張婷婷++馬磊

摘要：為了尋求最佳的多糖提取工藝，分別采用水提法、堿提取法、復(fù)合酶提取法3種方法對影響金頂側(cè)耳（Pleurotus citrinopileatus Sing.）菌菇多糖提取的4個因素（溫度、時(shí)間、液固比和乙醇用量）進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，復(fù)合酶提取法的多糖提取率最高，并且耗時(shí)耗能最少，堿提取法的多糖提取率其次，水提法的提取率最低，并且耗時(shí)耗能最多。從工業(yè)成本上考慮，堿提取法投入生產(chǎn)的可行性更高。

關(guān)鍵詞：金頂側(cè)耳（Pleurotus citrinopileatus Sing.）；多糖；提取工藝

中圖分類號：S646；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）01-0119-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.030

Comparison of the Methods of Polysaccharide Extraction

from Pleurotus citrinopileatus Sing.

ZHANG Ting-ting，MA Lei

（College of Life Sciences，Shihezi University，Shihezi 832000，Xingjiang，China）

Abstract：To optimize polysaccharide extraction technology， the influence of temperature， time， the ratio liquid to solid and the volume of ethanol on the Pleurotus citrinopileatus Sing. polysaccharide extraction were researched through comparing the methods of the water extraction， the alkali extraction and the enzymatic extraction. The compound enzyme extraction attained the highest rate of the extraction， which cost the least time and energy. The alkali extraction attained the second higher rate and the water extraction attain the lowest one. According to the industrial cost， the alkali extraction was preferable to the polysaccharide extraction.

Key words：Pleurotus citrinopileatus Sing.；polysaccharide；extraction technology

食用菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體或發(fā)酵液中分離出的由10個以上的單糖以糖苷鍵連接而成的高分子多聚物，具有抗腫瘤、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凝血等作用[1-3]。隨著生物高分子技術(shù)在多糖研究領(lǐng)域的應(yīng)用，多糖類化合物已成為分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、食品科學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。但是食用菌細(xì)胞或組織外大多有脂質(zhì)包圍，所以不容易直接獲得，常需要通過一些物理或化學(xué)的方法破壞脂質(zhì)或細(xì)胞壁，進(jìn)行提取和純化[4-7]。顯然，如何有效地從原材料中提取粗多糖，是進(jìn)行真菌多糖研究的關(guān)鍵。本試驗(yàn)以金頂側(cè)耳（Pleurotus citrinopileatus Sing.）菌菇為試驗(yàn)材料，采用水提法、堿提取法和復(fù)合酶提取法提取菌菇多糖，并進(jìn)行比較分析，為食用菌多糖提取工藝的發(fā)展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金頂側(cè)耳菌菇、葡萄糖（105 ℃干燥至恒重）、重蒸酚、植物精提復(fù)合酶（主要成分為纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶等）上海生物工程有限公司；氫氧化鈉、95%乙醇、濃硫酸均為國產(chǎn)分析純，試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 試驗(yàn)儀器

多功能粉碎機(jī)、XW-80A型漩渦混合器（江蘇海門市其林貝爾儀器公司）、DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備公司）、減壓抽濾器、Spectrumlab54型紫外分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）、GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭儀器公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 苯酚-硫酸法 苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，然后與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測定。

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL，各以去離子水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻冷卻，室溫放置20 min以后于490 nm測定吸光度，以2.0 mL去離子水按同樣顯色操作為空白，以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標(biāo)（x），490 nm波長下吸光度為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 水提法 稱取金頂側(cè)耳菌菇干粉2 g，分別加入不同體積的去離子水浸提。樣品置于一定溫度、時(shí)間下水浴，進(jìn)行減壓抽濾，保留濾液，濾渣備用。將濾液定容至100 mL，吸取該濾液2 mL，加入相應(yīng)體積倍數(shù)95%乙醇，混勻，放置4 ℃冰箱醇沉24 h。20 ℃下6 000 r/min離心10 min，棄上清液，用95%乙醇洗滌沉淀3次，加入去離子水定容至10 mL，用漩渦混合器使沉淀充分溶解于去離子水后，吸取該溶液0.5 mL，進(jìn)行含糖量測定。

1.3.3 堿提取法 稱取金頂側(cè)耳菌菇干粉2 g，分別加入不同體積的堿液中（pH=9）浸提。樣品后期處理同“1.3.2”。

1.3.4 復(fù)合酶提取法 配制1%的復(fù)合酶液500 mL，將其置于35 ℃條件下活化10 min，稱取金頂側(cè)耳干粉2 g，分別加入不同體積的復(fù)合酶液浸提。樣品后期處理同“1.3.2”。

樣品多糖得率=■×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

通過苯酚-硫酸法繪制得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。計(jì)算得出測定金頂側(cè)耳菌菇多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=0.152x-0.007，R2=0.994。

2.2 水提法對金頂側(cè)耳菌菇多糖得率的影響

水提法試驗(yàn)中，金頂側(cè)耳菌菇多糖得率隨著溫度的升高而升高（圖2-a）。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，多糖得率僅為2.71%；溫度為90 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最高值4.86%；溫度上升至100 ℃時(shí)，多糖得率降低至4.67%，這可能是由于過高的溫度導(dǎo)致了大分子的多糖鍵斷裂，造成多糖的損失。因此，90 ℃是較為理想的水提溫度。水提時(shí)間為1.5～2.0 h時(shí)，金頂側(cè)耳菌菇多糖得率由4.12%上升至4.45%；水提時(shí)間為2.5～3.0 h時(shí)，多糖得率由4.71%上升至4.82%（圖2-b）。因此，較優(yōu)的水提時(shí)間為3.0 h。

從圖2-c中可以看出，當(dāng)液固比（mL∶g，下同）為10∶1和20∶1時(shí)，金頂側(cè)耳菌菇多糖得率僅為1.53%和2.23%；當(dāng)液固比為30∶1時(shí)，多糖得率大幅升高至4.78%；當(dāng)液固比為40∶1時(shí)，多糖得率達(dá)到最大值4.87%，液固比為50∶1時(shí)，多糖得率為4.85%。同時(shí)，液固比為30∶1、40∶1、50∶1與10∶1、20∶1相比多糖得率差異極顯著，且前三者之間無顯著差異。因此，40∶1為較佳的液固比。

隨著乙醇用量的增大，金頂側(cè)耳菌菇多糖得率逐漸升高（圖2-d），當(dāng)乙醇用量為3倍時(shí)，多糖得率達(dá)到最高4.81%。但當(dāng)乙醇體積為5倍時(shí)，多糖得率卻降低至4.22%。乙醇用量為3、4、5倍與1、2倍相比多糖得率差異極顯著?？紤]到生產(chǎn)成本，3倍乙醇用量較為理想。

2.3 堿提取法對金頂側(cè)耳菌菇多糖得率的影響

采用堿提取法測定金頂側(cè)耳菌菇多糖，多糖得率隨著溫度的升高而升高（圖3-a）。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，多糖得率僅為3.66%；隨著溫度上升至90 ℃時(shí)，多糖得率達(dá)到最高值5.84%；當(dāng)溫度上升至100 ℃時(shí)，多糖得率降低至5.58%，這可能是由于過高的溫度導(dǎo)致了大分子的多糖鍵斷裂，造成多糖的損失。因此，90 ℃是較為理想的堿提取溫度。

在堿提取時(shí)間為1.5～2.0 h時(shí)，金頂側(cè)耳菌菇多糖提取率由5.13%上升至5.68%；在2.0～3.5 h時(shí)，多糖得率由5.68%上升至5.76%，變化較?。▓D3-b）。綜合多糖得率、耗能和耗時(shí)等方面，較優(yōu)的堿提取時(shí)間為2.0 h。

液固比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1與10∶1相比金頂側(cè)耳菌菇多糖得率差異極顯著，前四者之間無顯著差異（圖3-c）。從節(jié)約生產(chǎn)成本的角度考慮，20∶1為較佳的液固比。

隨著乙醇用量的增大，金頂側(cè)耳菌菇多糖得率逐漸升高，雖然乙醇用量為4倍時(shí)，多糖得率最高達(dá)到5.78%，但與2倍時(shí)的多糖得率5.62%無顯著差異；當(dāng)乙醇用量為5倍時(shí)，多糖得率降低至4.83%（圖3-d），這可能是由于過大體積倍數(shù)的乙醇導(dǎo)致了多糖再次溶解。考慮生產(chǎn)成本，選擇2倍乙醇用量較為理想。

2.4 復(fù)合酶提取法對金頂側(cè)耳菌菇多糖得率的影響

由于酶的特性，酶解法可以在較低的溫度下提取多糖。從圖4-a可以看出，在50 ℃時(shí)，金頂側(cè)耳菌菇多糖得率就達(dá)到最高6.82%。隨著溫度的升高，多糖提取率反而降低，這可能是由于高溫使酶活性喪失，所以50 ℃是較為理想的復(fù)合酶提取溫度。

由于酶作用的專一性和高效性，使得提取時(shí)間大大縮短。由圖4-b可知，提取1.0 h后，多糖得率由0.5 h時(shí)的6.46%提高到6.68%；1.5 h后，多糖得率達(dá)到最高6.73%，僅比提取1.0 h增加0.27個百分點(diǎn)。各組浸提時(shí)間多糖得率均無顯著差異。因而，綜合多糖得率、耗能和耗時(shí)等方面，較優(yōu)的復(fù)合酶提取時(shí)間為1.0 h。

液固比20∶1、30∶1、40∶1、50∶1與10∶1相比，金頂側(cè)耳菌菇多糖得率差異極顯著，但前四者之間無顯著差異，從節(jié)約生產(chǎn)成本的角度考慮，20∶1為較佳的液固比。

隨著乙醇用量的增加，金頂側(cè)耳菌菇多糖得率逐漸升高，當(dāng)乙醇用量為2倍時(shí)，多糖得率達(dá)到最高值5.61%；當(dāng)乙醇用量為5倍時(shí)，多糖得率降低至4.76%（圖4-d），這可能是由于過多的乙醇導(dǎo)致多糖再次溶解?？紤]生產(chǎn)成本，2倍乙醇用量較為理想。

3 討論

水提法是多糖提取中最早采用的傳統(tǒng)方法，金頂側(cè)耳菌菇多糖能夠溶解于水，熱水浸提時(shí)，金頂側(cè)耳菌菇組織細(xì)胞膨脹破裂，多糖成分浸出[8]。雖然水提法具有成本低、方法溫和、對多糖活性破壞小、操作簡便和試驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是水提法提取率較低、耗時(shí)較長、耗能較高。

堿提取法是在傳統(tǒng)多糖提取方法上的改良[9]。同水提法相比堿提取法能夠有效提高多糖得率，縮短提取時(shí)間，但是堿性過強(qiáng)，容易影響多糖的結(jié)構(gòu)。堿提取法浸提條件劇烈，隨著提取溫度的升高，多糖得率會增高，只有嚴(yán)格控制堿的用量，保持在稀堿的條件下，浸提液中的糖不發(fā)生分解和碳骨架斷裂，才能有效地提取多糖并且保證多糖的質(zhì)量。

復(fù)合酶提取法不僅能夠克服傳統(tǒng)方法低提取率的問題，還可以改變原有天然成分的結(jié)構(gòu)，增加提取物的生理活性。酶具有高效性、專一性、多樣性、溫和性等特性，可以在溫和的條件下對有效成分進(jìn)行高選擇性轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)中所采用的植物復(fù)合酶主要由纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶等組成。纖維素酶能降解細(xì)胞壁，從而加速多糖的浸出[10]；果膠酶能水解果膠促進(jìn)多糖溶出到浸提液中；蛋白酶可降解蛋白質(zhì)，降低與原料的結(jié)合力，有利于多糖的浸出。但是該方法也存在著一定的局限性，酶法提取對試驗(yàn)條件要求較高，酶易失活，不易保存，并且價(jià)格昂貴。

通過水提法、堿提取法和復(fù)合酶提取法3種多糖提取方案的比較可以看出，在多糖提取效率上，復(fù)合酶提取法的多糖提取率最高，并且耗時(shí)耗能最少，堿提取法的多糖提取率其次，水提法的提取率最低，并且耗時(shí)耗能最多。雖然，復(fù)合酶提取法效率最高，但是試驗(yàn)成本最高，所要求的試驗(yàn)條件也最為嚴(yán)格。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中，酶提取法技術(shù)需進(jìn)一步深入研究，能否將其用于工業(yè)化的多糖提取中，還需綜合考慮成本、提取率和生產(chǎn)條件等因素。水提法雖然成本低廉，方法簡單，但是耗能較大，提取率低，因此也不適用于工業(yè)生產(chǎn)中。堿提取法成本不高，投入生產(chǎn)的可行性高，只需要嚴(yán)格控制試驗(yàn)中用堿量，便能達(dá)到高提取率、低耗能耗時(shí)的效果，所以可以通過更進(jìn)一步的試驗(yàn)和分析，確定采用堿提取法提取金頂側(cè)耳菌菇多糖工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)，從而確定最優(yōu)試驗(yàn)方案用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

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