劉麗穎 司永華 高 陽 劉興岳 劉寶環(huán)

呼吸道合胞病毒(RSV)是毛細(xì)支氣管炎的常見病因。RSV感染的臨床表現(xiàn)可以從普通上呼吸道感染進(jìn)展到需要機(jī)械通氣的嚴(yán)重下呼吸道感染。約1%-2%的RSV感染患兒需要住院治療，其中6%-11%患兒需要重癥監(jiān)護(hù)。年齡偏小、早產(chǎn)、RSV感染和并發(fā)癥是其發(fā)展成為重癥的危險(xiǎn)因素[1]，對(duì)嬰幼兒的健康造成嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，毛細(xì)支氣管炎患兒日后發(fā)展為哮喘的概率高達(dá)29.1%-40.9%[2]，但至今尚不清楚具體的作用機(jī)制。自然殺傷(NK)細(xì)胞是先天性淋巴細(xì)胞，在對(duì)抗感染時(shí)作為“第一反應(yīng)者”[3]，這種快速反應(yīng)能力在RSV感染中的重要性不言而喻。NK細(xì)胞也會(huì)形成隨后的適應(yīng)性免疫反應(yīng)。白介素家族(ILS)共享一個(gè)共同的γ鏈?zhǔn)荏w(γc)，通過增加bcl-2和bcl-xl抗凋亡蛋白的表達(dá)可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，尤其對(duì)NK細(xì)胞穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起著重要作用。白細(xì)胞介素-8(IL-8)及白細(xì)胞介素-15(IL-15)可以調(diào)控NK細(xì)胞的發(fā)育和活化狀態(tài)[4，5]。因此，理論上IL-8和IL-15水平變化在RSV致毛細(xì)支氣管炎的疾病進(jìn)展中起重要作用。但目前關(guān)于IL-8、IL-15與毛細(xì)支氣管炎病情發(fā)展的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。因此，本文通過檢測(cè)患兒血清IL-8和IL-15的水平變化，探討其與病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，為臨床診斷和治療提供一定的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取本院在2016-01-2018-01期間入院治療的RSV毛細(xì)支氣管炎患兒。納入標(biāo)準(zhǔn)：鼻咽分泌物經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)證實(shí)為RSV感染，臨床表現(xiàn)：流涕、咳嗽、陣發(fā)性喘息、氣促、胸壁吸氣性凹陷(三凹征)、聽診呼氣相延長(zhǎng)、可聞及哮鳴音及細(xì)濕啰音；年齡<2歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：其它呼吸系統(tǒng)疾病、免疫缺陷史、先天性心臟病、血液動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定、有死亡危險(xiǎn)或缺乏父母監(jiān)護(hù)患兒；既往3個(gè)月內(nèi)使用支氣管舒張劑、類固醇治療患兒。最終納入患兒100例(疾病組)。年齡3.8-5.7月，平均年齡(4.83±0.35)月；男62例，女38例；體重2.85-5.35kg，平均體重(3.27±1.77)kg；早產(chǎn)兒13例；特應(yīng)性疾病家族史57例；出現(xiàn)癥狀時(shí)間4-7天，平均時(shí)間(5.53±0.78)天。同期嚴(yán)格遵循隨機(jī)原則招募21例體檢正常的兒童進(jìn)行對(duì)照研究，年齡3.9-5.4月，平均年齡(4.86±0.37)月；男8例，女13例；體重3.05-5.22kg，平均體重(3.09±1.33)kg。兩組對(duì)象性別、年齡、體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.983，t=0.197，0.518，P均>0.05)，具有可比性。本次研究經(jīng)我院醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)且入組兒童監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

1.2 疾病組患兒分組

根據(jù)毛細(xì)支氣管炎診斷、治療與預(yù)防專家共識(shí)(2014年版)[6]，疾病組患兒被分為3組。輕度組(35例)：喂養(yǎng)量正常，呼吸頻率正常或稍增快，輕度胸壁吸氣性三凹征，無鼻翼煽動(dòng)或呻吟，血氧飽和度>92%；精神狀態(tài)正常。中度組(41例)：喂養(yǎng)量下降至正常一半，呼吸頻率>60次/min，中度胸壁吸氣性三凹征，無鼻翼煽動(dòng)或呻吟，血氧飽和度88%-92%；輕微或間斷煩躁、易激惹。重度組(24例)：喂養(yǎng)量下降至正常一半以上或拒食，呼吸頻率>70次/min，重度胸壁吸氣性三凹征，出現(xiàn)鼻翼煽動(dòng)或呻吟，血氧飽和度<88%，極度煩躁不安、嗜睡、昏迷。

1.3 一般資料收集

收集入組兒童年齡、性別、體重、早產(chǎn)史、特應(yīng)性疾病家族史、癥狀時(shí)間。入組患者的血液樣品均在入院后第2天收集。

1.4 血液指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 血清IL-8、IL-15水平檢測(cè)：采集入組患兒及對(duì)照組血液3ml, 4℃、3 000r/min離心15min，取上清后采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)IL-8、IL-15水平(購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司酶聯(lián)免疫試劑盒)。

1.4.2 外周血單核細(xì)胞(PBMC)IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平檢測(cè)：采集入組患兒及對(duì)照組外周靜脈血EDTA抗凝，采用密度梯度離心法提取PBMC，實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)方法檢測(cè)外周血單核細(xì)胞中IL-8 mRNA及IL-15 mRNA水平(PCR試劑盒購自上海雅吉生物科技有限公司)。步驟如下：用TRIzol法提取總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑合成方法合成 cDNA。 以cDNA 為模板，加入特異性引物，具體如下： 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ(10μl)、ROX DYEⅡ(0.4μl)、上下游引物(各0.4μl)、cDNA(2μl)、ddH2O(6.8μl)，總體積20μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性3min, 94℃變性30s， 62℃復(fù)性45s，60℃延伸60s，共45個(gè)循環(huán)。用2-△△Ct法，以β-actin表達(dá)為內(nèi)參定量IL-15 mRNA及IL-8 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 小兒危重病例評(píng)分法(PCIS)評(píng)分[7]

評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：包括心率、血壓、呼吸、動(dòng)脈血氧分壓(PaO2)、pH值、血鈉、血鉀、肌酐(Cr)或血尿素氮(BUN)、血紅蛋白(Hb)、胃腸系統(tǒng)，每項(xiàng)均采用3級(jí)評(píng)分法，分值為4分、6分和10分，其中Cr與BUN評(píng)分時(shí)計(jì)1項(xiàng)，分值范圍40-100分，≤70分為極危重癥，71-80分為危重癥，>80分為非重癥。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組PBMC中IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平比較

各組PBMC中IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。輕度、中度、重度各組患兒的IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平均高于對(duì)照組(t均>86.51，P<0.01)；與輕度組比較，中度組和重度組患兒的IL-8 mRNA和IL-15 mRNA表達(dá)水平均升高，(t均>45.42，P<0.01)；與中度組比較，重度組患兒的IL-8 mRNA和IL-15 mRNA表達(dá)水平降低(t=22.82，P<0.01)，見表1。

表1 各組IL-8 mRNA、IL-15 mRNA水平比較

2.2 各組血清IL-8和IL-15水平比較

各組血清IL-8、IL-15水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。輕度、中度、重度各組患兒血清IL-8、IL-15水平均高于對(duì)照組(t均>20.44，P<0.01)；與輕度組比較，中度組和重度組患兒血清IL-8和IL-15水平均升高(t均>19.50，P<0.01)；與中度組比較，重度組患兒血清IL-8和IL-15水平亦升高(t均>17.52，P<0.01)。見表2。

表2 各組血清IL-8、IL-15水平比較

2.3 不同病情嚴(yán)重程度患兒PCIS評(píng)分比較

各組患兒PCIS評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。重度組患兒PCIS評(píng)分高于輕度和中度組(t均>35.70，P<0.01)；中度組患兒PCIS評(píng)分高于輕度組患兒(t=15.34，P<0.01)，見表3。

表3 不同病情嚴(yán)重程度患兒PCIS評(píng)分比較

2.4 血清IL-8和IL-15水平與患兒疾病嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

疾病組患兒血清IL-8和IL-15水平與PCIS評(píng)分呈正相關(guān)(r= 0.842、0.952，P<0.05)，見圖1。

圖1 IL-15及IL-8水平與患兒病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性分析

3 討 論

毛細(xì)支氣管炎主要由病毒感染引起，其中RSV和鼻病毒是最常見的病原[8]。毛細(xì)支氣管炎可能導(dǎo)致患兒日后出現(xiàn)反復(fù)喘息甚至發(fā)生哮喘[9]，研究表明[10]：RSV感染可導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞腫脹，繼而壞死和脫落，同時(shí)釋放大量的炎性因子，發(fā)生一系列的免疫和病理反應(yīng)，導(dǎo)致氣道上皮結(jié)構(gòu)破壞和功能缺陷，引起反復(fù)喘息，甚至可能導(dǎo)致日后哮喘的發(fā)生。

本研究通過檢測(cè)患兒血清IL-15及IL-8水平變化，探討其與毛細(xì)支氣管炎患兒疾病嚴(yán)重程度的關(guān)系。以期能夠?yàn)樵摬』純旱呐R床治療節(jié)約時(shí)間，降低其日后發(fā)生哮喘的概率。

毛細(xì)支氣管炎患兒PBMC中IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表達(dá)上調(diào)，血清IL-15及IL-8水平升高。這與RSV感染引起的先天免疫反應(yīng)過程一致。隨著疾病嚴(yán)重程度增加，血清IL-15及IL-8水平升高；但是未觀察到重度組患兒的IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表達(dá)持續(xù)上調(diào)。重度毛細(xì)支氣管炎患兒血清IL-15和IL-8水平與IL-15 mRNA和IL-8 mRNA表達(dá)變化缺乏一致性，可能有多種解釋。首先，血清IL-15和IL-8水平反映了所有細(xì)胞產(chǎn)生的總和，而本研究中所檢測(cè)的IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表達(dá)僅反映了單核細(xì)胞中mRNA的表達(dá)。IL-15及IL-8表達(dá)在mRNA水平上可能受到嚴(yán)格的、精密的靶向調(diào)控。另外，重度組患兒IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表達(dá)水平未持續(xù)上調(diào)可能是重度毛細(xì)支氣管炎患兒出現(xiàn)“免疫麻痹”。在膿毒癥狀態(tài)持續(xù)存在的患者中，觀察到宿主免疫反應(yīng)從促炎轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡谆蛎庖邿o反應(yīng)狀態(tài)而導(dǎo)致“免疫麻痹”現(xiàn)象出現(xiàn)[11]。在重癥肺炎患者中同樣也觀察到類似 “免疫麻痹”現(xiàn)象[12]。在這種情況下，“免疫麻痹”可能是由基因介導(dǎo)的，且與部分患兒存在重度毛細(xì)支氣管炎患兒的遺傳易感性有關(guān)。這與相關(guān)研究[13-15]學(xué)者報(bào)道的結(jié)果一致。他們認(rèn)為RSV感染嚴(yán)重程度部分由遺傳因素決定。最后，重度毛細(xì)支氣管炎患兒?jiǎn)魏思?xì)胞中IL-15 mRNA及IL-8 mRNA表達(dá)水平未持續(xù)上調(diào)可能反映病毒致病作用。例如，RSV感染單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞能降低其激活CD4+T細(xì)胞的能力。而IL-15及IL-8在單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中均存在表達(dá)[16]。IL-15是NK細(xì)胞的生長(zhǎng)分化因子，它影響B(tài)淋巴細(xì)胞增殖和抗體產(chǎn)生。研究表明IL-15抑制嗜酸性粒細(xì)胞凋亡，通過Th細(xì)胞活性誘導(dǎo)IL-5合成，通過促進(jìn)哮喘大鼠Th1型免疫應(yīng)答抑制Th2型免疫應(yīng)答[17]。此外，本研究相關(guān)性分析顯示IL-8、IL-15與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)的結(jié)果，提示病情越嚴(yán)重，IL-8、IL-15水平越高，IL-8與IL-15可能參與了毛細(xì)支氣管炎發(fā)病的病理生理過程，并與病情程度有一定的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，IL-15及IL-8可能參與RSV致毛細(xì)支氣管炎患兒疾病進(jìn)展，可作為病情診斷的參考指標(biāo)，因本研究觀察時(shí)間較短，還需未來進(jìn)行長(zhǎng)期的、大樣本的研究，以便提供更準(zhǔn)確的結(jié)論供臨床參考。

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