòng)物的誘導(dǎo)麻醉更平穩(wěn)，并可有效降低圍手術(shù)期不良事件的發(fā)生率[12]。但其對(duì)發(fā)育期動(dòng)物的神經(jīng)毒性和安全性還需要進(jìn)行更深入的研究證實(shí)。因此，本研究通過構(gòu)建氯胺酮致發(fā)育期大鼠神經(jīng)毒性模型，使用右美托咪定進(jìn)行干預(yù),探究右美托咪定對(duì)氯胺酮致發(fā)育期大鼠氧化應(yīng)激及認(rèn)知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7日齡SD大鼠48只，來源為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑

氯胺酮由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院臨床外科教研室提供；右美托咪定購自碩騰公司； 氧化應(yīng)激試劑盒CAT、GSH購于南京建成生物工程研究所；MDA、GHS-Px和蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購于碧云天生物技術(shù)公司。ELISA試劑盒IL-1β和IL-18購于慧嘉生物科技有限公司。

1.3 動(dòng)物分組和藥物處理

根據(jù)先前報(bào)道的試驗(yàn)方案[13]建立持續(xù)暴露氯胺酮致幼鼠神經(jīng)毒性模型。7日齡SD大鼠腹腔注射20 mg·kg-1氯胺酮，每隔90 min 1次，共注射5次 (麻醉時(shí)間共7.5 h)。7日齡SD大鼠隨機(jī)分為Con組(對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水)、Ket組[氯胺酮組，腹腔注射20 mg·kg-1氯胺酮(每1.5 h注射1次，共5次)]、Dex組(腹腔注射15 μg·kg-1Dex)、Ket+Dex組(氯胺酮注射前30 min，腹腔注射15 μg·kg-1Dex)。每次給藥0.1 mL，氯胺酮和Dex均使用生理鹽水溶解，生理鹽水和Dex提前30 min 腹腔注射。

1.4 樣本采集及保存

動(dòng)物最后1次給藥1.5 h后，隨機(jī)分為兩部分：一部分動(dòng)物分離海馬和皮質(zhì)組織，-80 ℃保存，用于試劑盒指標(biāo)檢測(cè)；另一部分使用4%多聚甲醛進(jìn)行心灌流并固定保存，用于制作腦組織尼氏染色切片。

1.5 海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)觀察

通過尼氏染色法檢測(cè)右美托咪定對(duì)氯胺酮作用下海馬神經(jīng)元的影響。取4%多聚甲醛固定的腦組織樣本，修整固定后進(jìn)行如下操作：生理鹽水沖洗；不同濃度梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，修形，切片(厚度5 μm)及尼氏染色，并使用中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察染色后切片。

1.6 氧化應(yīng)激檢測(cè)

使用試劑盒檢測(cè)各組腦樣本中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、過氧化氫酶(CAT)的含量。評(píng)價(jià)Dex對(duì)氯胺酮致海馬組織損傷后氧化應(yīng)激水平的影響。所有操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 Dex對(duì)7日齡大鼠海馬及皮質(zhì)神經(jīng)元的影響

尼氏染色結(jié)果如圖1所示，與對(duì)照組相比，K組海馬CA1區(qū)和CA3區(qū)域神經(jīng)元密度明顯下降，數(shù)量減少；海馬和前額葉皮質(zhì)區(qū)域尼氏小體數(shù)目減少，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，Ket組CA1區(qū)神經(jīng)元軸突排列混亂；DG區(qū)域變化不明顯。以上結(jié)果提示,7日齡SD大鼠連續(xù)給予氯胺酮麻醉后腦區(qū)出現(xiàn)細(xì)胞損傷。而Ket+Dex組與Ket組相比，氯胺酮造成的神經(jīng)元損傷被美托咪定預(yù)先用藥所緩解。

圖1 大腦皮質(zhì)及海馬尼氏染色(400×)Fig.1 Nissl staining in the cerebrum and the hippocampus (400×)

2.2 Dex對(duì)7日齡大鼠海馬及皮質(zhì)氧化應(yīng)激水平的影響

如圖2、3所示，Ket組大鼠皮質(zhì)和海馬中GSH含量與Con組相比顯著降低(P<0.05)，MDA含量均顯著升高(P<0.05)，CAT含量顯著下降(P<0.05)；Ket+Dex組海馬和皮質(zhì)組織GSH和CAT的含量與Ket組相比均顯著升高，而MDA含量顯著降低(P<0.05)；此外，Dex組海馬和皮質(zhì)組織GSH、CAT和MDA含量與Con組相比無明顯差異(P>0.05)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Dex對(duì)7日齡大鼠海馬及皮質(zhì)炎癥因子IL-1β和IL-18的影響

如圖4、5所示，Ket組大鼠皮質(zhì)和海馬中炎癥因子IL-1β和IL-18的濃度與Con組相比顯著升高(P<0.05)， Ket+Dex組海馬和皮質(zhì)組織中IL-1β和IL-18與Ket組相比均顯著降低(P<0.05)；此外，Dex組海馬和皮質(zhì)組織炎癥因子IL-1β和IL-18 含量與Con組無明顯差異(P>0.05)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Con.對(duì)照組；Dex.右美托咪定組；Ket.氯胺酮組; Ket+Dex.氯胺酮+右美托咪定組。與對(duì)照組比較，*.P<0.05；與氯胺酮組比較，#.P<0.05。下同Con.Control group; Dex.Dexmedetomidine group; Ket. Ketamine group; Ket+Dex. Ketamine+dexmedetomidine group. Compared with the control group, * .P<0.05.Compared with ketamine group, #. P<0.05.The same as below圖2 大鼠海馬中GSH、CAT和MDA的變化Fig.2 Changes of GSH, CAT and MDA in rat hippocampus

圖3 大鼠大腦皮質(zhì)GSH、CAT和MDA的變化Fig.3 Changes of GSH, CAT and MDA in cerebral cortex of rat

3 討 論

大量研究表明[9, 14-16]，大多數(shù)鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛藥物都會(huì)造成發(fā)育期哺乳動(dòng)物大腦神經(jīng)元凋亡或者產(chǎn)生退行性病變。并且長(zhǎng)期或多次暴露于麻醉時(shí)，這種變化表現(xiàn)得尤為顯著。麻醉藥物對(duì)于發(fā)育期動(dòng)物的大腦神經(jīng)毒性的產(chǎn)生機(jī)制及如何采取有效措施干預(yù)這一過程仍然是亟待解決的問題。右美托咪定是一種高選擇性α2受體激動(dòng)劑，可提供鎮(zhèn)痛和類似自然睡眠的鎮(zhèn)靜作用，常作為獸醫(yī)臨床診療中的鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛藥物。右美托咪定能夠通過減弱中樞或外周交感神經(jīng)末梢去甲腎上腺素的釋放發(fā)揮交感神經(jīng)阻滯作用[17-18]。右美托咪定可單獨(dú)或與咪達(dá)唑侖、氯胺酮、丙泊酚和氯丙嗪聯(lián)合用于動(dòng)物的鎮(zhèn)靜以及各種侵入性/非侵入性手術(shù)的麻醉[18]。右美托咪定作用的α2受體廣泛存在于肝、肺、腎和大腦等器官中。此外，有研究顯示，右美托咪定具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用，可降低大腦血流量減輕哺乳動(dòng)物和人的細(xì)胞凋亡、兒茶酚胺和谷氨酸釋放[20]，其作用機(jī)制可能與氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)有關(guān)[21-22]。因此，有必要進(jìn)行右美托咪定干預(yù)幼齡動(dòng)物早期麻醉藥物暴露導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的影響進(jìn)行進(jìn)一步研究?；诖耍驹囼?yàn)選取7日齡發(fā)育期大鼠作為研究模型，通過連續(xù)注射氯胺酮建立發(fā)育期大鼠神經(jīng)損傷模型，探究右美托咪定對(duì)氯胺酮麻醉致發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)元損傷、氧化應(yīng)激及炎癥因子釋放的影響及可能的機(jī)制。結(jié)果表明，氯胺酮麻醉會(huì)造成發(fā)育期大腦神經(jīng)元損失、氧化應(yīng)激及炎癥因子的釋放，而右美托咪定能夠有效減輕氯胺酮對(duì)發(fā)育期大腦的神經(jīng)毒性。

圖4 大鼠海馬中炎癥因子IL-1β和IL-18的變化Fig.4 Changes of IL-1β and IL-18 in rat hippocampus

圖5 大鼠大腦皮質(zhì)中炎癥因子IL-1β和IL-18的變化Fig.5 Changes of IL-1β and IL-18 in cerebral cortex of rat

哺乳動(dòng)物的大腦在發(fā)育期以不同形式的突觸構(gòu)建成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該階段的神經(jīng)元比較敏感，很容易受到外界刺激的影響[23]。在這一時(shí)期使用氯胺酮能夠改變神經(jīng)細(xì)胞生理平衡并對(duì)大腦正常發(fā)育產(chǎn)生不利影響。1999年，Ikonomidou等[15]關(guān)于全身麻醉藥物對(duì)于神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究顯示：在對(duì)出生后第0、3和7日齡的大鼠中應(yīng)用NMDA受體拮抗劑可導(dǎo)致大腦神經(jīng)細(xì)胞死亡，隨后的研究顯示，多次注射20 mg·kg-1氯胺酮會(huì)引起7日齡大鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡顯著增加，使NMDAR1亞基的蛋白和基因表達(dá)上調(diào)，而非麻醉劑量的氯胺酮?jiǎng)t不會(huì)造成這種損傷[24-25]。本研究結(jié)果顯示，連續(xù)氯胺酮給藥后7日齡大鼠大腦神經(jīng)元損傷，具體表現(xiàn)為海馬CA1及CA3區(qū)和皮質(zhì)的神經(jīng)元丟失增加、尼氏體數(shù)量減少、密度降低且排列混亂；右美托咪定提前30 min給藥能夠有效降低氯胺酮引起發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)元丟失。此外，單獨(dú)給予右美托咪定并沒有引起海馬和皮質(zhì)神經(jīng)元死亡，這與筆者的預(yù)期一致。

通常情況下，生物體內(nèi)的抗氧化與氧化系統(tǒng)保持著動(dòng)態(tài)平衡。細(xì)胞內(nèi)抗氧化與氧化系統(tǒng)之間的不平衡就會(huì)引起氧化應(yīng)激[26]。體內(nèi)還同時(shí)存在很多過氧化物和抗氧化物。如MDA、GSH和CAT等。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)后終產(chǎn)物，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，還會(huì)影響線粒體膜和細(xì)胞膜的破壞。CAT存在于各種細(xì)胞中，作為一種自由基清除劑，可以清除體內(nèi)過量的過氧化氫，以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。GSH能夠保護(hù)機(jī)體免受ROS損傷，維持機(jī)體的正?？寡趸δ躘27-28]。Li等[29]和潘寅兵等[30]研究發(fā)現(xiàn)，孕期大鼠應(yīng)用氯胺酮后其子代大鼠大腦ROS水平和過氧化物含量增加，最終引起氧化應(yīng)激，造成神經(jīng)損傷。在本研究中發(fā)現(xiàn)對(duì)發(fā)育期連續(xù)注射氯胺酮，其皮質(zhì)和海馬中抗氧化物質(zhì)GSH和CAT的含量顯著下降，而脂質(zhì)過氧化物MDA含量顯著升高，這些結(jié)果說明了氯胺酮造成了氧化應(yīng)激損傷。而使用右美托咪定預(yù)先給藥再注射氯胺酮后的發(fā)育期大鼠的抗氧化水平增加、脂質(zhì)過氧化水平降低：CAT和GSH顯著升高，MDA下降，這些結(jié)果進(jìn)一步表明，右美托咪定可以降低氯胺酮導(dǎo)致的氧化應(yīng)激水平增加。

IL-1β和IL-18是非常重要的促炎性細(xì)胞因子，具有自分泌、旁分泌和全身性功能[31]。炎性因子IL-1β和IL-18的濃度增加也在氯胺酮導(dǎo)致發(fā)育期大鼠大腦神經(jīng)損傷中發(fā)揮了重要作用。因此在本研究中也檢測(cè)了海馬和皮質(zhì)組織中IL-1β 和IL-18的含量。結(jié)果表明，氯胺酮顯著增加了大鼠皮質(zhì)和海馬中炎癥因子IL-1β和IL-18的水平，這可以從側(cè)面說明氯胺酮加重了發(fā)育期大鼠的炎癥反應(yīng)。而通過右美托咪定預(yù)先給藥改變了氯胺酮導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。

4 結(jié) 論

右美托咪定預(yù)處理能夠有效降低發(fā)育其大鼠海馬和皮質(zhì)MDA水平、增加CAT和GSH含量，并抑制炎癥因子IL-1β和IL-18的分泌，在氯胺酮致發(fā)育期大鼠神經(jīng)損傷時(shí)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。