李峰 陳雯雯 鄧江麗 毛清黎 權(quán)文利 毛雅慧

（1. 湖北工程學(xué)院 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室/生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，孝感 432000；2. 武漢生物工程學(xué)院食品科技學(xué)院， 武漢 430415）

植物能產(chǎn)生多種具有抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，植物源殺菌劑正是利用植物體內(nèi)的這些抗菌活性物質(zhì)或通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)素，從而起到殺死或有效抑制某些病原微生物生長的作用。由于植物源抑菌劑具有來源廣泛，靶標(biāo)性強，作用廣譜，無毒易降解等優(yōu)點，成為開發(fā)新型農(nóng)藥的首選［1］。中藥虎杖具有利濕退黃，清熱解毒，散瘀止痛，止咳化痰功效，主用于治療跌打損傷，肺熱咳嗽［2-3］，白藜蘆醇為其主要活性成分之一。

白藜蘆醇化學(xué)名稱為3，5，4’-三羥基-1，2-二苯乙烯（化學(xué)式為C14H12O3），是一種非黃酮類多酚化合物，也是一種“植物抗毒素”［4］。大量動物實驗均表明，白藜蘆醇有抗氧化［5］、抗炎癥、抗癌［6］、抗糖尿病［7］及心血管保護［8-9］等多種藥理作用［10］，在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域收到廣泛關(guān)注。作為一種“植物抗毒素”，科研工作者也逐漸對其抗菌活性產(chǎn)生了興趣，吳翠霞等［11］研究表明白藜蘆醇及其衍生物對6種植物病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)具有一定抑制作用；李永軍等［12］通過體外抗菌實驗，證明了白藜蘆醇對Methicillin-sensitive Staphylococcus aureus（MSSA）、Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）和Coagulase Negative Staphylococci（CONS）等葡萄球菌具有較強的抗菌效果；另外，白藜蘆醇對綠膿桿菌、福氏痢疾桿菌、肺炎雙球菌和雷極普羅維登斯菌等均有良好的抗菌作用［13］。從收集的相關(guān)文獻看，目前白藜蘆醇在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究甚少，盡管已證實白藜蘆醇能夠抑制葡萄上的灰霉菌和根霉菌的生長，從而有利于抑制水果儲藏過程中微生物的滋生［14］，但目前暫未明確其對植物病原菌的抑菌譜及相應(yīng)的抑菌機制，且其能否開發(fā)成為新型植物源殺菌劑，仍然需要更多研究佐證。

核桃細(xì)菌性黑斑病，是世界性核桃病害，嚴(yán)重影響了核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)［15］。目前，國內(nèi)外防治核桃細(xì)菌性黑斑病主要是使用以波爾多液為主的保護性銅制劑［16］，配合用甲基托布津、代森錳鋅、農(nóng)用鏈霉素、青霉素鉀鹽等藥劑進行綜合防治［17］，化學(xué)農(nóng)藥的使用將導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、食品安全及生態(tài)平衡破壞等問題。本文以引起核桃細(xì)菌性黑斑病的主要病原物Xanthomonas arboricola pv. juglandis DW3F3（Xaj DW3F3）為供試菌株，測定了白藜蘆醇對該細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）以及最低殺菌濃度（MBC），并在亞抑菌濃度下，通過生物化學(xué)方法對病原細(xì)菌的群體運動性、胞外酶分泌能力、胞外多糖分泌能力及生物被膜形成能力進行了檢測，旨在為核桃細(xì)菌性黑斑病天然殺菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)，同時也豐富白藜蘆醇的抑菌譜，為其在農(nóng)林作物病害防治上的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 樹生黃單胞核桃致病變種Xanthomonas arboricola pv. juglandis DW3F3（Xaj DW3F3），為從丹江口核桃園內(nèi)采集的病變核桃果上分離出的病原物，保藏于湖北工程學(xué)院特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 （1）YPG培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，pH 7.0；（2）YPGA培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨5.0，酵母粉5.0，葡萄糖10.0，瓊脂15.0，pH 7.0；（2）胞外蛋白酶檢測培養(yǎng)基：YPGA中含1%（W/V）的脫脂奶粉；（3）胞外淀粉酶檢測培養(yǎng)基：YPGA中含0.1%（W/V）的可溶性淀粉；（4）胞外纖維素酶檢測培養(yǎng)基：YPGA中含有0.5%（W/V）的羧甲基纖維素（CMC）；（5）運動性檢測培養(yǎng)基（swarming平板）：YPG中含0.5%瓊脂糖。

1.1.3 主要試劑和儀器 白藜蘆醇（虎杖提取物），純度≥98%，由國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心惠贈；頭孢氨芐（Cef），工作濃度為30 μg/mL，購于上海生工生物工程有限公司；剛果紅、結(jié)晶紫購于上海生工生物公司；其他化學(xué)試劑均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司（上海）。主要儀器如下：超凈工作臺SW-CJ-2G（蘇州凈化設(shè)備有限公司），恒溫培養(yǎng)箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），立式壓力蒸汽滅菌鍋LDZX-75KBS（上海申安醫(yī)療器械廠），雙光束紫外-可見分光光度計UV-6100S（上海美譜達），恒溫震蕩式搖床ZQTY-50NS （上海知楚）。

1.2 方法

1.2.1 白藜蘆醇抑菌活性的初步鑒定 利用K-B濾紙片法檢測白藜蘆醇對Xaj DW3F3的抑菌效果。將白藜蘆醇溶解于二甲基亞砜（DMSO）中，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，配制成濃度為30 mg/mL的母液備用。準(zhǔn)備好Xaj菌懸液，用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布于YPG固體平板上，將已滅菌并干燥好的直徑為5 mm圓形濾紙片放置于涂布有菌液的培養(yǎng)基表面，每皿3片，再將配制好的白藜蘆醇母液滴加于濾紙片上，同時以溶劑DMSO作陰性對照，將平板晾干后置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d，觀察結(jié)果并記錄，實驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.2 最低抑菌濃度 （MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的確定 接種Xaj于YPG液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至平臺期，再取10 μL菌液接種至新鮮的YPG液體培養(yǎng)基中，并加入不同濃度的白藜蘆醇溶液，使其終濃度分別為：5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 μg/mL，DMSO作為陰性對照，28℃震蕩培養(yǎng)2 d后，分別測定600 nm處吸光值，MIC即為白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj生長的最低濃度值；選擇大于MIC濃度的各管菌懸液，分別取20 μL涂布于YPG固體平板上，28℃培養(yǎng)2 d，培養(yǎng)基上無細(xì)菌生長的最低濃度為其MBC，每個濃度設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.3 生物膜形成能力檢測 用結(jié)晶紫染色法檢測白藜蘆醇對Xaj生物膜形成的影響。接種Xaj于5 mL YPG液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體，用1 mL YPG培養(yǎng)基重懸菌體，接種至裝有4 mL YPG培養(yǎng)基的玻璃指形管中，并加入終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇，DMSO作為陰性對照，置于28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d后，倒掉培養(yǎng)液，無菌水洗管壁3次，烘干加入6 mL 1%的結(jié)晶紫染色30 min。倒掉染色液，用無菌水沖洗管壁，烘干指形管，觀察管壁上是否有一圈紫色物質(zhì)，拍照記錄；用1 mL無水乙醇溶解管壁結(jié)晶紫，測定630 nm處吸收值并記錄，實驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.4 胞外多糖形成能力檢測 利用液體搖瓶發(fā)酵法測定Xaj在終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇作用下產(chǎn)生EPS的量。接種Xaj于YPG液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至平臺期，再按1%-2%的量轉(zhuǎn)接至50 mL新鮮YPG液體培養(yǎng)基中，并加入終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇，DMSO作為陰性對照，28℃震蕩培養(yǎng)5 d后，向培養(yǎng)液中注入4倍體積的無水乙醇，邊注入邊攪拌，然后挑出絮狀沉淀物，置于55℃烘箱中烘干，稱重，記錄，并計算培養(yǎng)物形成EPS的量（g/L），實驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.5 胞外酶分泌能力的檢測 本研究采用平板檢測法分別檢測了白藜蘆醇對Xaj分泌胞外蛋白酶、胞外淀粉酶及胞外纖維素酶能力的影響。

1.2.5.1 胞外蛋白酶 接種Xaj于YPG液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至平臺期，用移液器分別吸取2 μL菌液接種于含1%的脫脂牛奶和終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇的YPG平板上，DMSO作為陰性對照，靜止10 min。28℃培養(yǎng)2 d，通過比較菌落周圍水解透明圈的有無或大小判斷菌株產(chǎn)胞外蛋白酶的活性。

1.2.5.2 胞外淀粉酶 接種Xaj于YPG液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至平臺期，用移液器吸取2 μL菌液接種于含0.1%可溶性淀粉和終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇的YPG平板上，DMSO作為陰性對照，靜止10 min。28℃培養(yǎng)2 d后，用1∶100的I∶KI（0.08 mol/L I2，3.2 mol/L KI）溶液染色10 min，然后用70%的酒精洗平板，能產(chǎn)生胞外淀粉酶的菌株，其菌落生長處及周圍可形成無色透明圈，觀察并測量透明圈的大小。

1.2.5.3 胞外纖維素酶 接種Xaj于YPG液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至平臺期，用移液器吸取2 μL菌液接種于含有0.5%（W/V）的羧甲基纖維素（CMC）和終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇的YPG平板上，DMSO作為陰性對照，靜置10 min。28℃培養(yǎng)2 d后，在平板上加入約20 mL 0.1%的剛果紅（Congo Red）染色30 min，水洗兩次，再用20 mL 1 mol/L的NaCl脫色兩次，每次約20 min，能產(chǎn)生纖維素酶的菌株，其菌落生長處及周圍形成一透明圈，觀察并測量透明圈的大小。

實驗分別設(shè)置3個重復(fù)，計算透明圈直徑的平均值。測得的透明圈的直徑大小代表不同胞外酶活性或產(chǎn)量的高低，由此來比較菌株在不同環(huán)境下所產(chǎn)胞外酶的差異。

1.2.6 運動性檢測 接種Xaj于YPG液體培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)至平臺期，用移液器吸取2 μL菌液點接于含有0.5%瓊脂糖和和終濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇的半固體培養(yǎng)基平板上（平板使用前在超凈臺晾5-10 min），DMSO作為陰性對照，正置于超凈臺中待晾干，再置于28℃正置培養(yǎng)2 d，觀察菌苔的擴散情況并測量菌苔直徑，進行統(tǒng)計分析，實驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法 采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，并采用t檢驗進行顯著性分析。P < 0.05，有統(tǒng)計學(xué)差異（*）；P < 0.01，差異顯著（**）；P < 0.001，差異極顯著（***）；P ＞ 0.05差異不顯著（NS）。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對Xaj抑菌活性分析

采用K-B濾紙片擴散法測定白藜蘆醇對Xaj的抑菌活性，結(jié)果如圖1-A所示，在滴加有白藜蘆醇的濾紙片周圍形成了明顯透明圈，而滴加有DMSO的對照組濾紙片周圍無透明圈，說明白藜蘆醇能有效抑制Xaj的生長。隨后采用濃度梯度稀釋法測定白藜蘆醇對Xaj的最低抑菌濃度（MIC）及最低殺菌濃度（MBC），由圖1-B可見，白藜蘆醇的濃度在20 μg/mL時能夠顯著抑制Xaj的生長（P < 0.01），因此，白藜蘆醇對Xaj的最低抑菌濃度（MIC）為20 μg/mL；隨著白藜蘆醇濃度的升高，抑制活性越強，當(dāng)白藜蘆醇濃度達到45 μg/mL時，基本能夠完全抑制Xaj的生長，即最低殺菌濃度（MBC）為45 μg/mL；在亞抑菌濃度（5 μg/mL、10 μg/mL和15 μg/mL）下，白藜蘆醇均不能顯著抑制Xaj的生長（P ＞ 0.05）。

圖1 白藜蘆醇對Xaj的抑菌活性檢測Fig. 1 Detection of the antibacterial activity of resveratrol against Xaj

2.2 白藜蘆醇對Xaj生物被膜形成的影響

本研究采用結(jié)晶紫法分析白藜蘆醇在亞抑菌濃度下對Xaj生物被膜（bacterial Biofilm，BF）形成能力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在添加15 μg/mL白藜蘆醇的情況下，Xaj在指形管壁上形成的紫色圈明顯少于陰性對照組（圖2-A）；再用無水乙醇溶解管壁結(jié)晶紫，比較實驗組與對照組生物被膜的形成量，發(fā)現(xiàn)添加15 μg/mL白藜蘆醇情況下形成生物被膜量僅為對照組的40%左右（圖2-B），表明在15 μg/mL的亞抑菌濃度下，白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj生物被膜的形成。

圖2 白藜蘆醇對Xaj生物被膜形成的影響Fig. 2 Effect of resveratrol on Xaj biofilm formation

2.3 白藜蘆醇對Xaj產(chǎn)胞外多糖的影響

本研究通過液體搖瓶發(fā)酵法測定白藜蘆醇對Xaj胞外多糖（EPS）產(chǎn)生的影響，發(fā)酵5 d后進行觀察。在未添加白藜蘆醇時，Xaj的EPS產(chǎn)量為7.47 mg/mL；而添加15 μg/mL白藜蘆醇進行培養(yǎng)時，發(fā)酵液中基本無絮狀沉淀物產(chǎn)生，EPS產(chǎn)量基本為0 mg/mL（圖3），表明在15 μg/mL的亞抑菌濃度下，白藜蘆醇對Xaj的EPS產(chǎn)生有明顯抑制作用。

圖3 白藜蘆醇對Xaj產(chǎn)胞外多糖的影響Fig. 3 Effect of resveratrol on extracellular polysaccharide production by Xaj

2.4 白藜蘆醇對Xaj分泌胞外酶的影響

利用添加相應(yīng)物質(zhì)的固體平板，分別在亞抑菌濃度下檢測了白藜蘆醇對Xaj分泌胞外酶（蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶）的影響。研究結(jié)果顯示，添加15 μg/mL白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj的蛋白酶的分泌（圖4），對淀粉酶的分泌有促進作用（圖5），而對纖維素酶的分泌沒有影響（圖6）。

圖4 白藜蘆醇對Xaj分泌胞外蛋白酶的影響Fig. 4 Effect of resveratrol on extracellular protease secreted by Xaj

圖5 白藜蘆醇對Xaj分泌胞外淀粉酶的影響Fig. 5 Effect of resveratrol on extracellular amylase secreted by Xaj

圖6 白藜蘆醇對Xaj分泌胞外纖維素酶的影響Fig. 6 Effect of resveratrol on extracellular cellulase secreted by Xaj

2.5 白藜蘆醇對Xaj運動性的影響

通過運動性半固體平板進行運動性實驗。結(jié)果表明在濃度為15 μg/mL時，白藜蘆醇對Xaj運動性沒有影響（圖7）。

圖7 白藜蘆醇對Xaj運動性的影響Fig.7 Effect of resveratrol on Xaj motility

3 討論

胞外多糖是生物膜的主要組成成分，它在抑制植物防衛(wèi)反應(yīng)，及菌體生物膜的形成中扮演著重要角色［18］。本研究表明一定量的白藜蘆醇能明顯抑制核桃細(xì)菌性黑斑病菌胞外多糖的產(chǎn)生，對生物膜的形成也有抑制作用，測定的胞外多糖合成量與生物膜的形成情況成正相關(guān)，與理論相符。植物細(xì)胞壁是病原菌入侵的主要屏障之一，而植物病原細(xì)菌可通過II型分泌系統(tǒng)（T2S）分泌降解植物細(xì)胞壁的酶（主要有纖維素酶、淀粉酶、半纖維素酶、果膠酶和蛋白酶等）及多種毒性因子，破壞寄主細(xì)胞，從而達到進入寄主體內(nèi)并獲得生長繁殖所需的營養(yǎng)的目的［19］。在檢測白藜蘆醇影響胞外酶分泌的研究中，白藜蘆醇既有促進效果，又有抑制作用，說明細(xì)菌分泌的3種胞外酶的活性不同，對白藜蘆醇具有不同的敏感性。研究可見纖維素酶的水解透明圈非常明顯，較另外兩種酶的圈直徑都大，表明該病原菌具有較強的纖維素酶分泌能力（與之前已發(fā)表的數(shù)據(jù)一致［20］），因此，濃度為15 μg/mL的白藜蘆醇不足以抑制其纖維素酶的分泌，后續(xù)研究中將選用更高的亞抑菌濃度進行相關(guān)實驗。

近幾年，我國局部核桃生產(chǎn)地區(qū)的細(xì)菌性黑斑病的發(fā)生隨著種植面積不斷擴大而愈發(fā)嚴(yán)重。目前，我國對于核桃黑斑病的研究還處于初步階段，缺乏系統(tǒng)和深入的研究，且采取的防治方法都存在一定的局限性，如選育抗病品種過程繁瑣而且周期過長，抗性品種的選育與推廣速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于病原菌變異的速度；外源噴灑含銅化學(xué)農(nóng)藥（或銅鋅制劑與抗生素類農(nóng)藥交替使用）的化學(xué)防治方法雖然是目前較為有效的黑斑病防治手段，但長期使用將導(dǎo)致農(nóng)藥殘留，造成抗銅細(xì)菌的滋生，引起食品安全及生態(tài)平衡破壞等弊端。因此，開發(fā)科技含量的防病技術(shù)與綠色環(huán)保藥物，進行綜合性科學(xué)防治，以高效控制核桃細(xì)菌性黑斑病的發(fā)生是當(dāng)下一項重要任務(wù)。

由于植物中白藜蘆醇的含量很低，加之提取與制備工藝復(fù)雜，且需要獲得較高純度才能達到一定抑菌效果，因此將其作為天然殺菌劑進行應(yīng)用的成本頗高，可考慮用化學(xué)方法人工合成白藜蘆醇衍生物，并對其抑菌效果及殺菌譜進行研究驗證，為開發(fā)合適的新型抑菌劑提供理論依據(jù)。在利用其抗菌活性的同時，其與已知抗菌藥物潛在的協(xié)同作用也是一個不容忽視的重要方面，與其他抗菌劑的配合使用是否可增加藥效，也是值得考慮的問題。目前，關(guān)于白藜蘆醇抑菌的研究，主要集中在人體致病菌，少見對植物致病菌抑制效果的報道，因此在農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用稍有欠缺，應(yīng)更多地關(guān)注其對于農(nóng)林作物病害的防治。在未來，需要更多的研究來闡明白藜蘆醇被開發(fā)成生物制藥產(chǎn)品和新型植物源農(nóng)藥的潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對核桃細(xì)菌性黑斑病菌的毒力因子產(chǎn)生的表型均有一定影響，但關(guān)于白藜蘆醇抑制核桃細(xì)菌性黑斑病病原菌的機制目前尚不清楚，有待深入研究。研究表明脂肪酸合成代謝與病原菌致病性具有相關(guān)性［21］，因此可聯(lián)系該細(xì)菌脂肪酸合成代謝途徑中關(guān)鍵基因的功能，進一步確定白藜蘆醇的作用靶點，探討其作用機制。有研究報道白藜蘆醇能抑制奇異變形桿菌的遷徒生長，推測原因是白藜蘆醇作用于一種含組氨酸的磷酸根離子的細(xì)菌雙組分信號系統(tǒng)［22］。雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)（twocomponent signal transductionsystem，TCSTS）是原核細(xì)胞中一種非常重要的信號傳遞機制，也是細(xì)菌最主要的感應(yīng)-響應(yīng)調(diào)節(jié)機制［23］。而DSF依賴的群體感應(yīng)系統(tǒng)是調(diào)控病原微生物致病性和環(huán)境適應(yīng)性的重要方式，也是防治植物細(xì)菌性病害的重要切入點。鑒于此，課題組擬開展“白藜蘆醇與環(huán)二鳥苷酸代謝相關(guān)酶（一種TCSTS受體/感應(yīng)蛋白）的相互作用”的研究，建立白藜蘆醇與細(xì)菌DSF群體感應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)。另外也可通過掃描電鏡和透射電鏡動態(tài)地觀察在白藜蘆醇作用后，細(xì)菌細(xì)胞微觀結(jié)構(gòu)的變化，或利用電導(dǎo)率儀測定細(xì)胞膜的通透性，從而揭示其作用機制。

4 結(jié)論

本研究通過K-B濾紙片法初步確定白藜蘆醇對核桃細(xì)菌性黑斑病菌XajDW3F3具有抑制作用。在此基礎(chǔ)上，進一步通過液體培養(yǎng)法，測定了白藜蘆醇對Xaj的最低抑菌濃度（MIC）為20 μg/mL，以及最低殺菌濃度（MBC）為45 μg/mL。并選擇在亞抑菌濃度為15 μg/mL的條件下檢測白藜蘆醇對Xaj毒力因子的影響。研究結(jié)果表明在此濃度下白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj生物被膜的形成；對該菌對胞外多糖（EPS）的產(chǎn)生也有明顯抑制作用；而在檢測對胞外酶分泌的影響時發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能夠顯著抑制Xaj的蛋白酶的分泌，對淀粉酶的分泌卻有促進作用，而對纖維素酶的分泌沒有影響。另外運動性實驗結(jié)果顯示白藜蘆醇對Xaj運動性沒有影響。