李中華 綜述 趙自剛審校

細(xì)胞自噬(Autophagy)廣泛發(fā)生于真核細(xì)胞，是一種將細(xì)胞質(zhì)成分、受損細(xì)胞器或感染因子運(yùn)輸?shù)饺苊阁w進(jìn)行降解的高度保守的分解代謝過(guò)程。當(dāng)機(jī)體發(fā)生饑餓、生長(zhǎng)因子缺乏或高能量需求時(shí)，自噬激活可以補(bǔ)充代謝所需能量，以及應(yīng)對(duì)多種應(yīng)激如缺氧、感染等[1, 2]。基礎(chǔ)水平的自噬，通過(guò)清除應(yīng)激、衰老和疾病過(guò)程中產(chǎn)生的多泛素化蛋白聚集體，降解入侵病原體，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的釋放并參與抗原提呈和淋巴細(xì)胞發(fā)育，有利于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[3]。腸缺血常繼發(fā)于小腸移植和腹主動(dòng)脈瘤等手術(shù)過(guò)程中，也是失血性休克、感染性休克等危重病理過(guò)程引起腸道應(yīng)激性缺血、恢復(fù)再灌的常見(jiàn)病理生理過(guò)程。及時(shí)恢復(fù)腸道血液灌注，避免腸缺血性損傷、腸屏障功能障礙和腸源性細(xì)菌、內(nèi)毒素移位，對(duì)防止全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS)、遠(yuǎn)隔器官功能障礙與結(jié)構(gòu)損傷，甚至多器官功能障礙綜合征或多器官衰竭的發(fā)生至關(guān)重要。近年來(lái)，自噬在腸缺血性損傷中的作用日益受到關(guān)注，但具體作用仍存在爭(zhēng)議。有研究報(bào)道自噬激活有助于減輕腸缺血性損傷，但也有研究發(fā)現(xiàn)抑制自噬有助于減輕腸黏膜屏障損傷[4, 5]。靶向自噬可能成為防治腸缺血性損傷的一種有效策略。

1 自噬在維持腸道穩(wěn)態(tài)中的作用

1.1 自噬方式與過(guò)程

根據(jù)運(yùn)輸方式和生理功能，自噬主要分為三種：巨自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬，其中巨自噬即為我們通常所說(shuō)的自噬，它是一種通過(guò)雙層膜結(jié)合囊泡(即自噬體)吞噬待降解物質(zhì)后，與溶酶體融合降解的方式[6]。自噬一般包括啟動(dòng)、成核、伸長(zhǎng)、融合和降解等環(huán)節(jié)，主要受自噬相關(guān)基因(Autophagy-related Gene，ATG)的調(diào)節(jié)。自噬的啟動(dòng)由unc-51樣激酶1(Unc-51 Like Kinase 1，ULK1)復(fù)合物[由ULK1、ATG13、200kDa的家族相互作用蛋白(Family Interacting Protein of 200kDa, FIP200)和ATG101等構(gòu)成]激活。成核和伸長(zhǎng)則由ULK1復(fù)合物誘導(dǎo)III類磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-Kinase，PI3K)復(fù)合物(由Beclin1、ATG14、液泡蛋白分選蛋白[Vacuolar Sorting Protein，Vps)15、Vps34、III類PI3K等組成]完成[7]，III 類 PI3K將磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3-磷酸(Phosphatidylinositol 3-Phosphate，PI3P)，PI3P招募下游自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行膜的伸長(zhǎng)；隨后ATG5-ATG12-ATG16L1復(fù)合物以及ATG7和ATG3誘導(dǎo)微管相關(guān)蛋白輕鏈3(Microtubule-associated Protein Light Chain 3，LC3)由可溶解形式(LC3-I)轉(zhuǎn)變?yōu)橹苄问?LC3-II)，LC3-II與自噬泡的內(nèi)膜和外膜結(jié)合成自噬體。之后的融合與降解過(guò)程為自噬體在Ras相關(guān)GTP結(jié)合蛋白7(Ras-related In Brain 7， Rab7)、突觸結(jié)合蛋白17(Synaptotagmin-17，syt-17)、膜泡關(guān)聯(lián)膜蛋白8(Vesicle Associated Membrane Protein-8，VAMP8)和溶酶體相關(guān)膜蛋白2(Lysosomal Associated Membrane Protein 2, LAMP2)等的介導(dǎo)下，與溶酶體融合成自噬溶酶體，分泌溶酶體酸性水解酶，降解其內(nèi)容物并釋放到細(xì)胞質(zhì)中，完成自噬[8]。

1.2 腸黏膜屏障和自噬

腸黏膜屏障由黏液層、腸上皮細(xì)胞(Intestinal Epithelial Cells，IECs)以及黏膜下炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞層所構(gòu)成，其動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。黏液層包含多種蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類物質(zhì)，其作用是避免上皮細(xì)胞直接接觸腸道微生物。黏膜下層的炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，可通過(guò)胞吞、抗原呈遞、分泌細(xì)胞因子等方式觸發(fā)自我防御，抵抗病原體入侵。IECs是由位于腸道黏膜Lieberkühn隱窩的腸道干細(xì)胞(Intestinal Stem Cells，ISCs)逐步分化而來(lái)，包括吸收性腸細(xì)胞和各種類型的分泌細(xì)胞如Paneth細(xì)胞、杯狀細(xì)胞等。生理狀態(tài)下IECs增殖與凋亡趨于平衡，以維持腸黏膜屏障的完整性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，正常發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)吸收和分泌黏液及功能蛋白的作用。研究表明，自噬可調(diào)控IECs的發(fā)育，進(jìn)而調(diào)節(jié)其數(shù)量[9]。自噬在ISCs中呈區(qū)域限制性分布，一般在黏膜中含有增殖性的前體細(xì)胞或干細(xì)胞區(qū)域，且與ISCs存活相關(guān)。自噬缺陷的ISCs在衰老過(guò)程中更易發(fā)生DNA損傷、細(xì)胞周期阻滯和凋亡，使其數(shù)量顯著減少[10, 11]。

吸收性腸細(xì)胞具有運(yùn)輸水、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和離子、抵御病原體侵入和有毒物質(zhì)泄漏、調(diào)節(jié)共生微生物群豐度和免疫反應(yīng)等作用。腸細(xì)胞的自噬激活可有效抑制大腸桿菌、鼠傷寒沙門菌、糞腸球菌和福氏志賀菌等的復(fù)制、侵襲和播散；還可以通過(guò)靶向降解腸細(xì)胞間緊密連接(Tight Junction，TJ)的孔隙通道蛋白Claudin-2，使細(xì)胞旁通透降低，從而增強(qiáng)腸細(xì)胞間TJ屏障功能。但有研究發(fā)現(xiàn)腸細(xì)胞的自噬激活可能降低跨上皮細(xì)胞電阻，使細(xì)胞旁通透性增強(qiáng)，并破壞閉鎖小帶蛋白1(Zonula Occludens-1，ZO-1)和閉鎖蛋白(Occludin)，降低腸屏障功能[12]；還有研究報(bào)道鼠傷寒沙門菌可能利用自噬來(lái)促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)增殖[13]，反映出自噬在吸收性腸細(xì)胞的作用存在爭(zhēng)議，需進(jìn)一步深入驗(yàn)證。

具有分泌功能的Paneth細(xì)胞能夠儲(chǔ)存并分泌抗微生物肽(Antimicrobial Peptides，AMP)如溶菌酶、防御素、抗菌肽及隱蛋白等，用于生產(chǎn)抗菌材料，保護(hù)并增強(qiáng)ISCs功能。自噬是Paneth細(xì)胞發(fā)揮上述功能的重要調(diào)節(jié)因子，主要參與并調(diào)節(jié)Paneth細(xì)胞分泌顆粒的形成及功能。自噬受損可能導(dǎo)致AMP減少，引起腸道生態(tài)失調(diào)，自噬相關(guān)基因ATG16L1、ATG4B、ATG5、ATG7缺失會(huì)導(dǎo)致Paneth細(xì)胞相關(guān)功能的喪失[14]。Paneth細(xì)胞一系列分泌途徑中，分泌性自噬途徑可以抵御入侵細(xì)菌，因其在Paneth細(xì)胞分泌溶菌酶過(guò)程中起重要作用[15]。

杯狀細(xì)胞也是一種分泌細(xì)胞，可產(chǎn)生多種黏蛋白如Muc2、Muc5AC和Muc6等，這些黏蛋白經(jīng)過(guò)交聯(lián)形成腸黏膜屏障的黏膜層，具有防止Toll樣受體過(guò)度活化，抵御入侵微生物，保護(hù)IECs的作用[14]。已有研究表明了自噬調(diào)控杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白的作用機(jī)制與活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)有關(guān)， ROS可參與自噬蛋白 LC3 啟動(dòng)杯狀細(xì)胞黏蛋白顆粒的積聚和分泌，但當(dāng)自噬基因缺失(如ATG5、ATG7和LC3)時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ROS的增加可能減少黏蛋白的產(chǎn)生[16]。

1.3 自噬與腸道炎癥反應(yīng)

越來(lái)越多的研究表明，腸道菌群紊亂與腸道炎癥性疾病密切相關(guān)。自噬相關(guān)基因ATG16L1缺失會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)和腸道炎癥的發(fā)生[17], ATG16L1突變小鼠在感染鼠傷寒桿菌后不能通過(guò)Paneth細(xì)胞的分泌性自噬途徑分泌溶菌酶，也會(huì)導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)，這或許是克羅恩病的原因[18]；將ATG16L1 T316A(相當(dāng)于人體T300A)敲入小鼠的巨噬細(xì)胞中可使ATG16L1蛋白表達(dá)顯著減少、自噬功能減低和促炎細(xì)胞因子IL-1β表達(dá)增加，使其更易于發(fā)生腸道炎癥[7]。此外，免疫相關(guān)GTP酶M蛋白(Immunity-related GTPase Family M Protein，IRGM)、酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域(Nucleotide-Binding Oligomerization Domain 2，NOD2)和富含亮氨酸的重復(fù)激酶2(Leucine-rich Repeat Kinase-2，LRRK2)等自噬相關(guān)基因的功能障礙也能導(dǎo)致腸道炎癥[7]。IRGM 的多態(tài)性可致實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自噬功能失調(diào)，使腸道炎性反應(yīng)持續(xù)存在。NOD2被腸道細(xì)菌產(chǎn)物激活后，即招募ATG16L1至隔離膜上，形成自噬體。但當(dāng)自噬被抑制，NOD2的刺激將會(huì)引起促炎細(xì)胞因子反應(yīng)性增加。LRRK2與異源自噬(即自噬降解入侵微生物如細(xì)菌、病毒等的過(guò)程)和Paneth細(xì)胞的分泌性自噬相關(guān)，LRRK2 缺失可導(dǎo)致Paneth細(xì)胞的自噬功能受損，促使炎癥性腸病發(fā)生[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬與腸道炎癥之間的聯(lián)系機(jī)制主要與炎癥小體相關(guān)，自噬可以通過(guò)促進(jìn)ROS生成、下調(diào) IL-1β 前體而控制炎癥小體的表達(dá)[7]。當(dāng)自噬缺陷時(shí)，炎癥小體活化，產(chǎn)生較多的促炎細(xì)胞因子，引起腸道炎癥反應(yīng)[20]。此外，自噬也通過(guò)調(diào)節(jié)共生細(xì)菌的免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)黏液分泌和miRNA沉默通路等，阻止腸道炎癥反應(yīng)[21]。還有研究報(bào)道，腸上皮細(xì)胞的自噬缺陷可使腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)增加而引起腸細(xì)胞死亡，以及使腸道炎癥敏感性增加[22]。

2 腸缺血激活自噬有助于改善腸道損傷

2.1 腸缺血的病變特點(diǎn)

腸缺血引起血管功能障礙有四種類型：栓塞性動(dòng)脈閉塞(40%-50%)、血栓性動(dòng)脈閉塞(20%-35%)、非閉塞性形式(5%-15%)和靜脈腸系膜血栓形成(5%-15%)[23]。一般短時(shí)間和輕度缺血情況下，腸系膜血管可代償性收縮以滿足重要器官的血液灌注，而不會(huì)損害腸道系統(tǒng)。但當(dāng)機(jī)體長(zhǎng)時(shí)間或重度缺血時(shí)，這種血容量的重新分配則會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的腸道缺血，引起一定程度的腸道損傷。腸缺血性損傷首先從對(duì)低灌注和對(duì)缺氧高度敏感的黏膜絨毛開(kāi)始，表現(xiàn)為絨毛斷裂和出血。一旦腸黏膜屏障完整性破壞，可能迅速引起炎癥介質(zhì)的聚集和細(xì)菌內(nèi)毒素及其它微生物成分進(jìn)入血液，引發(fā)局部和全身炎癥反應(yīng)，甚至引起SIRS，加劇腸道灌注不足和損傷[24]。有效液體復(fù)蘇可以逆轉(zhuǎn)缺血狀態(tài)，避免腸組織的不可逆壞死，但液體再灌注可能造成ROS的產(chǎn)生，并超出局部組織的清除能力，使自由基擴(kuò)散到周圍區(qū)域，引發(fā)惡性炎癥循環(huán)。炎性細(xì)胞因子進(jìn)入體循環(huán)，還可能引起遠(yuǎn)端器官如肝和肺的炎癥損傷[25]。

2.2 腸缺血激活自噬及分子機(jī)制

近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注腸缺血性損傷與自噬之間的相互聯(lián)系。許多研究結(jié)果表明腸缺血損傷后，與自噬體形成密切相關(guān)的LC3-II/LC3-I比值升高，與自噬活性呈負(fù)相關(guān)的p62表達(dá)下調(diào)，電鏡檢查自噬體數(shù)目明顯增多[26-28]，都充分佐證了腸缺血損傷后自噬增強(qiáng)。自噬的激活因子是磷酸腺苷依賴的蛋白激酶(Adenosine 5'-Monophosphate-Activated Protein Kinase，AMPK)。在缺血的初始階段，腸上皮細(xì)胞的低ATP水平激活A(yù)MPK，然后經(jīng)過(guò)直接或間接的ULK1作用來(lái)調(diào)控自噬的發(fā)生。位于AMPK上游的兩個(gè)激酶，鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶2(Recombinant Calcium/Calmodulin Dependent Protein Kinase Kinase 2，CAMKK2)和腫瘤抑制因子肝激酶B1(Liver Kinase B1，LKB1)，主要負(fù)責(zé)調(diào)控AMPK亞單位的磷酸化；腸缺血性損傷過(guò)程中能量耗竭激活A(yù)MPK有賴于LKB1，細(xì)胞內(nèi)鈣超載激活A(yù)MPK依賴于CAMKK2[29]。有研究者觀察到芍藥苷可使腸缺血再灌注損傷大鼠p-LKB1與p-AMPK表達(dá)同步增加，而p-CAMKK2則無(wú)明顯變化[27]，揭示LKB1/AMPK可能是腸缺血自噬激活的重要信號(hào)通路。

2.3 自噬對(duì)腸道損傷的改善作用

研究表明自噬激活有助于減輕腸缺血性損傷。ATG4B對(duì)miR-665-3p抑制介導(dǎo)的腸保護(hù)起到關(guān)鍵作用，可能是自噬激活改善腸缺血性損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。miR-665-3p抑制可以刺激自噬活性，降低血液TNF-α和IL-6水平，抑制NOD樣受體家族3(Nucleotide Binding Oligomerization Domain-like Receptors，NLRP3)炎癥小體表達(dá)和IL-1β成熟，并阻礙Caspase-3的激活，減輕炎癥和凋亡，有助于改善腸缺血性損傷。芍藥苷預(yù)處理對(duì)大鼠腸缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制可能是通過(guò)增加腸道缺血損傷的自噬通量，減輕腸道炎癥、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的[27]。核因子E2相關(guān)因子(Nuclear Factor E2 Related Factors，Nrf2)改善腸缺血性損傷作用通過(guò)AKT/糖原合成酶激酶-3β(Gglycogensynthesis Kinase-3β，GSK-3β)信號(hào)通路激活自噬，減少氧化應(yīng)激，改善腸缺血性損傷[30]。自噬還可顯著抑制NLRP3炎癥小體活化[28]，改善腸缺血性損傷，降低放射性和燒傷性因素引起腸缺血時(shí)的ROS與自由基水平升高，減少氧化應(yīng)激，減輕腸道損傷[31]。

3 抑制過(guò)度自噬有利于減輕腸道損傷

研究顯示，腸缺血性損傷可能引起自噬的過(guò)度激活，而抑制過(guò)度自噬有助于減輕腸損傷[4, 32]。Li等[26]在一項(xiàng)腸缺血再灌注實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，缺血前給予自噬激活劑雷帕霉素大鼠腸損傷加重，而在腸缺血前給予自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)大鼠腸損傷明顯減輕，兩者腸損傷程度與其自噬水平變化呈正相關(guān)關(guān)系，亦即自噬過(guò)度加劇腸損傷，抑制過(guò)度自噬可以減輕腸損傷。El-Malkey等[5]也報(bào)道了相同結(jié)果，而且認(rèn)為這種過(guò)量的自噬表達(dá)可以用氧化應(yīng)激反應(yīng)來(lái)解釋，ROS誘導(dǎo)的Beclin-1和LC3增加可能是過(guò)度自噬的主要原因。Beclin 1和LC3是自噬的中心調(diào)節(jié)蛋白， Beclin-1過(guò)表達(dá)不僅提升LC3-II水平，促進(jìn)自噬體形成，而且抑制自噬體清除[33]。

過(guò)度自噬可能與一些觸發(fā)因素如ROS爆發(fā)、線粒體Ca2+超載、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等等有關(guān)[27]。這些因素可以通過(guò)激活Bcl-2腺病毒E1B 19kDa相關(guān)蛋白3(Bcl-2/Adenovirus E1B 19kDa Interacting Protein 3，BNIP3)，引起線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore，mPTP)開(kāi)放增加，促使自噬過(guò)度表達(dá)[34]。另外ROS 水平升高，不僅導(dǎo)致 Beclin-1過(guò)表達(dá)，增加自噬流量[35]，還使ATG4發(fā)生氧化，使其活性降低，促進(jìn)LC3脂質(zhì)化，從而增強(qiáng)自噬激活[36]。

自噬是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，在缺血性疾病中起有益還是有害作用取決于機(jī)體氧供的改變、損傷的程度以及不同器官對(duì)缺血的耐受性[37]。適度自噬有利于細(xì)胞在各種應(yīng)激條件下存活，而自噬過(guò)度或自噬不足可引發(fā)腸道炎癥、ROS積累等，導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷。而將自噬維持在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃剑瑢?duì)保護(hù)腸道生理功能和抵御各種病理侵害都具有積極意義。

4 小 結(jié)

自噬通過(guò)調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的功能和調(diào)控腸道細(xì)菌炎癥反應(yīng)，維持了腸粘膜屏障耐受性和防御性之間的平衡。腸缺血可能通過(guò)AMPK對(duì)ULK1的直接或間接作用激活自噬，自噬激活則能減輕炎癥反應(yīng)、降低氧化應(yīng)激水平，從而改善腸道損傷。腸缺血性損傷與再灌注會(huì)引發(fā)過(guò)度自噬而加劇腸損傷，抑制由ROS爆發(fā)誘導(dǎo)的Beclin-1和LC3過(guò)高表達(dá)可能逆轉(zhuǎn)其負(fù)效應(yīng)。因此，針對(duì)腸缺血性損傷時(shí)自噬表達(dá)水平及其多重作用，研究如何能夠維持適度自噬，避免過(guò)度與不足，將是今后工作的重點(diǎn)，也將對(duì)未來(lái)利用細(xì)胞自噬治療或預(yù)防腸缺血性損傷提供新理論和新方法。

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