李 晨，邱存義，馮逸雪，韓力康，杜連昭，王茜茜，馬 欣，李瑞香*，王興龍*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100； 2. 渭南市臨渭區(qū)動物疫控中心，渭南 714000； 3. 浙江金大康動物保健品有限公司，金華 321016)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)，又稱豬藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)感染豬后引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。PRRSV造成以流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎為特征的母豬繁殖障礙性疾病和仔豬、育肥豬呼吸系統(tǒng)疾病。1996 年，我國首次分離到該毒株，正式確定了PRRS 在我國的傳播[1-2]。2006 年暴發(fā)的高致病性藍(lán)耳病(HP-PRRS)，其致病性相對經(jīng)典PRRSV 有了顯著升高[3]，近年來，國內(nèi)又在流行類NADC-30毒株，給防控帶來巨大壓力[4]。PRRSV有兩種基因型，PRRSV-I型(Lelysted virus，LV)為歐洲型毒株，PRRSV-II型(VR-2332)為美洲型毒株[5-6]。雖然歐洲型和美洲型毒株感染豬后引起的臨床癥狀相似，但二者抗原性差異較大，核苷酸相似度為55%～70%，氨基酸相似度為50%～80%[7-9]。目前，生產(chǎn)上主要用弱毒活疫苗或滅活疫苗預(yù)防PRRS，多數(shù)情況下免疫無法為野毒株提供充分保護(hù)，弱毒活疫苗還存在返強(qiáng)風(fēng)險[10-11]。積極尋求PRRS新的防控方案是近年來動物疫病防控領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。許多研究發(fā)現(xiàn)，中藥及其多糖類化合物具有很好的抗病毒效果[12]，參虎敗毒顆粒是由黃芩、虎杖、白頭翁、苦參、板藍(lán)根等中藥組成，具有清熱解毒、扶正祛邪、利濕退黃、抗菌抗病毒作用[13]，推測參虎敗毒顆粒可能對PRRSV具有較好抑制效果。因此，有必要對參虎敗毒顆?？筆RRSV的作用進(jìn)行研究，為其臨床應(yīng)用和后期高效抗PRRSV復(fù)方中藥的開發(fā)尋找依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 中藥及試劑

參虎敗毒顆粒復(fù)方中藥由浙江金大康動物保健品有限公司提供；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒抗體ELISA檢測試劑盒購自北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司。

1.2 毒株及試驗(yàn)動物

PRRSV JXA1毒株(104.7TCID50·mL-1)由西北農(nóng)林科技大學(xué)獸醫(yī)傳染病實(shí)驗(yàn)室提供，動物選用20頭35日齡健康、體重相近的PRRSV病原、抗體陰性斷奶仔豬，由勉縣良種繁育場提供。

1.3 PRRSV檢測引物

根據(jù)GenBank發(fā)表的序列，設(shè)計(jì)針對PRRSV ORF6、ORF7和豬β-actin片段引物及探針，PRRSV ORF6與探針檢測病毒血癥，PRRSV ORF7與β-actin檢測組織病毒載量(表1)。

表1 PCR引物和探針序列

1.4 方法

1.4.1 試驗(yàn)動物分組與處理 將20頭仔豬隨機(jī)平均分為A、B、C、D共4個組。A組仔豬接種PRRSV前3 d飼料中添加藥物；B組接種PRRSV當(dāng)天飼料中添加藥物；C組仔豬只接種PRRSV不添加藥物；D組仔豬為陰性對照組，各組單獨(dú)飼養(yǎng)管理。A、B、C組仔豬在試驗(yàn)第3天肌肉注射PRRSV JXA1毒株2.0 mL。

每日觀察各組仔豬臨床癥狀并測定體溫，攻毒后14 d各組隨機(jī)選取1頭仔豬處死，進(jìn)行眼觀肺部病理變化檢查和組織病理學(xué)檢查，并檢測肺的病毒載量。攻毒后1、3、5、7、14、21、28、35 d采抗凝和非抗凝血，進(jìn)行PRRSV抗體和病毒血癥檢測。動物分組及處理方案見表2。

表2 試驗(yàn)動物分組及處理方案

1.4.2 病理組織切片制作 肺組織樣品經(jīng)固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后，制作組織切片并進(jìn)行HE染色[14]，顯微鏡下觀察組織病理變化并拍照。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 20.0軟件對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以鄧肯氏法進(jìn)行多重比較，P<0.01表示差異極顯著(**)，P<0.05表示差異顯著(*)，P>0.05表示差異不顯著。

1.6 動物使用倫理

遵照《陜西省實(shí)驗(yàn)動物管理辦法》(陜西省人民政府令 第150號)和西北農(nóng)林科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理處置辦法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動物操作，符合動物福利要求。

2 結(jié) 果

2.1 仔豬體溫變化

A、B組攻毒后第6天體溫升高至40 ℃，持續(xù)至第11和12天恢復(fù)正常，高熱分別持續(xù)5和6 d；C組攻毒后第5天體溫升高至40 ℃，持續(xù)至第14天，高熱持續(xù)時間超過9 d；D組仔豬體溫正常(圖1)。

圖1 仔豬直腸溫度變化Fig.1 Rectal temperature changes in piglets

2.2 仔豬肺組織眼觀病理變化

攻毒14 d，各組隨機(jī)選1頭仔豬處死，眼觀病變主要集中在肺部，A組仔豬肺略顯蒼白，邊緣有少許實(shí)病，肺葉輕度皺縮(圖2a)。B組仔豬肺暗紅色，有部分出血點(diǎn)，邊緣及肺葉出血，小面積實(shí)變，肺葉少許皺縮(圖2b)。C組仔豬肺顏色更深，實(shí)變更為明顯，肺表面有出血點(diǎn)，出現(xiàn)明顯皺縮和凹凸不平(圖2c)。D組仔豬肺粉紅色、飽滿、無皺縮(圖2d)。

a. A組仔豬肺；b. B組仔豬肺；c. C組仔豬肺；d. D組仔豬肺a. Lung from the piglet in group A; b. Lung from the piglet in group B; c. Lung from the piglet in group C; d. Lung from the piglet in group D 圖2 各組仔豬肺組織眼觀病理變化Fig.2 Gross lesions in lungs from the piglets in different groups

2.3 仔豬肺組織病理學(xué)變化

分別在10倍物鏡下觀察仔豬肺泡腔和肺泡壁(圖3a～d)；在40倍物鏡下觀察仔豬支氣管管腔及官腔周圍淋巴細(xì)胞浸潤情況(圖3e～h)。A組可觀察到少量肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁稍增厚(圖3a)；支氣管上皮細(xì)胞腫大、增生，管腔內(nèi)有炎性滲出物和脫落的細(xì)胞以及少量巨噬細(xì)胞，細(xì)支氣管周圍大量有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(圖3e)。B組少量肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡壁增厚，厚薄不均勻(圖3b)；支氣管上皮細(xì)胞腫大、增生，管腔內(nèi)有炎性滲出物和脫落的細(xì)胞以及少量巨噬細(xì)胞，細(xì)支氣管周圍有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(圖3f)。C組肺泡結(jié)構(gòu)大量破壞，肺泡壁有大量淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡壁增厚導(dǎo)致肺泡狹窄(圖3c)；支氣管上皮細(xì)胞腫大、增生，管腔內(nèi)有炎性滲出物和脫落的細(xì)胞以及大量巨噬細(xì)胞，細(xì)支氣管周圍有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(圖3g)。D組肺泡結(jié)構(gòu)清晰，無明顯病變(圖3d)；支氣管上皮細(xì)胞無明顯病變，管腔內(nèi)無滲出物(圖3h)。

a、e. A組仔豬肺組織病理學(xué)變化；b、f. B組仔豬肺組織病理學(xué)變化；c、g. C組仔豬肺組織病理學(xué)變化；d、h. D組仔豬肺組織病理學(xué)變化a, e. Micro-lesions in lungs from piglet in group A; b, f. Micro-lesions in lungs from piglet in group B; c, g. Micro-lesions in lungs from piglet in group C; d, h. Micro-lesions in lung from piglets in group D圖3 各組仔豬肺組織病理學(xué)變化Fig.3 Micro-lesions in lungs from piglets in each group

2.4 仔豬脾和淋巴結(jié)組織病理變化

為觀察參虎敗毒顆粒組織毒性和PRRSV對免疫器官的影響，取各組仔豬脾和淋巴結(jié)制作組織病理學(xué)切片。其中A組連續(xù)用藥17 d，B組連續(xù)用藥14 d。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組脾和淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)未受到明顯影響，各組脾組織中脾小結(jié)結(jié)構(gòu)清晰，無明顯病變(圖4a～d)；各組淋巴結(jié)無明顯病變，生發(fā)中心結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細(xì)胞數(shù)量沒有明顯變化(圖4e～h)。

a～d. A～D組仔豬脾組織病理學(xué)變化；e～h. A～D組仔豬淋巴結(jié)組織病理學(xué)變化a-d. Micro-lesions in spleens of the piglets from Group A-D; e-h. Micro-lesions in lymph nodes of the piglets from Group A-D圖4 各組仔豬脾和淋巴結(jié)組織病理學(xué)變化(10×)Fig.4 Micro-lesions in spleens and lymph nodes of the piglets from different groups (10×)

2.5 仔豬血液中PRRSV載量

RT-qPCR檢測攻毒后1、3、5、7、14、21和28 d仔豬全血樣品，當(dāng)Ct > 35時判定為陰性，A組仔豬21 d PRRSV檢出比例為2/4，28 d 降為0/4；B組仔豬21 d 檢出比例為4/4，28 d降為0/4；C組仔豬21 d 檢出比例為4/4，28 d降為3/4；D組全程檢出比例均為0/4 (表3)。

A、B組部分豬在21和28 d 時PRRSV檢測為陰性，因此，僅對1、3、5、7和14 d仔豬全血病毒載量進(jìn)行定量分析。結(jié)果如圖5所示，A、B、C組仔豬病毒載量均在第5天達(dá)到峰值，隨后逐漸下降。A組在攻毒后第3、5、7、14天病毒載量均極顯著低于C組(P<0.01)。B組在攻毒后第3和5天病毒載量極顯著低于C組(P<0.01)，在攻毒后第7和14天病毒載量顯著低于C組(P<0.05)。

表3 仔豬血液中PRRSV檢出比例

a. 仔豬PRRSV病毒載量；b. RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=-3.195x+39.801，R2=0.998)。ns表示差異不顯著，下同a.PRRSV viral load in piglets; b. Standard curve of RT-qPCR (y=-3.195x+39.801，R2=0.998). ns represents non-significant difference, same as below圖5 RT-qPCR檢測全血樣品中PRRSV載量Fig.5 RT-qPCR analyze viral loads in blood samples

2.6 仔豬肺組織PRRSV載量

RT-qPCR檢測攻毒后14 d A、B、C組仔豬肺組織PRRSV載量，β-actin為內(nèi)參，將病毒載量最少的組作為參照。結(jié)果顯示，C組病毒載量顯著高于A組(P<0.05)， A、B組差異不明顯(P>0.05，圖6)。

2.7 仔豬PRRSV抗體產(chǎn)生情況

A、B、C組仔豬PRRSV抗體均在第14天轉(zhuǎn)陽，A、B組在第21天抗體S/P值達(dá)到峰值，隨后下降(圖7a、b)，C組在攻毒后28 d抗體S/P值達(dá)到峰值(圖7c)。A組仔豬抗體(S/P平均值1.061)低于B組(S/P平均值1.913)和C組(S/P平均值1.744)(圖7d)，但差異不顯著，A組抗體離散度小于其他兩組。

圖6 各組仔豬肺組織PRRSV載量Fig.6 Viral loads in lungs from the piglets in different groups

a.A組抗體S/P值；b. B組抗體S/P值；c. C組抗體S/P值；d. 各組相對抗體S/P值a. S/P value of group A; b. S/P value of group B; c. S/P value of group C; d. Relative S/P value in each group圖7 PRRSV抗體產(chǎn)生情況Fig.7 The production of PRRSV antibodies

3 討 論

參虎敗毒顆粒組方起源于古方七清敗毒顆粒，主要成分為黃芩、虎杖、白頭翁、苦參、板藍(lán)根、大青葉和綿馬貫眾。黃芩具有清熱燥濕，瀉火解毒的作用，其多糖成分主要包括黃芩苷、黃芩素等[15]。黃芩苷與黃芩素均能不同程度地干擾和抑制病毒的復(fù)制增殖[16]，體外抗PRRSV中藥單體篩選試驗(yàn)中，黃芩苷在最大安全濃度(18 μmol·L-1)時對PRRSV具有較好的抑制作用和直接殺滅作用，但在低濃度(9 μmol·L-1)時抗PRRSV作用不明顯[17]，而以黃芩為主要成分的梔子四黃散飼喂感染PRRSV的豬，發(fā)現(xiàn)其具有減輕臨床癥狀的作用，也可促進(jìn)IgG、IFN-γ的產(chǎn)生和抑制IL-10的升高[18]?；⒄染哂星鍩犰顫?，退熱止痛的作用，其主要活性成分包括白藜蘆醇和大黃素等，白藜蘆醇對許多DNA和RNA病毒具有抑制作用和免疫調(diào)節(jié)作用[19-20]，中藥體外抗PRRSV結(jié)果發(fā)現(xiàn)，虎杖具有顯著的抗PRRSV作用，其抑制率可達(dá)90%以上[21]。白頭翁具有清熱解毒，涼血止痢的作用，白頭翁多糖成分主要為白頭翁皂苷、白頭翁素和三萜酸等[22]，體外抗PRRSV試驗(yàn)結(jié)果表明，白頭翁粗提取物對PRRSV感染Marc-145細(xì)胞具有顯著的抑制作用、直接殺滅作用和阻斷作用[23]?？鄥⒕哂星鍩崂麧?，抗菌消炎的作用，苦參堿是其主要活性成分，有研究顯示，苦參堿提前作用于Marc-145細(xì)胞后接毒可顯著降低細(xì)胞CD163和CD151的表達(dá)，但單獨(dú)使用苦參堿作用于細(xì)胞時不會抑制CD163和CD151的表達(dá)[24]，另有研究表明，苦參堿可能在細(xì)胞感染PRRSV后不同時間點(diǎn)抑制不同的細(xì)胞受體而發(fā)揮抗病毒作用[25]。板藍(lán)根的功效是清熱解毒、涼血止咳，其主要活性成分板藍(lán)根多糖具有較好的抗病毒效果和免疫增強(qiáng)作用[26]，體外抗病毒試驗(yàn)結(jié)果表明，板藍(lán)根多糖對PRRSV具有較強(qiáng)的阻斷作用和抑制作用，但在低濃度時對PRRSV無直接殺滅作用[27-28]，另有研究表明，通過飼喂板藍(lán)根提取物可顯著抑制PRRSV弱毒疫苗免疫后豬體內(nèi)病毒核酸載量，且病毒核酸載量在試驗(yàn)過程中呈下降趨勢[29]。

本研究中，提前和感染同時藥物處理的兩組仔豬在攻毒后12 d體溫恢復(fù)至正常，而無藥物處理感染組體溫在14 d仍高于40 ℃，并且肺部眼觀和組織病理變化結(jié)果都顯示，飼喂參虎敗毒顆?？娠@著減輕PRRSV對肺的損傷，該結(jié)果與解慧梅等[18]使用梔子四黃散治療感染PRRSV仔豬的結(jié)果相似。藥物處理可減輕PRRSV感染引起的臨床癥狀，本試驗(yàn)中設(shè)置了提前藥物處理組，結(jié)果顯示，提前預(yù)防用藥效果更好，提示中藥制劑可能對PRRSV的預(yù)防作用強(qiáng)于治療作用。飼喂參虎敗毒顆粒的兩組仔豬在攻毒后14 d內(nèi)均可極顯著或顯著抑制豬體內(nèi)PRRSV載量，促進(jìn)PRRSV的清除，該結(jié)果和王惠[30]研究的板藍(lán)根配合不同中藥制劑可降低PRRSV載量結(jié)果一致，且提前預(yù)防用藥效果優(yōu)于接毒同時用藥，這可能與仔豬感染PRRSV前含有一定的血藥濃度有關(guān)。PRRSV抗體S/P值結(jié)果顯示，3組仔豬血清PRRSV抗體陽性率均在攻毒后14 d達(dá)到100%，但飼喂參虎敗毒顆粒的兩組仔豬PRRSV抗體峰值提前，提前藥物處理組抗體S/P值低于無藥物處理感染組(病毒對照組)，與林昌華等[31-32]提前飼喂月桂酸降低PRRSV抗體水平的結(jié)果相似，不同的是，飼喂月桂酸后PRRSV抗體峰值與對照組保持一致，而本試驗(yàn)中飼喂參虎敗毒顆粒后可使PRRSV抗體峰值提前，這可能與藥物的免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)，需進(jìn)一步研究。

JXA1毒株為高致病PRRSV毒株，但試驗(yàn)過程中未造成感染仔豬死亡，可能與接種劑量(2 mL×104.7TCID50·mL-1)偏少、病毒多次細(xì)胞傳代(30代)導(dǎo)致毒力下降或試驗(yàn)仔豬日齡偏大有關(guān)(35日齡)，但攻毒仍然造成了明顯的肺組織病理損傷，藥物處理組和感染組存在明顯的眼觀和組織病理變化差異，可以證明藥物確實(shí)能夠抑制PRRSV的致病變作用，對試驗(yàn)預(yù)期效果影響不大。

4 結(jié) 論

綜上所述，參虎敗毒顆?？娠@著減輕PRRSV感染造成的肺損傷、降低病毒血癥、促進(jìn)病毒清除，且預(yù)防性用藥效果更好，提示參虎敗毒顆?？勺鳛轭A(yù)防和治療PRRSV的藥物。另外，參虎敗毒顆?？梢钥s短PRRSV病毒血癥持續(xù)時間，提示可以在接種PRRSV弱毒疫苗后使用，以減少疫苗毒豬體帶毒時間，降低弱毒疫苗變異返強(qiáng)風(fēng)險。本研究證明了參虎敗毒顆粒具有很好的體內(nèi)抗PRRSV的作用，為PRRSV臨床防控用藥提供了重要的理論支撐，同時為更加高效的抗PRRSV復(fù)方中藥的研究提供參考數(shù)據(jù)。