聞雙全，陳 潔，王 莉，鄒 輝，顧建紅，劉學(xué)忠，卞建春，劉宗平，袁 燕*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州 225009； 2.江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心， 揚(yáng)州 225009； 3.江蘇省南通市動物疫病預(yù)防控制中心，南通 226011)

鎘是環(huán)境中常見的重金屬污染物，可經(jīng)皮膚、消化道和呼吸道進(jìn)入人、畜體內(nèi)。進(jìn)入機(jī)體內(nèi)的鎘排泄率極低，其生物半衰期長達(dá)10～30年。腦是鎘毒性作用的重要靶器官之一，鎘可增加血腦屏障通透性并進(jìn)入大腦[1]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，鎘可在大鼠大腦皮質(zhì)內(nèi)蓄積[2]。大量研究表明，鎘可造成人和動物神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙[3-5]。鎘致神經(jīng)系統(tǒng)毒性機(jī)制主要包括誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、凋亡和自噬[6-7]。其中，細(xì)胞凋亡是鎘致神經(jīng)毒性的重要機(jī)制之一。

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的一種細(xì)胞程序性死亡，在調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和多細(xì)胞生物發(fā)育過程中起著重要作用。Fas是腫瘤壞死因子受體超家族的一員，通過與其配體FasL結(jié)合在多種細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-10]。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時， FasL與Fas結(jié)合，并通過進(jìn)一步與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(FADD)結(jié)合，激活半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)，引起細(xì)胞凋亡[11]；另外，活化的caspase-8可剪切BH3相互作用域死亡激動劑(BID)，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C(Cyt C)，介導(dǎo)線粒體凋亡通路[12]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)鎘可通過激活Fas/FasL通路和線粒體通路誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13-14]。但是，這兩條通路之間的關(guān)系以及Fas在鎘致神經(jīng)細(xì)胞凋亡線粒體通路中的作用和調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明。本試驗(yàn)以Fas基因沉默的大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞(PC12)為模型，用鎘進(jìn)行處理，通過Western blot、免疫熒光染色等方法探究Fas在鎘致PC12細(xì)胞凋亡中的作用及其對線粒體通路的調(diào)控機(jī)制，為揭示鎘的神經(jīng)毒性機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。Fas基因沉默PC12細(xì)胞株(Fas shRNA組，靶序列：5′-GATCCGGTGCGTGTCAAGCT TTAATCTTCAAGAGAGATTAAAGCTTGACA CGCACCTTTTTTA-3′)和插入非特異性序列的對照細(xì)胞株(NC組)由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建篩選獲得。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640、馬血清和胎牛血清購自Life Technologies公司；L-谷氨酰胺和青鏈霉素購自BBI公司；醋酸鎘和L-多聚賴氨酸購自Sigma公司；細(xì)胞線粒體分離試劑盒、Cy 3標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗和DAPI染色液購自碧云天生物技術(shù)研究所；凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)和核酸內(nèi)切酶G(Endo G)兔多克隆抗體購自Abcam公司；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)、Cyt C、細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅳ(COX-Ⅳ)、活化半胱氨酸蛋白酶-9(cleaved caspase-9)、活化半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、活化多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(cleaved PARP)、β-actin兔單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購自CST公司；BID兔多克隆抗體購自Novus公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；5810R型低溫高速冷凍離心機(jī)購自德國Eppendorf公司；電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購自美國BIORAD公司；激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司。

1.3 細(xì)胞的培養(yǎng)與處理

Fas基因沉默的PC12細(xì)胞株和對照細(xì)胞株接種于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%馬血清、5%胎牛血清、1%L-谷氨酰胺、1%青鏈霉素)，置于37 ℃和5% CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期時，用10 μmol·L-1Cd處理細(xì)胞12 h，分別命名為對照組(NC組)、鎘組(Cd組)、Fas shRNA干擾組(Fas shRNA組)、Fas shRNA與鎘共處理組(Fas shRNA+Cd組)。

1.4 細(xì)胞總蛋白、胞漿蛋白和線粒體蛋白的提取

收集各組細(xì)胞，加入適量含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，超聲裂解20 s；4 ℃，12 000 g·min-1離心10 min，收集上清即為總蛋白。

收集各組細(xì)胞，加入適量含有蛋白酶抑制劑的線粒體分離試劑重懸細(xì)胞團(tuán)塊，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的玻璃勻漿器中，冰上研磨，隨后將勻漿轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管，4 ℃，600 g·min-1離心10 min，吸取上清至新的離心管，4 ℃，11 000 g·min-1離心10 min，收集上清即為細(xì)胞漿蛋白，沉淀為線粒體；向沉淀中加入適量含有蛋白酶抑制劑的線粒體裂解液，冰上裂解30 min，12 000 g·min-1離心10 min，收集上清即為線粒體蛋白。

使用BCA法測定蛋白濃度并將蛋白濃度調(diào)整一致，按照1∶4加入5 × SDS-PAGE Loading Buffer，沸水煮10 min，蛋白保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)

取等量樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，5%脫脂乳室溫封閉1 h，4 ℃孵育相應(yīng)一抗(BID、Bax、Bcl-2、Cyt C、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3、cleaved PARP、AIF、Endo G、β-actin、 COX-Ⅳ抗體按1∶1 000稀釋)過夜，室溫孵育二抗(按1∶10 000稀釋)1 h，ECL顯影檢測蛋白表達(dá)情況。使用Image J軟件分析條帶灰度值，目的蛋白與β-actin或COX-Ⅳ灰度值的比值即為目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.6 免疫熒光染色檢測AIF核轉(zhuǎn)位

用0.01% L-多聚賴氨酸包被爬片并將其置于24孔培養(yǎng)板中，將Fas shRNA組和NC組細(xì)胞接種于爬片，待其長至對數(shù)生長期時，用10 μmol·L-1Cd處理細(xì)胞12 h后，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次；4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，棄去固定液，PBS洗滌3次；加入0.5% 曲拉通X-100，室溫透膜20 min，PBS洗滌3次；加入5% 牛血清白蛋白，室溫封閉1.5 h，棄去封閉液；4 ℃孵育AIF抗體(1∶100)過夜，PBS洗滌3次；室溫避光孵育Cy 3標(biāo)記山羊抗兔熒光二抗(1∶200)1 h，PBS洗滌3次； 滴加DAPI染色液，室溫避光孵育5 min，PBS洗滌2次；封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 Fas基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞BID活化的影響

10 μmol·L-1Cd分別處理NC組和Fas shRNA組細(xì)胞12 h，Western blot檢測BID和tBID蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖1所示，與NC組相比，Cd組tBID/BID比值極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組tBID/BID比值極顯著降低(P<0.01)。

2.2 Fas基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞Bax/Bcl-2比值變化的影響

10 μmol·L-1Cd分別處理NC組和Fas shRNA組細(xì)胞12 h，Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖2所示，與NC組相比，Cd組Bax/Bcl-2比值極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組Bax/Bcl-2比值極顯著降低(P<0.01)。

2.3 Fas 基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞Cyt C釋放的影響

10 μmol·L-1Cd分別處理NC組和Fas shRNA組細(xì)胞12 h，Western blot檢測Cyt C在細(xì)胞內(nèi)分布情況。結(jié)果如圖3所示，與NC組相比，Cd組線粒體中Cyt C表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)，細(xì)胞質(zhì)中Cyt C表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組線粒體中Cyt C表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，細(xì)胞質(zhì)中Cyt C表達(dá)量極顯著降低(P<0.01)。

2.4 Fas 基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化的影響

10 μmol·L-1Cd分別處理NC組和Fas shRNA組細(xì)胞12 h，Western blot檢測caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化情況。結(jié)果如圖4所示，與NC組相比，Cd組Cleaved caspase-9、Cleaved caspase-3和Cleaved PARP蛋白水平均極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組Cleaved caspase-9蛋白水平顯著降低(P<0.05)，Cleaved caspase-3和Cleaved PARP蛋白水平極顯著降低(P<0.01)。

與NC組相比，**表示P<0.01；與Cd組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。下同Compared with NC group, ** indicates P<0.01; Compared with Cd group, # indicates P<0.05, ## indicates P<0.01.The same as follows圖1 Fas基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞BID活化的影響Fig.1 Effects of Fas silencing on the activation of BID in PC12 cells caused by cadmium

圖2 Fas基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞Bax/Bcl-2比值變化的影響Fig.2 Effects of Fas silencing on the change of Bax/Bcl-2 ratio in PC12 cells caused by cadmium

圖3 Fas基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞Cyt C釋放的影響Fig.3 Effects of Fas silencing on the release of Cyt C in PC12 cells caused by cadmium

圖4 Fas基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞caspase-9、caspase-3和PARP蛋白活化的影響Fig.4 Effects of Fas silencing on the activation of caspase-9, caspase-3 and PARP in PC12 cells caused by cadmium

2.5 Fas 基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞AIF和Endo G蛋白表達(dá)的影響

10 μmol·L-1Cd分別處理NC組和Fas shRNA組細(xì)胞12 h，Western blot檢測AIF和Endo G蛋白表達(dá)水平。結(jié)果如圖5所示，與NC組相比，Cd組AIF和Endo G蛋白水平極顯著升高(P<0.01)；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組AIF和Endo G蛋白水平極顯著降低(P<0.01)。

圖5 Fas基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞AIF和Endo G蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of Fas silencing on the expression of AIF and Endo G in PC12 cells caused by cadmium

2.6 Fas 基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞AIF核轉(zhuǎn)位的影響

10 μmol·L-1Cd分別處理NC組和Fas shRNA組細(xì)胞12 h，免疫熒光染色法檢測AIF核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果如圖6所示，與NC組相比， Cd組熒光標(biāo)記蛋白AIF主要集中于細(xì)胞核；與Cd組相比，F(xiàn)as shRNA+Cd組熒光標(biāo)記蛋白AIF主要分散于細(xì)胞質(zhì)。

3 討 論

細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的程序性死亡，重金屬鎘可誘導(dǎo)包括神經(jīng)細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞發(fā)生凋亡[6,15-16]。死亡受體通路是經(jīng)典凋亡通路之一，其中，F(xiàn)as/FasL信號通路備受關(guān)注。Fas/FasL信號通路主要通過Fas/FasL/FADD/caspase-8途徑介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。體內(nèi)外研究表明，鎘可激活Fas/FasL信號通路誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13,17]。抑制Fas/FasL信號通路中的關(guān)鍵蛋白，能夠?qū)?xì)胞凋亡起到一定抑制作用。Ullah等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抑制Fas能夠降低腦缺血導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，干擾Fas顯著抑制氧糖剝奪再灌注誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，利用Anti-FasL抑制FasL可減輕鎘導(dǎo)致的PC12細(xì)胞凋亡[20]。

紅色熒光代表AIF，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核The red puncta represent AIF and the blue puncta represent nuclei圖6 Fas基因沉默對鎘致PC12細(xì)胞AIF核轉(zhuǎn)位的影響(標(biāo)尺=20 μm)Fig.6 Effects of Fas silencing on the nuclear transposition of AIF in PC12 cells caused by cadmium (scale bar=20 μm)

線粒體在哺乳動物細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。線粒體功能障礙會導(dǎo)致活性氧積累，引起氧化應(yīng)激和凋亡[21]。線粒體凋亡通路主要由Bcl-2家族蛋白介導(dǎo)。當(dāng)各種凋亡刺激作用于線粒體時，會激活Bcl-2家族促凋亡成員，導(dǎo)致促凋亡和抗凋亡蛋白的失衡，從而影響線粒體膜通透性[22-23]，導(dǎo)致線粒體釋放Cyt C等各種促凋亡因子[24-25]。釋放的Cyt C與凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)結(jié)合形成復(fù)合物，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspase-3[26]。激活的caspase-3剪切PARP，抑制受損DNA的修復(fù)，促進(jìn)凋亡細(xì)胞死亡[27-28]。體內(nèi)外研究表明，鎘可激活線粒體通路誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[17,29]。另外，線粒體通路和Fas/FasL通路之間存在緊密聯(lián)系，F(xiàn)as/FasL通路激活的caspase-8將BID剪切為tBID，tBID轉(zhuǎn)位到線粒體，誘導(dǎo)Cyt C釋放，從而激活線粒體通路[12]。Yu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠脊髓損傷模型中，F(xiàn)as缺陷抑制BID、caspase-9和caspase-3的激活，增加抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，干擾Fas能夠抑制氧糖剝奪再灌注導(dǎo)致的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞Bax和Caspase-3上調(diào)及Bcl-2下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)as基因沉默能夠顯著或極顯著抑制鎘引起的PC12細(xì)胞tBID/BID比值和Bax/Bcl-2比值升高，Cyt C釋放，caspase-9、caspase-3和 PARP蛋白活化。說明Fas通過調(diào)控caspase依賴的線粒體通路參與鎘致PC12細(xì)胞凋亡。

AIF和Endo G是位于線粒體膜間隙的核酸酶，凋亡發(fā)生時被釋放到細(xì)胞質(zhì)中并轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過caspase非依賴途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31-33]。大量研究表明，在細(xì)胞凋亡過程中，F(xiàn)as可誘導(dǎo)AIF和Endo G從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中[32,34-35]。Yu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠脊髓損傷模型中，F(xiàn)as缺陷抑制AIF從線粒體轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)as 基因沉默能夠極顯著抑制鎘引起的AIF和Endo G蛋白表達(dá)升高，并抑制AIF核轉(zhuǎn)位。說明Fas通過調(diào)控caspase非依賴的線粒體通路參與鎘致PC12細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

鎘通過激活線粒體通路誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，干擾Fas能夠抑制鎘激活的線粒體凋亡通路，說明Fas通過調(diào)控線粒體通路參與鎘致PC12細(xì)胞凋亡；這為揭示鎘的神經(jīng)毒性機(jī)制提供了新的理論基礎(chǔ)。