陳 帥，王兆豐

（1.靜寧縣甘溝鎮(zhèn)市場(chǎng)監(jiān)督管理所，甘肅 靜寧 743400；2.靜寧縣食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，甘肅 靜寧 743400）

邊麻菇，又稱荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes）、鹿茸菇、泥窩、荷葉蘑，屬于傘菌目、口蘑科、離褶傘屬，是一種非常珍貴的藥食兩用食用真菌。因生長(zhǎng)在甘肅海拔2 600 m以上，無(wú)任何污染的野生環(huán)境中，有著很強(qiáng)的抗病性能及豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，是一種富含人體必需氨基酸、礦物質(zhì)、維生素和多糖等營(yíng)養(yǎng)成分的高蛋白、低脂肪健康食品。多糖作為重要活性成分之一，因其獨(dú)特的功能特性而受到越來(lái)越多的關(guān)注，如抗腫瘤[1]、抗氧化[2]、調(diào)節(jié)腸道微生物群[3]、抗糖尿病[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]、乳化[6]和降脂[7]作用等。

制備活性多糖的第一步是優(yōu)化提取工藝。據(jù)報(bào)道，提取工藝對(duì)多糖的產(chǎn)量、化學(xué)性質(zhì)、生物活性和應(yīng)用領(lǐng)域有重要影響[8]。傳統(tǒng)的熱水提取法（HEM）具有操作簡(jiǎn)單、不需要特殊設(shè)備的優(yōu)點(diǎn)，但其較高的提取溫度和較長(zhǎng)的提取時(shí)間可能對(duì)多糖的生物功能產(chǎn)生不利影響[9]。超聲輔助提取法（UEM）可以通過(guò)超聲空化效應(yīng)破壞細(xì)胞壁。而酶輔助提取法（EEM）通過(guò)酶解降解細(xì)胞壁，可以促進(jìn)多糖產(chǎn)量的提高[10]。超聲波酶輔助提取法作為一種新的提取技術(shù)，結(jié)合了UEM法和EEM法的優(yōu)點(diǎn)，已應(yīng)用于多糖的提取。

EEM法的反應(yīng)條件相對(duì)溫和，環(huán)保、高效、低能耗、易操作是EEM法的優(yōu)勢(shì)。通常情況下，酶解溫度、酶解時(shí)間、酸堿度、酶用量、液固比等因素都會(huì)影響胞外多糖的提取率。響應(yīng)面法是一種有效的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法，用于優(yōu)化變量的影響和變量之間的相互作用對(duì)響應(yīng)數(shù)據(jù)的影響，被廣泛應(yīng)用于獲得提取多糖的最佳條件[11]。本研究采用響應(yīng)面法中的Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為邊麻菇多糖應(yīng)用及開(kāi)發(fā)提供一定的參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

邊麻菇，購(gòu)自肅南市場(chǎng)。在50 ℃下干燥后，將干燥的子實(shí)體粉碎成粉末用于多糖提取。

果膠酶（酶活≥30 U/mg）、纖維素酶（酶活≥30 U/mg）、木瓜蛋白酶（酶活≥400 U/mg）、復(fù)合酶由果膠酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶按等比例（質(zhì)量比1∶1∶1）組成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶輔助法提取邊麻菇多糖

稱取一定量邊麻菇粉末按照一定比例加入去離子水，加入一定量復(fù)合酶，調(diào)節(jié)pH值，在溫度50 ℃酶解一定時(shí)間后，將提取物以5 982 r/min離心15 min，減壓濃縮上清液至原體積的1/4，加入無(wú)水乙醇沉淀濃縮后的上清液，使其終濃度為75%（體積分?jǐn)?shù)），4 ℃靜置12 h；隨后以5 982 r/min離心15 min獲得沉淀，先后用乙醚、無(wú)水乙醇和丙酮洗滌沉淀。由氯仿和正丁醇以4∶1（V/V）的比例組成Sevag試劑，除去沉淀中的蛋白質(zhì)，提取物通過(guò)分子量為1 400 Da透析袋進(jìn)行透析，冷凍干燥后得到邊麻菇粗多糖，用公式（1）計(jì)算多糖得率：

1.2.2 液固比、酶解時(shí)間、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值對(duì)多糖提取的單因素影響試驗(yàn)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)了4個(gè)多糖的提取變量（液固比、酶解時(shí)間、復(fù)合酶用量、pH值），比較其對(duì)多糖得率的影響。液固比（A，去離子水/子實(shí)體粉末，mL/g）設(shè)置15、20、25、30、35這5個(gè)處理；酶解時(shí)間（B）設(shè)置30、60、90、120、150 min這5個(gè)處理；復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C，復(fù)合酶與子實(shí)體粉末混合物的質(zhì)量比）設(shè)置5個(gè)處理，分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%；pH值（D）設(shè)置3、4、5、6、7這5個(gè)處理。第1試驗(yàn)為液固比試驗(yàn)，在15～35范圍內(nèi)的單因素進(jìn)行，其他3個(gè)參數(shù)，包括酶解時(shí)間、pH值和復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)，分別設(shè)定為120 min、6和1.0%。此后，酶解時(shí)間、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值等3個(gè)單因素試驗(yàn)均按照后一個(gè)單因素試驗(yàn)根據(jù)前一個(gè)單因素試驗(yàn)的最佳結(jié)果進(jìn)行的原則。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)（BBD）

在進(jìn)行單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)后，采用Design-expert軟件（8.0.6）進(jìn)行四變量BBD試驗(yàn)。每個(gè)變量包含3個(gè)梯度（－1，0，1），以多糖得率作為響應(yīng)值，總共29次試運(yùn)行，構(gòu)成了整個(gè)設(shè)計(jì)表1。

根據(jù)BBD試驗(yàn)的變量值和相應(yīng)的邊麻菇多糖提取得率，得出4個(gè)提取變量和提取得率之間的關(guān)系，以二次多項(xiàng)式方程（2）表示如下：

其中，Y是多糖得率預(yù)測(cè)值，β0是常數(shù)，βi是線性系數(shù)，βii是二次系數(shù)，βij是交互項(xiàng)系數(shù)，Xi和Xj代表4個(gè)自變量。

依據(jù)回歸方程繪制等高線圖，將多糖得率以等高線圖的形式進(jìn)行描述。每個(gè)等高線圖中，2個(gè)變量在測(cè)試范圍內(nèi)，而其他變量固定在0水平。

對(duì)回歸模型驗(yàn)證優(yōu)化：根據(jù)回歸方程計(jì)算出的理論最佳數(shù)據(jù)（液固比、酶解時(shí)間、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值），進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際獲得的多糖平均得率與模型預(yù)測(cè)多糖得率進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證回歸方程的準(zhǔn)確性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 17.0對(duì)單因素方差分析進(jìn)行比較。通過(guò)Duncan多范圍試驗(yàn)進(jìn)行平均值的多重比較，這些值顯示為平均標(biāo)準(zhǔn)偏差。用曲線估計(jì)法評(píng)價(jià)多糖水平對(duì)抗氧化作用的影響。P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有測(cè)定均測(cè)量3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 不同液固比對(duì)邊麻菇多糖提取效果的影響

液固比對(duì)邊麻菇多糖得率的影響如圖1A所示。邊麻菇多糖得率隨液固比變化呈先升高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)液固比為20時(shí)，邊麻菇多糖得率達(dá)到最大值（8.49%）；這種現(xiàn)象的可能原因是，當(dāng)液固比相對(duì)較低時(shí)，邊麻菇粉末傾向于聚集在一起，水分子難以進(jìn)入植物組織，導(dǎo)致多糖得率偏低[12]。隨著液固比的增加，提取液的黏度降低，水中溶解的多糖分子增加，導(dǎo)致多糖得率顯著增加，但當(dāng)液固比高于20時(shí)，邊麻菇多糖下降；這一結(jié)果可能是因?yàn)楫?dāng)提取溶劑的量過(guò)大時(shí)，植物組織中的多糖的擴(kuò)散距離增加，這可能抑制了多糖的溶解[13]；因此，最佳液固比選擇為20。

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)邊麻菇多糖提取效果的影響

酶解時(shí)間對(duì)邊麻菇多糖得率的影響如圖1B所示。隨著酶解時(shí)間從30 min增加到60 min，邊麻菇多糖得率顯著增加。酶解時(shí)間為60 min時(shí)，多糖得率最高，為9.89%。酶解時(shí)間為90 min時(shí)，多糖得率略有下降。隨著酶解時(shí)間進(jìn)一步增加，到120、150 min時(shí)，多糖得率顯著下降，這意味著過(guò)長(zhǎng)的酶解時(shí)間可能導(dǎo)致多糖降解[14]；因此，確定60 min的酶解時(shí)間作為響應(yīng)面優(yōu)化中心點(diǎn)。

2.1.3 復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)邊麻菇多糖提取效果的影響

圖1C顯示了復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)邊麻菇多糖提取效果的影響。隨著酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，多糖得率呈現(xiàn)先顯著提高，隨后略有下降，當(dāng)復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%時(shí)，多糖得率最大，為10.18%。這可能是因?yàn)殡S著酶復(fù)合物劑量的增加，酶接觸底物的機(jī)會(huì)增加，這有利于多糖的溶解，導(dǎo)致多糖產(chǎn)量的提高[15]；然而，當(dāng)酶的質(zhì)量分?jǐn)?shù)足以與底物反應(yīng)時(shí)，進(jìn)一步增加酶的用量不會(huì)提高多糖的產(chǎn)量；因此，選擇1.5%的酶復(fù)合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)用于隨后的BBD試驗(yàn)。

2.1.4 pH值對(duì)邊麻菇多糖提取效果的影響

pH值對(duì)邊麻菇多糖提取效果如圖1D所示，當(dāng)pH值從3增加到5時(shí)，邊麻菇多糖的得率從9.15%顯著增加到10.48%，當(dāng)pH值增加到6和7時(shí)，邊麻菇多糖得率顯著降低。原因可能是：酶的空間結(jié)構(gòu)在不同的pH值下發(fā)生了變化，從而改變了酶的構(gòu)象和活性[16-17]；因此，最適pH值為5。

圖1 液固比（A）、酶解時(shí)間（B）、復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)（C）和pH值（D）對(duì)多糖提取效果的影響

2.2 邊麻菇多糖提取的BBD試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 邊麻菇多糖提取得率的預(yù)測(cè)模型和方差分析

表1顯示了BBD試驗(yàn)的變量值和相應(yīng)的邊麻菇多糖提取得率。4個(gè)提取變量（A、B、C和D）和提取得率（Y）之間的關(guān)系以二次多項(xiàng)式方程（3）表示如下：

表1 邊麻菇多糖提取的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值

BBD試驗(yàn)的方差分析結(jié)果如表2所示。失擬項(xiàng)P值（0.053 5）＞0.05，表明回歸模型具有良好的可靠性。模型的P值＜0.05，表明得到的回歸模型是顯著的。測(cè)定系數(shù)（R2）為0.872 6。此外，調(diào)整后的決定系數(shù)（adjR2）為0.745 3。高R2值和adjR2值表明4個(gè)變量之間的高度相關(guān)性，在BBD試驗(yàn)中獲得了邊麻菇多糖優(yōu)化條件。變異系數(shù)（C.V.，3.95%）較低，表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值一致。如表2所示，交叉積系數(shù)（BD）、線性系數(shù)（A、C）和所有二次系數(shù)（A2、B2、C2和D2）達(dá)到顯著水平；取變量的F值，其對(duì)多糖得率的影響順序?yàn)椋簭?fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞液固比＞pH值＞酶解時(shí)間。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)的單向方差分析

2.2.2 預(yù)測(cè)模型的等高線圖

等高線圖是回歸方程的圖形顯示模式。如圖2所示，從等高線圖中看出，只有固液比和復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間和復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)這2個(gè)指標(biāo)是圓形的，其他都為橢圓形的，說(shuō)明二者之間相互作用較強(qiáng)。

圖2 邊麻菇多糖得率的等高線圖

2.2.3 回歸模型優(yōu)化

根據(jù)預(yù)測(cè)回歸方程計(jì)算得到的多糖提取的提取參數(shù)如下：液固比20.94，酶解時(shí)間61.63 min，pH值5.11，復(fù)合酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.65%，多糖理論得率為10.83%。為便于實(shí)際操作，提取參數(shù)設(shè)定為：液固比21，酶解時(shí)間62 min，pH值5，酶復(fù)合劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.65%，3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)多糖平均得率為（10.96±0.12）%，與模型預(yù)測(cè)多糖得率一致；因此，回歸模型可適用于邊麻菇多糖的酶法提取。

3 結(jié)論與討論

本研究采用酶輔助提取法制備邊麻菇多糖。通過(guò)響應(yīng)面法設(shè)計(jì)，當(dāng)液固比21，酶解時(shí)間62 min，pH值5，酶復(fù)合劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.65%，3次重復(fù)試驗(yàn)平均多糖得率為（10.96±0.12）%；因此，這種優(yōu)化提取方法可以在生物活性物質(zhì)提取研究中進(jìn)一步推廣。

此法優(yōu)于傳統(tǒng)熱水浸提法，主要由于在復(fù)合酶作用下，細(xì)胞壁被破壞，更多的糖溶于水提液中，但2種方法制備多糖抗氧化是否有差異，有待后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步研究。