楊 彥 潘志蘭 張志敏

多發(fā)性骨髓瘤是臨床上一種難治性惡性腫瘤，該疾病主要是由于骨髓克隆性漿細胞惡性增生同時單克隆免疫球蛋白增加所致[1,2]，是血液系統(tǒng)中第三大惡性腫瘤，其發(fā)病率在血液系統(tǒng)惡性疾病中僅次于淋巴瘤，常見于老年人，具有發(fā)病率高、預后差、死亡率高等特點。多發(fā)性骨髓瘤的主要臨床特征為骨痛、骨損害、貧血、反復感染等[3，4]?；颊咴缙谌狈μ禺愋耘R床表現(xiàn)，不易發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者就診時病情較嚴重，對治療及預后造成嚴重影響。目前，對多發(fā)性骨髓瘤的研究以探究其發(fā)病機制、提高治療效果、改善患者預后為主[5]。隨著研究的不斷深入及醫(yī)療科技水平的不斷提高，免疫抑制劑、蛋白酶抑制劑、自體干細胞移植等的應用治療多發(fā)性骨髓瘤，大大改善了患者預后，使患者的中位生存時間從3年增加到6年左右，但患者仍會復發(fā)，如何治愈多發(fā)性骨髓瘤仍是醫(yī)學者需要克服的重要難題，尋找該疾病的發(fā)生發(fā)展的相關機制，并探究其與患者預后的關系已成為目前臨床研究的重點領域。

細胞周期素D1(Cyclin D1)和細胞周期素D3(Cyclin D3)是細胞周期素G家族的重要成員，在促進細胞增殖、加速細胞周期轉(zhuǎn)變等過程具有重要作用[6，7]。p21是細胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子，相關研究顯示p21的異常表達可影響細胞的增殖、分化及腫瘤的發(fā)生[8]。有研究顯示，Cyclin D1、D3、p21與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生密切相關?；诖?，本研究擬通過檢測多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中Cyclin D1、D3、p21的表達情況及與預后的關系，為臨床治療多發(fā)性骨髓瘤提供有價值的參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象和分組

選取2015-07—2016-12本院收治的多發(fā)性骨髓瘤患者80例為多發(fā)性骨髓瘤組，其中，男性46例，女性34例，年齡49-68歲。同期選取在本院就診患有營養(yǎng)性貧血者20例為對照組，其中，男14例，女6例，年齡48-68歲。多發(fā)性骨髓瘤組與貧血對照組間性別、年齡等比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準通過(批號：20140725)，所有樣品采集均取得患者及家屬知情并簽署同意書，且符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》。

1.2 納入排除標準

多發(fā)性骨髓瘤組納入標準：(1)符合2013年制定的《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》中有關多發(fā)性骨髓瘤的相關診斷標準[9]；(2)患者及家屬選擇在本院接受治療者；(3)入院前未進行放化療治療者；(4)自愿加入本研究者；(5)臨床資料完整者。排除標準：(1)患有系統(tǒng)性疾病者；(2)患有其它惡性腫瘤及癌癥者；(3)患有嚴重內(nèi)分泌疾病者；(4)嚴重精神疾病不配合治療者。

1.3 主要試劑與儀器

總RNA提取試劑盒(貨號：RM102)購自于蘭州美伯生物醫(yī)藥科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號：KL266)購自于上?？道噬锟萍加邢薰?；各引物由北京甘棠飛華生物科技有限公司設計合成；本研究中其它化學藥品均購自上海吉瑪制藥技術有限公司。離心機(型號：JIDI-21D)購自于廣州吉迪儀器有限公司；實時熒光定量PCR儀(貨號：V115896)購于美國Applied Biosystems公司。

1.4 觀察指標與方法

1.4.1 樣品采集及處理：在無菌條件下對所有受試者進行骨髓液(5ml)采集，然后肝素抗凝，離心后收集骨髓單個核細胞，置于-70℃冰箱中保存待測。

1.4.2 骨髓中Cyclin D1 mRNA、Cyclin D3 mRNA、p21 mRNA表達水平檢測：采用實時熒光定量PCR法(Quantitative Real-time PCR，qRT-PCR)檢測各組研究對象骨髓中Cyclin D1、Cyclin D3、p21 mRNA表達水平。擴增體系為10μl，反應條件：95℃預變性3min，95℃15s，65℃1min，70℃延伸40s，行35個循環(huán)。各引物序列見表1。采用2-△△Ct法計算骨髓中Cyclin D1、Cyclin D3、p21 mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 免疫組化染色：采用免疫組化法檢測各組骨髓單個核細胞Cyclin D1、Cyclin D3、p21蛋白陽性表達情況。染色結(jié)束后隨機取10個高倍鏡視野進行病理切片觀察，并統(tǒng)計陽性細胞數(shù)量，陽性細胞比例分成5個等級：無陽性細胞，0分；1%-24%，1分；25%-49%，2分；50%-74%，3分；75%-100%，4分。染色強度判斷：無染色為0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；棕褐色，3分。兩項得分相乘：0-6分為陰性，6分以上為陽性。

1.5 隨訪

對本研究中涉及到的所有多發(fā)性骨髓瘤患者治療出院后進行為期3年的門診復查或電話隨訪，末次隨訪時間為2019-12-30，死亡患者以死亡時間作為隨訪截止期，并做好記錄，本次研究中未出現(xiàn)失訪病例。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組骨髓中Cyclin D1、D3、p21 mRNA表達水平比較

多發(fā)性骨髓瘤組Cyclin D1、D3 mRNA表達水平均顯著高于對照組(P<0.01)；p21 mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.01)。詳見表2。

表2 兩組骨髓中Cyclin D1、D3、p21mRNA表達水平比較

2.2 兩組骨髓中Cyclin D1、D3、p21蛋白陽性表達率比較

多發(fā)性骨髓瘤組Cyclin D1、D3陽性表達率均顯著高于對照組(P<0.01)；p21陽性表達率顯著低于對照組(P<0.01)。見表3。

表3 兩組骨髓Cyclin D1、D3、p21蛋白陽性率比較

2.3 骨髓中Cyclin D1、D3、p21表達與患者預后的關系

本次80例多發(fā)性骨髓瘤患者隨訪時間3年，生存41例，總生存率51.2%。以Cyclin D1、D3、p21 mRNA各自表達水平的平均值(1.57、0.66、1.29)分別將多發(fā)性骨髓瘤患者分為高表達組(高于平均值)和低表達組(低于平均值)。繪制多發(fā)性骨髓瘤患者治療后1—36個月高、低表達組的生存曲線。Cyclin D1高表達組術后3年總生存率低于Cyclin D1低表達組(χ2=5.031，P<0.05)；Cyclin D3高表達組術后3年總生存率低于Cyclin D3低表達組(χ2=7.336，P<0.05)；p21高表達組術后3年總生存率高于p21低表達組(χ2=11.361，P<0.01)。見圖1、2、3和表4。

表4 不同Cyclin D1、D3、p21表達水平患者生存率比較

圖1 不同水平Cyclin D1多發(fā)性骨髓瘤患者3年生存曲線分析

2.4 影響多發(fā)性骨髓瘤患者預后的因素分析

單因素分析顯示，Cyclin D1、D3、p21表達水平是影響多發(fā)性骨髓瘤患者預后的危險因素。多因素分析顯示，Cyclin D1、D3高表達和p21低表達是影響多發(fā)性骨髓瘤患者預后的獨立危險因素(HR=2.884，95%CI為1.714-4.853；HR=2.575，95%CI為1.266-5.239；HR=2.979，95%CI為1.671-5.312；P均<0.05)。詳見表5。

圖2 不同水平Cyclin D3多發(fā)性骨髓瘤患者3年生存曲線分析

圖3 不同水平p21多發(fā)性骨髓瘤患者3年生存曲線分析

表5 影響多發(fā)性骨髓瘤患者預后的因素分析

3 討 論

Cyclin D是細胞周期的正性調(diào)控因子，其可通過激活相關酶的活性改變細胞周期[10]。Cyclin D1、D3是Cyclin D的兩個重要成員，在參與DNA合成、促進細胞周期轉(zhuǎn)變及導致細胞癌變中發(fā)揮重要作用[11]。任婧婧等[12]研究發(fā)現(xiàn)，可通過RNA干擾Cyclin D1蛋白表達來誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞的凋亡。王卓[13]研究發(fā)現(xiàn)，Cyclin D3可作為曲妥珠單抗治療乳腺癌的有效蛋白標記物。Rasmussen等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在42%(46/110)的多發(fā)性骨髓瘤樣本中檢測到Cyclin D1，且Cyclin D1 mRNA在多發(fā)性骨髓瘤患者中呈高表達。本研究結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤組Cyclin D1、D3 mRNA表達水平及蛋白陽性率顯著高于對照組，提示Cyclin D1、D3可能通過促進細胞周期轉(zhuǎn)化，進而參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展。

p21是一種細胞周期負調(diào)控蛋白，位于P53基因下游第6號染色體上，相對分子質(zhì)量為21 kDa[15]。大量研究已證實，p21與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。張軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，p21在卵巢漿液性腺癌患者中表達降低，且其表達水平與患者預后密切相關。Yao等[17]研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白脫乙酰激酶抑制劑可通過靶向p21基因，促進p21表達上調(diào)，從而誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞凋亡。Dhyani等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ANKHD1可通過下調(diào)p21啟動子的活性，進而促進多發(fā)性骨髓瘤細胞的生長。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤組p21 mRNA表達水平及蛋白陽性率顯著低于對照組，提示p21可能受ANKHD1抑制，進而導致多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展。生存曲線分析表明，Cyclin D1、D3高表達組術后3年總生存率低于Cyclin D1、D3低表達組，p21高表達組術后3年總生存率高于p21低表達組，提示Cyclin D1、D3、p21表達水平可為多發(fā)性骨髓瘤患者預后的預測提供參考。Cox多因素分析顯示，Cyclin D1、D3高表達和p21低表達是影響多發(fā)性骨髓瘤患者預后的獨立危險因素，提示降低Cyclin D1、D3表達和升高p21表達可能有助于緩解多發(fā)性骨髓瘤病情的發(fā)展，有利于患者預后。

綜上所述，Cyclin D1、D3在多發(fā)性骨髓瘤患者中的表達明顯升高，p21的表達水平降低，三者水平均與患者預后密切相關，提示Cyclin D1、D3、p21可能作為多發(fā)性骨髓瘤的病情評估及不良預后預測的的潛在生物學指標。

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