嚴(yán)雅瑤，顧 敏,2,3 *，劉秀梵,2,3

(1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2. 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009； 3.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

2013年3月，一種源自禽類的新型H7N9亞型流感病毒在人群中暴發(fā)開來，迄今為止，已出現(xiàn)至少五波流行高峰。其中，2016—2017年的第五波疫情出現(xiàn)最早、報(bào)告的人感染病例數(shù)最多、區(qū)域分布也最廣，并且在此期間還分離到了對(duì)雞呈高致病性的H7N9禽流感病毒[1-3]。截至2021年7月7日，全球共報(bào)告1 568人感染H7N9病毒，死亡616例，患者數(shù)量超過了H5N1、H9N2等其他能夠感染人的禽流感病毒亞型的總和[4]。同時(shí)，H7N9病毒仍在不斷地變異，例如與家禽群體中的H9N2、H5N6亞型病毒進(jìn)一步發(fā)生基因重配而產(chǎn)生新型H7N2、H7N6病毒，對(duì)家禽養(yǎng)殖及公共衛(wèi)生安全構(gòu)成持續(xù)威脅[5-6]。自2017年下半年以來，伴隨著特異性禽流感疫苗的有效使用，H7N9亞型禽流感病毒的分離率急劇下降；相對(duì)應(yīng)地，大多通過活禽或活禽市場暴露而感染的人的散發(fā)病例也驟減[7-8]。然而，盡管當(dāng)前對(duì)家禽低致病性的H7N9病毒已基本分離不到，但高致病性H7N9禽流感病毒仍在我國部分地區(qū)存在，且部分毒株表現(xiàn)出明顯的抗原性變異，使防控工作面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)[9-10]。此外，雖然目前H7N9病毒尚不具備在人際間有效傳播的能力，但病毒有可能通過關(guān)鍵基因位點(diǎn)的突變或基因片段的重配進(jìn)而提高其在人類宿主中的適應(yīng)性，所以密切監(jiān)測(cè)與病毒生物學(xué)特性相關(guān)的氨基酸變異尤為重要。

1 H7N9亞型流感病毒概述

流感病毒屬于正黏病毒科，是具有囊膜、分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒，大小為80～120 nm，根據(jù)其核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)的抗原性不同，可分為A、B、C、D 4個(gè)型[11]。其中，威脅畜禽和人類健康最為嚴(yán)重的是A型流感病毒(influenza A virus, IAV)，其基因組包含8條獨(dú)立的基因片段，總長度約13 kb，可編碼多達(dá)17種蛋白，包括人們所熟知的10種核心蛋白(PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1、NS2)，還有近年來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的附屬蛋白(accessory proteins)，如：PB1-F2、PB1-N40、PA-X、M42、NS3、PA-N155和PA-N182[12]等。上述蛋白中，HA與NA是IAV囊膜表面最重要的兩種抗原性糖蛋白，在IAV的生命周期中發(fā)揮重要作用：HA主要介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合及包裝復(fù)制，NA主要負(fù)責(zé)切割受體結(jié)合、釋放病毒粒子，兩者維持著功能上的動(dòng)態(tài)平衡，同時(shí)HA和NA也是進(jìn)一步劃分H1～H18、N1～N11亞型的依據(jù)[13]。

在眾多IAV亞型中，H7N9因其同時(shí)對(duì)畜禽養(yǎng)殖與公眾健康造成了嚴(yán)重危害而備受關(guān)注。該始于2013年的新型H7N9病毒，推測(cè)其可能是H7、N9和H9N2亞型禽流感病毒的三源重配產(chǎn)物：H7和N9基因?yàn)闅W亞進(jìn)化譜系的野鳥來源，而內(nèi)部片段則完全由中國家禽中廣泛流行的H9N2提供，三者重組誕生了原始型H7N9，而后進(jìn)一步在家禽中暴發(fā)開來，并伴隨有人類感染病例的出現(xiàn)[14-15]。在地區(qū)分布上，H7N9病毒首次出現(xiàn)在長江三角洲及珠江三角洲等東南沿海地區(qū)，隨著病毒的傳播蔓延，近幾年西部內(nèi)陸及東北地區(qū)也陸續(xù)出現(xiàn)感染病例[10,16]。在時(shí)間上，H7N9病毒自出現(xiàn)以來，每年冬季至次年春季均會(huì)在人群中形成一次流行高峰，截至目前已引起至少五波流行，其中以第五波(2016—2017年)的感染人數(shù)最多、感染區(qū)域最廣。同時(shí)，第五波流行期間還出現(xiàn)了對(duì)家禽呈高致病性(highly pathogenic，HP)的H7N9病毒，其HA裂解位點(diǎn)處早期主要表現(xiàn)為 “KRTA”的特異性氨基酸插入，雖保留與此前低致病性(low pathogenicity，LP)H7N9病毒相類似的雙受體結(jié)合特性，但可能在哺乳動(dòng)物中表現(xiàn)出更強(qiáng)的致病性、傳播性以及更廣泛的組織嗜性[1,7]。并且，不斷有證據(jù)表明，HP H7N9仍在持續(xù)地演化與變異。例如，H7N9感染的禽類宿主范圍在不斷擴(kuò)大，除雞以外，鴨、鵪鶉體內(nèi)也分離到少量H7N9毒株[8,17-18]。HP H7N9病毒還可以與其他NA亞型的禽流感病毒發(fā)生基因重配而產(chǎn)生H7N2、H7N3、H7N6等新型重組H7Ny病毒[19]。另外，HA蛋白上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的變異及其導(dǎo)致的N-糖基化(N-linked glycosylation, NLG)狀態(tài)改變能夠通過對(duì)蛋白的空間構(gòu)象與生物活性的調(diào)節(jié)來影響H7N9病毒的生物學(xué)特性[20-21]。

2 HA蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

2.1 HA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

HA蛋白位于IAV囊膜表面，由3個(gè)HA1-HA2復(fù)合物單體結(jié)合而成同源三聚體。各亞型HA蛋白在結(jié)構(gòu)上大體相似，但一級(jí)結(jié)構(gòu)的片段長度略有不同。H7N9病毒的HA單體由561或565個(gè)氨基酸組成，從N端開始的18個(gè)疏水性氨基酸組成信號(hào)肽，緊接著321或325個(gè)氨基酸殘基組成HA1，隨后由222個(gè)氨基酸構(gòu)成HA2[22](圖1A)。對(duì)于HA2，其N端融合肽(fusion peptide, FP)區(qū)域?yàn)槭杷园被?，可與病毒囊膜的脂質(zhì)雙層緊密相連；緊接著仍由一系列疏水性氨基酸構(gòu)成跨膜區(qū)；而C末端的氨基酸多數(shù)為親水性，可透過脂質(zhì)雙分子層進(jìn)入病毒粒子內(nèi)部而構(gòu)成胞內(nèi)尾區(qū)。序列分析發(fā)現(xiàn)，LP和HP H7N9病毒HA基因長度的差異由裂解位點(diǎn)處(cleavage site，CS)氨基酸基序的差異所導(dǎo)致，前者為PKG----R↓G，而后者至少存在7種模式：PKRKRTAR↓G、PKGKRTKR↓G、PKGKRTAR↓G、PKGKRIAR↓G、PKRRRTAR↓G、PKRKRAAR↓G、PKRKRIAR↓G，其中占比較高的為PKG/RKRTAR↓G[2, 23-24]。此外，相較于LP H7N9，HP H7N9病毒的HA上還有諸如HA1中L235Q(H3編號(hào)為L226Q)、G338R等明顯氨基酸替換[25]。其中，235位是重要的抗原表位并能夠影響LP與HP H7N9病毒的交叉反應(yīng)性，且在其他多個(gè)HA亞型中均被證實(shí)與流感病毒的跨種傳播能力密切相關(guān)[21,26-27]。而G338R突變?cè)黾恿肆呀馕稽c(diǎn)處連續(xù)堿性氨基酸的數(shù)目，可以潛在地提高弗林蛋白酶的切割效率，從而對(duì)病毒的感染性及致病力造成影響[23,28]。

A. H7N9病毒HA蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)：圖中氨基酸計(jì)數(shù)使用H7編號(hào)(包含信號(hào)肽)，裂解位點(diǎn)處HP H7N9相較于LP H7N9存在“KRTA”的4個(gè)氨基酸插入；B. H7N9病毒HA蛋白的三維結(jié)構(gòu)：圖中僅顯示HA單體結(jié)構(gòu)，并標(biāo)記出影響病毒生物學(xué)特性的部分關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)；該結(jié)構(gòu)以A/Shanghai/02/2013(H7N9) 病毒的HA蛋白結(jié)構(gòu)(PDB ID: 6IDD)為模板進(jìn)行同源建模，使用PyMOL軟件進(jìn)行展示A. The primary structure of HA protein of H7N9 virus. The amino acid sites were according to H7 numbering, including the signal peptide. As compared with LP H7N9, HP H7N9 possessed the 4-amino-acid insertion of KRTA at the cleavage site; B. The three-dimensional structure of HA protein of H7N9 virus. The structure of HA monomer was shown, and some key amino acid sites affecting the viral biological properties were labelled. The structure was homology modelled with the HA protein template of A/Shanghai/02/2013(H7N9) virus (PDB ID: 6IDD), and presented with the software of PyMOL圖1 H7N9亞型流感病毒HA蛋白的結(jié)構(gòu)Fig.1 HA protein structure of H7N9 subtype influenza virus

2.2 HA的空間結(jié)構(gòu)

HA是一種典型的I型蛋白，其三聚體組裝成一個(gè)中心螺旋線圈，形成桿狀莖部以及含有唾液酸(sialic acid, SA)結(jié)合位點(diǎn)的球狀頭部，三聚體高約135 ?，直徑35～70 ?[29]。頭部由HA1的大部分組成，變異率較高，包含受體結(jié)合區(qū)(receptor binding domain, RBD)、痕酯酶區(qū)(vestigial esterase domain, VE)。莖部較為保守，由HA1的N端、C端部分和HA2的整體共同組成，且一直延伸至膜內(nèi)(圖1B)。

2.2.1 頭部(head) HA蛋白的頭部是由HA1第53—275位氨基酸(H3編號(hào))折疊成8條反平行鏈而組成的空間構(gòu)象，其遠(yuǎn)端是RBD區(qū)，130-loop(135～138)、190-helix(190～198)和220-loop(221～228) 這3個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)元件構(gòu)成口袋邊緣；保守性的氨基酸殘基Y98、W153、H183和Y195組成了基底部；鄰近的150-loop作為RBD結(jié)構(gòu)的一部分，有助于保持結(jié)構(gòu)完整性及與SA形成相互作用[30-31]。各HA亞型的RBD構(gòu)象較為相似，但也存在一定差異，比如H7亞型的RBD相較于H1、H3、H5等亞型，在150-loop中存在兩個(gè)連續(xù)氨基酸(Asn、Thr)的插入，使150-loop突出到結(jié)合位點(diǎn)的一側(cè)，而這種構(gòu)象有可能影響病毒受體結(jié)合特異性[22,32]。此外，一些H7亞型病毒(如H7N1)在150-loop的第158位新增一個(gè)NLG修飾，形成空間干擾從而阻礙受體的結(jié)合，最終降低病毒對(duì)受體的親和力[33]。而其他亞型(如H5N6)HA第158 位出現(xiàn)NLG缺失后，卻能夠獲得結(jié)合人源受體的能力，并且增加對(duì)小鼠的致病性[34]。因此，RBD的氨基酸差異及NLG修飾對(duì)流感病毒受體結(jié)合特性具有較大影響。

位于HA1的RBD和HA2的膜近端莖部之間的則是VE區(qū)，因其與C型流感病毒脂酶融合蛋白上的9-O-乙酰脂酶同源性較高而得名[35]，具體定位于第53—115及265—275位氨基酸(H3編號(hào))(圖1B)。盡管有關(guān)VE區(qū)的功能研究尚較少，但其高度保守的特性可作為除HA頭部、莖部之外的第3個(gè)用于治療性單抗結(jié)合的靶點(diǎn)區(qū)域，目前已在H5N1病毒的相關(guān)研究中取得一定成效[36]。

同時(shí)，HA頭部具有較多抗原表位(antigenic sites， ASs)。通常所述的5大抗原區(qū)(H3編號(hào))主要包括：位于膜遠(yuǎn)端的A區(qū)(133—137，140—146)和B區(qū)(156—160，187—198)，位于膜近端的C區(qū)(53、54、275、278)，位于HA三聚體交界處的D區(qū)(174、207)及位于VE結(jié)構(gòu)域的E區(qū)(63、78、81、83)；其中A、B抗原區(qū)因與RBD的部分區(qū)域(A區(qū)與130-loop、B區(qū)與190-helix)存在重疊而導(dǎo)致其抗原性相對(duì)于C、D、E區(qū)有所增強(qiáng)，此外，A、B、E區(qū)的抗原位點(diǎn)多為線性表位，而C、D區(qū)的抗原位點(diǎn)多呈構(gòu)象表位[37]。但HA抗原位點(diǎn)處氨基酸的組成及數(shù)量并非一成不變，處于上述5個(gè)抗原區(qū)之外的氨基酸變異，比如G132R、G137E(H3編號(hào)分別為G124R、G129E)，同樣可能引起抗原性的改變而使其成為新的潛在抗原位點(diǎn)[38]。

2.2.2 莖部(stem) HA莖部由部分HA1和全部HA2組成，其膜外螺旋樣結(jié)構(gòu)支撐膜遠(yuǎn)端的HA頭部，并延伸至膜內(nèi)從而將HA蛋白錨定于病毒囊膜表面。膜外的HA莖部也包含較多抗原位點(diǎn)且在各HA亞型中高度保守，因此可作為中和抗體結(jié)合的靶點(diǎn)，但各亞型莖部之間也具有一定相似性，如group 1的H5、H9，group 2的H3、H7，故部分抗體(如CR6216)可以中和group 1中的某些病毒、部分抗體(如CR8020)可以中和group 2中的某些病毒或?qū)roup 1和group 2病毒的攻擊均具有保護(hù)作用(如C05)[39-41]。這些靶向HA莖部的抗體通過抑制病毒囊膜與細(xì)胞膜的融合來阻斷病毒遺傳物質(zhì)進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，從而抑制病毒的復(fù)制。此外，位于膜近端長螺旋上的D112G(HA2編號(hào))會(huì)降低HA蛋白的穩(wěn)定性，而位于膜遠(yuǎn)端短螺旋上的K58I(HA2編號(hào))則會(huì)增加HA蛋白的穩(wěn)定性，這些突變可為開發(fā)穩(wěn)定性更好的疫苗提供理論參考[42]。HA莖部的跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)更為保守，其中的半胱氨酸可作為重要的?；稽c(diǎn)與棕櫚酸結(jié)合，而經(jīng)修飾后的棕櫚酰化HA蛋白對(duì)于膜融合及病毒出芽均至關(guān)重要[43-44]。同時(shí)，莖部還存在NLG位點(diǎn)，具有高度保守性及一定的亞型特異性；它們對(duì)于HA蛋白的折疊和構(gòu)象至關(guān)重要，當(dāng)去除莖部關(guān)鍵的NLG位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致HA蛋白的三聚化、折疊及轉(zhuǎn)運(yùn)受損，同時(shí)還會(huì)改變HA對(duì)pH變化的敏感性[45-47]。

3 HA蛋白的主要功能

3.1 HA蛋白R(shí)BD介導(dǎo)的受體結(jié)合特性

HA蛋白的受體結(jié)合特性是影響流感病毒組織嗜性及宿主范圍的主要因素，而SA是存在于宿主細(xì)胞表面與病毒感染相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)。SA作為一類9-碳單糖神經(jīng)氨酸衍生物，常存在于N-聚糖、寡聚糖和神經(jīng)節(jié)苷脂的末端。在自然界中，SA通常通過其C5位的氨基與乙酰基或羥乙?；孽；磻?yīng)來穩(wěn)定其修飾，從而分為N-乙酰神經(jīng)氨酸 (N-acetylneuraminic acid, Neu5Ac)與N-羥乙酰神經(jīng)氨酸 (N-glycolylneuraminic acid, Neu5Gc)[48]。此外，末端SA(SA-1)的C2與其鄰近的倒數(shù)第二個(gè)半乳糖(Gal-2)的C3或C6連接，分別生成SA-α2, 3-Gal和SA-α2, 6-Gal 兩種SA受體，這種SA空間構(gòu)象的差異直接影響到流感病毒受體結(jié)合的偏嗜性[49]。

不同流感病毒對(duì)特異性SA受體的偏嗜性明顯不同，人流感病毒更偏向于識(shí)別SA-α2, 6-Gal，禽流感病毒和馬流感病毒親嗜SA-α2, 3-Gal，而豬流感病毒對(duì)α2, 3和α2, 6兩種SA受體親和力均較高[50]。同時(shí)，不同種屬動(dòng)物受體的結(jié)合構(gòu)象也有所差異，禽類受體的結(jié)合在SA-1和Gal-2之間呈現(xiàn)反式構(gòu)象，而人源受體的結(jié)合均采用順式構(gòu)象；這種受體結(jié)合的特異性，部分由HA蛋白受體結(jié)合口袋的結(jié)構(gòu)特征決定，是影響宿主嗜性的重要影響因素，包括種間適應(yīng)及傳播[51]。研究指出，HA蛋白受體結(jié)合口袋結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化即可導(dǎo)致受體結(jié)合偏好性的改變，比如，H7N9亞型HA蛋白上186、193、226、228位(H3編號(hào))是病毒獲得結(jié)合SA-α2, 6-Gal的關(guān)鍵[52-54]。而其他亞型HA上的81、98、145、190、193、222、224、225、226、228和238位(H3編號(hào))氨基酸也被報(bào)道可能通過影響RBD口袋區(qū)域的結(jié)構(gòu)而影響其與SA受體的結(jié)合力及偏嗜性[53,55-63]。

3.2 HA蛋白莖部介導(dǎo)的雙膜融合

HA蛋白的另一重要功能是在低pH環(huán)境下誘導(dǎo)流感病毒囊膜與宿主細(xì)胞膜的融合，這也是病毒感染細(xì)胞過程中進(jìn)行脫殼所必須的。首先，HA蛋白以未經(jīng)修飾的HA0(HA前體蛋白)形式存在，雖能識(shí)別宿主細(xì)胞表面的受體，但不能與宿主細(xì)胞膜發(fā)生融合，導(dǎo)致病毒也不具備感染性[64-65]。而IAV發(fā)生感染的先決條件則是HA的可裂解特性，即HA0裂解為HA1和HA2，因此HA CS處的氨基酸組成和宿主體內(nèi)的蛋白酶分布將對(duì)病毒的致病性和組織嗜性產(chǎn)生重要影響[65]。HP病毒在HA CS處具有連續(xù)的多堿性氨基酸，該序列特征在高爾基體反面網(wǎng)絡(luò)(trans-Golgi network，TGN)上被宿主體內(nèi)泛嗜性的蛋白酶(如弗林蛋白酶、PC6)所識(shí)別并發(fā)生裂解[66-67]。相比之下，LP病毒在HA CS處通常僅含單個(gè)堿性氨基酸，主要由局限于機(jī)體特定部位(如呼吸道和胃腸道的黏膜表面)的胰蛋白酶樣蛋白酶所切割[67-69]。當(dāng)HA RBD與SA受體結(jié)合后，經(jīng)切割產(chǎn)生的具有膜融合能力的HA1-HA2復(fù)合物便通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。在內(nèi)小體低pH環(huán)境下，HA蛋白經(jīng)歷一系列構(gòu)象變化，具體包括HA1-HA2構(gòu)象改變、融合肽的暴露、莖部螺旋的重塑；其中，融合肽暴露后與跨膜區(qū)形成鉤狀結(jié)構(gòu)插入宿主細(xì)胞膜中，拉近其與病毒囊膜的距離，從而介導(dǎo)雙膜融合和融合孔的形成，最終病毒的遺傳物質(zhì)得以釋放到宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[70-72]。由于誘導(dǎo)雙膜融合主要由HA莖部介導(dǎo)，其高度保守的氨基酸序列維持著HA蛋白的穩(wěn)定性及病毒的包裝復(fù)制。有研究表明，H3N2亞型F63P及F70P雙突變(HA2 編號(hào))可通過影響HA莖部構(gòu)象進(jìn)而抑制雙膜融合[73]。此外，H7N1亞型12 N、28 N(H7編號(hào)，去信號(hào)肽)被證明是HA蛋白融合活性的關(guān)鍵位點(diǎn)，其變異會(huì)影響HA蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)乃至病毒的感染特性[47,73-74]。

3.3 HA蛋白的酸、熱穩(wěn)定性

HA蛋白的酸、熱穩(wěn)定性具體表現(xiàn)為病毒在不同pH、溫度等環(huán)境下抵抗失活的能力，是影響IAV宿主范圍、傳播性及致病潛力的重要因素[75]。其中，溫度作為一種非生理性誘發(fā)因素可允許HA蛋白在中性環(huán)境下發(fā)生雙膜融合；而一定pH閾值所觸發(fā)的HA構(gòu)象改變(HA的活化)則通常定義為HA的酸穩(wěn)定性，且有研究表明HA蛋白酸穩(wěn)定性具有一定的宿主差異性及亞型特異性[76]。例如，人的H1N1、H2N2、H3N2大流感病毒pH閾值(5.1～5.5)普遍低于野鳥源IAV(5.5～6.1)，而致人感染的禽流感病毒(如H5N1、H5N6、H7N9)pH閾值則普遍較高(5.6～5.8)，提示較高的HA活化pH閾值(即HA低穩(wěn)定性)有利于病毒在鳥類宿主中有效復(fù)制及傳播，而HA穩(wěn)定性較高的IAV則更加適應(yīng)于哺乳動(dòng)物體內(nèi)[77-80]。值得注意的是，HA蛋白的某些氨基酸突變可通過改變HA蛋白活化的pH閾值來影響病毒的穩(wěn)定性，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制及致病力。例如，有研究發(fā)現(xiàn)，H7亞型HA2中E64K突變可通過提高HA活化的pH閾值來降低病毒的穩(wěn)定性及其在小鼠體內(nèi)的復(fù)制性能[25]。另外，H5亞型HA蛋白上的K387I突變(H3編號(hào))，在降低pH閾值的同時(shí)也增加了病毒在小鼠中的復(fù)制能力及毒力[81]。

3.4 HA蛋白的抗原性變異

HA蛋白是IAV引起中和抗體反應(yīng)的主要抗原，由于病毒RNA聚合酶缺乏校對(duì)功能，在選擇壓力的作用下，極可能出現(xiàn)基因重組及突變，從而重配出新型病毒(如H7N9、H7N2)或已有病毒的不同致病型(如LP H7N9、HP H7N9)，并可能造成持續(xù)性的流感疫情[2,5,14]。而歷史上引起大流行的流感病毒(如1918年的H1N1、1957年的H2N2)，它們?cè)趯?shí)現(xiàn)人與人之間有效傳播的同時(shí)，還能通過更新其抗原性來不斷適應(yīng)人群，給人類健康造成了極大威脅。

H7N9病毒在從LP到HP的演變過程中其抗原性呈現(xiàn)明顯變異，但關(guān)鍵位點(diǎn)尚未明確，故Chang等[20-21]基于1株早期LP病毒A/Anhui/1/2013(H7N9)，通過在含有對(duì)應(yīng)抗血清的雞胚中進(jìn)行連續(xù)傳代的方式來模擬病毒在自然界中抗體壓力下的抗原演變，最終鑒定出HA蛋白上A143T、A169T和L235Q 這3個(gè)決定性的氨基酸突變，并被證實(shí)除了可以改變抗原性也對(duì)病毒穩(wěn)定性和受體結(jié)合特性產(chǎn)生了一定影響。值得注意的是，A143T和A169T的突變還同時(shí)導(dǎo)致141與167 位分別增加為NLG位點(diǎn)，且該變異均以較高比例出現(xiàn)于近兩年來的HP H7N9自然分離株中[82]。

另外，不同時(shí)期的H7N9病毒間也存在抗原性差異。自2013年出現(xiàn)以來，H7N9病毒相繼經(jīng)歷了從LP→LP與HP共存→HP的演變過程，盡管伴隨著H7-Re1、H7-Re2等禽流感疫苗的有效使用以及相關(guān)干預(yù)措施的有效執(zhí)行，禽群和人群中H7N9的分離率均急劇下降，但HP H7N9病毒仍能在部分地區(qū)被檢測(cè)到。中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)的相關(guān)調(diào)查分析均指出，禽群中2019年HP H7N9病毒的HA基因與早期HP分離株不僅在遺傳進(jìn)化上有明顯分歧，疫苗免疫保護(hù)效力試驗(yàn)也表明H7-Re2、rGD76等疫苗株已不能對(duì)流行株提供完全保護(hù)[9,16]。甘肅疾控中心還發(fā)現(xiàn)，2019年，人源HP H7N9病毒與疫苗株SF003相比，其HA1結(jié)構(gòu)域上具有多達(dá)15個(gè)位點(diǎn)的氨基酸突變，其中，R65K、G132R、V143T、S152P等多個(gè)潛在抗原位點(diǎn)已出現(xiàn)明顯變異[10,38]。因此，持續(xù)關(guān)注HA的抗原性變異是評(píng)估疫苗有效性的重要前提。目前，中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部官方公布的H7N9疫苗株已更新為H7-Re3、rLN79。此外，由于HA蛋白抗原區(qū)和受體結(jié)合區(qū)在空間結(jié)構(gòu)上存在部分重疊，基于血凝抑制(hemagglutinin inhibition, HI)試驗(yàn)進(jìn)行的抗原差異性評(píng)估也可能會(huì)受到受體親和力的干擾。分別有研究指出，H7N9病毒HA的L235Q突變、H1N1病毒HA的E158K突變、H3N2病毒的N145K突變均是因其結(jié)合受體的能力發(fā)生改變而間接影響了與抗血清的HI滴度，但卻均曾被誤認(rèn)為是位點(diǎn)突變直接導(dǎo)致了病毒的抗原性變異[62,83-84]。因此，在進(jìn)行病毒抗原性分析時(shí)，也應(yīng)同時(shí)考慮對(duì)受體親和力的影響。

鑒于HA蛋白的上述重要功能，眾多學(xué)者對(duì)其開展了相關(guān)研究并鑒定出了一系列關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)，被證明不僅會(huì)影響HA蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而也會(huì)改變病毒的部分生物學(xué)特性。基于此，本文在重點(diǎn)關(guān)注H7N9亞型的同時(shí)也兼顧其他部分亞型，總結(jié)了近年來HA蛋白上涉及IAV穩(wěn)定性、抗原性、復(fù)制性能、受體結(jié)合特性、傳播性、致病性等關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)(表1)，以期為更深入地解析HA基因變異所導(dǎo)致IAV特性改變的相關(guān)機(jī)制提供參考和借鑒。

4 展 望

目前，國內(nèi)LP H7N9流感病毒已基本消失，但HP H7N9病毒仍在國內(nèi)部分地區(qū)持續(xù)存在，并且有研究表明HP H7N9毒株在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)感染過程中出現(xiàn)毒力和傳播能力增強(qiáng)的現(xiàn)象，對(duì)家禽及人類健康的威脅依然嚴(yán)峻[1-2,8,18]。HA蛋白是H7N9流感病毒表面最主要的糖蛋白和抗原組分，其基因變異所致蛋白結(jié)構(gòu)、功能的變化可能會(huì)進(jìn)而對(duì)病毒特性產(chǎn)生重要影響，包括可能產(chǎn)生具有抗原逃逸的變異型子代病毒以維持其在自然界的感染與擴(kuò)散，或可能獲得更強(qiáng)的結(jié)合人源受體的能力以促進(jìn)其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的適應(yīng)與傳播等。迄今為止，H7N9病毒的持續(xù)變異已使疫苗歷經(jīng)H7-Re1→H7-Re2→H7-Re3、rGD76→rLN79的不斷更新，而疫苗研發(fā)相對(duì)滯后于病毒變異的現(xiàn)狀迫切要求進(jìn)一步開發(fā)成熟的通用型疫苗。其中， HA莖部由于其結(jié)構(gòu)的相對(duì)保守性以及具有激發(fā)廣泛保護(hù)性免疫的潛能，成為了通用疫苗設(shè)計(jì)的理想靶標(biāo)之一。因此，持續(xù)監(jiān)測(cè)HA基因的變異、深入解析HA蛋白的功能，必將為進(jìn)一步揭示H7N9病毒的遺傳演化規(guī)律、探究其感染與致病的相關(guān)分子機(jī)制及疫情的防控奠定重要基礎(chǔ)。