郝向陽(yáng) 劉范 武歡 王斌 孫雪麗 項(xiàng)蕾蕾 王天池 賴鐘雄 程春振，2

（1. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福州 350002；2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801）

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）是連接植物初生和次生代謝、催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)的關(guān)鍵限速酶［1-2］，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中扮演著重要角色［3-5］。此外，PAL與次生代謝產(chǎn)物（如木質(zhì)素、植保素、類黃酮等物質(zhì)）的含量密切相關(guān)，在植物響應(yīng)生物和非生物脅迫過程中也發(fā)揮著重要作用［6-7］。

植物PAL基因多以小的多基因家族形式存在，擬南芥［8］、水稻［9］、柳樹［6］和楊樹［10］分別有4、9、5和5個(gè)PAL成員。PAL基因的表達(dá)受多種非生物逆境影響顯著，如：水稻OsPALs（除OsPAL8外）的表達(dá)至少受干旱、低溫、NaCl和ABA等4種脅迫中的一種影響顯著［9，11］。PAL基因在植物生物脅迫應(yīng)答過程中也發(fā)揮著重要作用?？莶菅挎邨U菌CBR05（Bacillus subtilis CBR05）可以通過誘導(dǎo)番茄PAL基因的表達(dá)進(jìn)而提高番茄對(duì)野油菜黃單孢 菌（Xanthomonas campestris pv. vesicatoria）的 抗性［12］；茶樹PAL基因的表達(dá)受炭疽菌（Colletotrichum camelliae）、擬 盤 多 毛 孢 菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）和 茶 尺 蠖（Ectropis oblique）顯著誘導(dǎo)，可能在茶樹抵御真菌和昆蟲病害中發(fā)揮作用［13］。陸地棉GhPAL1和GhPAL8的表達(dá)受黃萎菌誘導(dǎo)，且在抗病品種中的表達(dá)量約為感病品種的8倍，說明它們的表達(dá)水平可能與陸地棉黃萎病抗性息息相關(guān)［14］。此外，還有研究指出PAL參與水楊酸（SA）的合成調(diào)控［15-18］，說明它廣泛參與植物的抗逆防御反應(yīng)。

非洲菊是世界重要的鮮切花，被認(rèn)為是研究花色的理想模式植物，經(jīng)濟(jì)、觀賞和科學(xué)研究?jī)r(jià)值極高［19-21］。近些年來，我國(guó)非洲菊產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭良好，栽培面積逐步增大，但溫度、水分、土壤等環(huán)境因子以及病蟲害等對(duì)該產(chǎn)業(yè)的影響也日益凸顯［22-24］。利用轉(zhuǎn)基因育種手段提高非洲菊抗逆性是非洲菊育種的重要研究方向。

鑒于PAL基因在植物抗逆防御過程中的作用，本研究將實(shí)驗(yàn)室前期獲得的非洲菊轉(zhuǎn)錄組中的21個(gè)PAL基因片段［25］進(jìn)行了序列拼接，經(jīng)RACE-PCR和RT-PCR克隆獲得4個(gè)包含完整CDS的非洲菊PAL基因，利用生物信息學(xué)方法分析它們及其編碼蛋白的序列特征，同時(shí)利用qRT-PCR技術(shù)研究它們?cè)诓煌{迫處理下的表達(dá)模式。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)所用非洲菊品種“玲瓏”由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好、長(zhǎng)勢(shì)一致、株高約為30 cm植株的葉、葉柄和根，用于RNA提取。SA、干旱、鹽脅迫和低溫等非生物脅迫分別使用100 μmol/L SA、30% PEG、200 mmol/L NaCl和4℃低溫處理，使用浸根法進(jìn)行隱地疫霉接種處理，具體步驟參照郝向陽(yáng)等［26］方法。所有處理均重復(fù)3次，取樣后立即置于液氮中速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 基因篩選及克隆 從非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選命名為PAL的unigene序列，將這些序列進(jìn)行進(jìn)一步拼接后選擇了4個(gè)長(zhǎng)度較長(zhǎng)的PAL基因，其中，1個(gè)缺少5′端和3′端序列（GjPAL1），2個(gè)具有完整的開放閱讀框（GjPAL2和GjPAL3），另外1個(gè)缺失3′端序列（GjPAL4）。

采用Trizol RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取非洲菊葉片總RNA；采用SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit分 別 合 成5′及3′RACE cDNA，用于上述不具有完整CDS的GjPAL基因3′端和5′端的克?。徊捎肨hermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，用于PAL基因的全長(zhǎng)驗(yàn)證，25 μL PCR反應(yīng)體系包含：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2×）12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、cDNA 1 μL和上下游引物各1 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃ 3 min；94℃ 30 s，55-59℃ 30 s，72℃ 2 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。采用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物，回收純化后進(jìn)行TA克隆，經(jīng)菌液PCR鑒定后選取陽(yáng)性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。所用引物序列見表1。

表1 基因克隆和定量引物信息Table 1 Information of the primers used for gene cloning and qRT-PCR

1.2.2 生物信息學(xué)分析 參照郝向陽(yáng)等［26］的方法分析和預(yù)測(cè)GjPALs蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位情況。分別使用在線網(wǎng)站MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）、COILS（http：//www.ch.embnet.org/software/COILS_form. html） 和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）分析GjPALs保守基序、卷曲螺旋結(jié)構(gòu)和三維結(jié)構(gòu)。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索并下載其他物種PAL氨基酸序列，采用MEGA6.0鄰接法（neighbor-joining method）在默認(rèn)參數(shù)下構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removel）試劑盒（全式金）合成cDNA。以稀釋50倍的cDNA為模板，以非洲菊18S rRNA為內(nèi)參基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。qRTPCR反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）熒光染料10 μL、ddH2O 7.4 μL、上下游引物各0.8 μL和模板1 μL。使用Excel 2003和SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 GjPALs基因克隆結(jié)果

利用RACE-PCR成功克隆獲得GjPAL1 cDNA 3′端（899 bp）和5′端（540 bp）序列及GjPAL4 cDNA 3′端序列（682 bp）（圖1）。利用RT-PCR對(duì)4個(gè)GjPALs進(jìn)行克隆驗(yàn)證，均獲得預(yù)期長(zhǎng)度的片段（圖1），說明成功克隆獲得這4個(gè)基因。GjPAL1-GjPAL4（GenBank登 錄 號(hào) 分 別 為MH708524、MH708525、MH708526和MH708527）CDS長(zhǎng)度分別為2 127、2 115、2 136和2 127 bp，預(yù)測(cè)可分別編碼包含708、704、711和708個(gè)氨基酸的蛋白。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳圖Fig. 1 Electrophoresis result of PCR products

2.2 GjPALs生物信息學(xué)分析結(jié)果

蛋白基本理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，4個(gè)GjPAL均屬于穩(wěn)定的酸性親水蛋白（表2）。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，4個(gè)GjPALs都包含保守的PLN02457、phe_am_lyase、Lyase_aromatic和PAL-HAL結(jié)構(gòu)域，均屬于Lyase_I_Like超家族。其中，GjPAL1、GjPAL2和GjPAL4還含有特異性HutH結(jié)構(gòu)域，GjPAL3含有非特異性HutH結(jié)構(gòu)域（圖2）。保守基序預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，在可信范圍（e-value≤e-5）內(nèi)，4個(gè)GjPAL蛋白均 含有16個(gè)Motif（圖2）。多重序列比對(duì)結(jié)果顯示：4個(gè)GjPALs間的相似性較高（均大于89%）且與其他物種PALs同源性較高（圖3）。除GjPAL2外，所有GjPALs均含有GTITASGDLVPLSYIAG酶活性中心序列和植物PAL最典型的保守區(qū)域ASG（圖3）。

圖2 GjPAL1-GjPAL4（A-D）蛋白保守結(jié)構(gòu)域和motif（E）分析Fig. 2 Conserved domains (A-D) and motifs (E) of GjPAL1-4

圖3 不同植物PAL氨基酸序列的多重序列比對(duì)Fig. 3 Multiple alignment result of PALs from different plant species

表2 4個(gè)GjPALs蛋白基本理化性質(zhì)分析結(jié)果Table 2 Physicochemical properties of the four GjPALs

蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，GjPALs均主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成。SWISS-MODEL同源建模結(jié)果顯示，它們與歐芹（Petroselinum crispum）PAL1三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性分別達(dá)86.63%、82.78%、82.12%和86.34%。COILS預(yù) 測(cè) 結(jié) 果 顯示，僅GjPAL2和GjPAL3能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。TMPRED分析結(jié)果顯示，所有GjPALs均含有由內(nèi)向外和由外向內(nèi)的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)。磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果（表3）顯示：GjPAL1-GjPAL4分別含有61、61、62和63個(gè)磷酸化位點(diǎn)。此外，信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明，4個(gè)GjPALs均不含信號(hào)肽，且主要定位在細(xì)胞質(zhì)。

表3 GjPAL跨膜結(jié)構(gòu)域及磷酸化修飾位點(diǎn)分析結(jié)果Table 3 Result of transmembrane structure and phospho-rylation sites in GjPALs

圖4 4個(gè)GjPALs三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)Fig. 4 Predicted four-dimensional structures of the four GjPALs

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

將GjPALs與其他植物PAL蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)植物PAL大致可分為雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物和蕨類植物四類（圖5）。除少數(shù)特例外（白樺是雙子葉植物，但其PAL與蕨類植物聚為一類），PALs聚類結(jié)果基本與植物分類結(jié)果相符［27］。GjPAL1、GjPAL3和GjPAL4與菊科的萵苣PAL聚在一起，GjPAL2和其他雙子葉植物PALs聚為一類。

圖5 GjPALs和其他植物PALs系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree for GjPALs and PALs from some other plant species

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

2.4.1 GjPALs在不同組織部位的表達(dá)分析 qRTPCR結(jié)果顯示和GjPALs在葉柄中的表達(dá)量最低，除GjPAL1在葉中表達(dá)量最高外，其余3個(gè)GjPALs均在根中表達(dá)量最高（圖6-A）。其中，GjPAL2和GjPAL3在根中表達(dá)量極高，分別約為葉中的70倍和130倍。

2.4.2 GjPALs在不同逆境條件下的表達(dá)分析 SA處理后，GjPAL1和GjPAL2的表達(dá)受到極顯著抑制（P<0.01），而GjPAL3和GjPAL4的表達(dá)則呈先升后降的趨勢(shì)。GjPAL3在SA處理4和8 h的表達(dá)水平極顯著高于對(duì)照（P<0.01），分別約為未處理對(duì)照的3.8倍和2.3倍，SA處理12 h時(shí)顯著低于對(duì)照（P<0.05），24 h時(shí)極顯著低于對(duì)照（P<0.01）。GjPAL4在SA處理4 h時(shí)的表達(dá)量極顯著高于對(duì)照（P<0.01），約為未處理對(duì)照的2.9倍，之后均極顯著低于對(duì)照（P<0.01）（圖6-B）。

鹽脅迫處理?xiàng)l件下，GjPAL1、GjPAL2和GjPAL4的表達(dá)受到極顯著抑制（P<0.01）。而GjPAL3的表達(dá)受到極顯著誘導(dǎo)（P<0.01），在NaCl處理4、8、12、24和48 h的表達(dá)量分別約為對(duì)照的3.3倍、3.2倍、2.7倍、2.6倍和3.7倍（圖6-C）。

PEG處理?xiàng)l件下，4個(gè)GjPALs的表達(dá)模式差異較大。GjPAL1和GjPAL2在PEG處理后均表現(xiàn)出降-升-降-升的表達(dá)模式，GjPAL1在處理后3 h的表達(dá)量有所回升，但依然極顯著低于對(duì)照（P<0.01），而GjPAL2在處理后12 h的表達(dá)量達(dá)到最高值，且極顯著高于對(duì)照（P<0.01）；GjPAL3在處理后呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，且均高于對(duì)照，在處理0.5 h時(shí)表達(dá)量略高于對(duì)照，約為對(duì)照的1.2倍，1 h顯著高于對(duì)照（P<0.05），約為對(duì)照的1.3倍，之后均極顯著高于對(duì)照（P<0.01），分別約為對(duì)照的1.7倍、1.9倍、2.2倍和1.5倍；GjPAL4在PEG處理后表現(xiàn)出先降后升的趨勢(shì)，但均極顯著低于對(duì)照（P<0.01）（圖6-D）。

4℃低溫處理后，GjPAL1、GjPAL3與GjPAL4的表達(dá)均呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)，且均極顯著低于對(duì)照；GjPAL2則表現(xiàn)出降-升-降的表達(dá)模式，在低溫處理在4和24 h的表達(dá)量顯著低于對(duì)照（P<0.05），8和12 h的表達(dá)量與對(duì)照相差不大（圖6-E）。

隱地疫霉處理下，4個(gè)GjPALs的表達(dá)模式各不相同。GjPAL1的表達(dá)呈現(xiàn)升-降-升的趨勢(shì)，且均極顯著高于對(duì)照（P<0.01），接種隱地疫霉2、4和6 d后，表達(dá)量分別約為對(duì)照的3.5倍、2.4倍和4.0倍；與PjPAL1表達(dá)趨勢(shì)相反，PjPAL2在接種隱地疫 霉后呈“降-升-降”的表達(dá)趨勢(shì)，且均低于對(duì)照， 在2和6 d時(shí)的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照（P<0.01），分別僅為對(duì)照的59.6%和31.3%；GjPAL3在接種隱地疫霉后呈先降后升的表達(dá)趨勢(shì)，在2 d時(shí)的表達(dá)量?jī)H約為對(duì)照的39.0%，在4和6 d時(shí)的表達(dá)量分別約為對(duì)照的2.4倍和2.6倍；GjPAL4的表達(dá)受隱地疫霉接種誘導(dǎo)，在2 d時(shí)略高于對(duì)照，約為對(duì)照的1.2倍，4 d和6 d時(shí)極顯著高于對(duì)照，分別約為對(duì)照的2.0倍和1.9倍（圖6-F）。

圖6 GjPAL基因在不同組織部位和不同逆境處理下的表達(dá)情況Fig.6 Relative expression of GjPAL genes in different tissues and organs and under different stress treatments

3 討論

3.1 4個(gè)GjPALs序列相似度較高，但蛋白結(jié)構(gòu)域、典型保守區(qū)域和結(jié)構(gòu)存在一定差異

本研究基于前期非洲菊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［25］，利用RACE和RT-PCR技術(shù)成功克隆獲得4個(gè)非洲菊PAL基因（GjPAL1-GjPAL4）。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，4個(gè)GjPALs編碼的蛋白均屬于Lyase_I_Like超家族，它們與其他植物PAL相似度較高，說明植物PAL在進(jìn)化上相對(duì)保守［28］。4個(gè)GjPALs在結(jié)構(gòu)域和保守區(qū)域上存在差異：GjPAL3含有非特異性HutH結(jié)構(gòu)域外，而其他3個(gè)成員均含有特異性HutH結(jié)構(gòu)域，而GjPAL2上不存在植物PAL最典型的保守區(qū)域ASG［7］。此外，4個(gè)GjPALs成員編碼的蛋白中僅GjPAL2和GjPAL3能形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。以上結(jié)果暗示GjPAL2和GjPAL3與另外2個(gè)成員的功能可能差異較大。

3.2 不同GjPALs成員在不同組織部位和不同逆境處理下的表達(dá)特性差異較大

植物PAL基因在不同組織部位中的表達(dá)水平差異較大，且大多數(shù)植物PAL基因在根部表達(dá)量較高，莖中表達(dá)水平中等，在成熟的葉片中幾乎不表達(dá)［7］。本研究發(fā)現(xiàn)GjPAL2-GjPAL4均在根中的表達(dá)量最高，推測(cè)它們可能在根系木質(zhì)素合成調(diào)控中發(fā)揮重要作用［29-30］。丹參PAL1在葉中的表達(dá)量最高，而在莖和根中的表達(dá)量較低，且其表達(dá)受ABA、傷害和脫水等逆境處理誘導(dǎo)顯著［31］。本研究卻發(fā)現(xiàn)：在葉中表達(dá)量最高的GjPAL1，其表達(dá)量受SA、鹽、干旱和低溫的顯著抑制，但其在根中的表達(dá)卻受隱地疫霉顯著誘導(dǎo)，說明不同植物的PAL基因功能不同。

通過研究GjPALs在不同逆境處理下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)GjPAL1和GjPAL4在不同逆境處理下的表達(dá)趨勢(shì)更為相似（均受鹽、干旱和低溫抑制，且均受隱地疫霉誘導(dǎo)），與GjPAL2和GjPAL3相差較大。Shang等［32］研究發(fā)現(xiàn)黃瓜CsPAL7的表達(dá)受干旱誘導(dǎo)，整體呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢(shì)，與GjPAL3的表達(dá)趨勢(shì)類似。本研究還發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫下，GjPAL1和GjPAL4的表達(dá)受到極顯著抑制；GjPAL2在PEG模擬干旱處理下表現(xiàn)為降-升-降-升的表達(dá)趨勢(shì)，處理早期的表達(dá)也受到顯著抑制，但在PEG處理12 h時(shí)的表達(dá)量已顯著高于對(duì)照，說明GjPAL2和GjPAL3可能在非洲菊干旱脅迫應(yīng)答過程中發(fā)揮更為重要的作用。鹽脅迫處理下，GjPAL3的表達(dá)受顯著誘導(dǎo)，而其他成員的表達(dá)受到顯著抑制，說明GjPAL3還在非洲菊抵御鹽脅迫過程中發(fā)揮重要作用。孫梓健等［33］研究指出紅葉芥PAL在低溫處理下整體呈現(xiàn)降-升-降的表達(dá)趨勢(shì)，本研究發(fā)現(xiàn)GjPAL1、GjPAL3和GjPAL4在低溫處理下均呈先降后升的表達(dá)趨勢(shì)，而低GjPAL2呈降-升-降的表達(dá)模式，在低溫處理8和12 h時(shí)的表達(dá)量已經(jīng)恢復(fù)到對(duì)照相近水平，說明GjPALs在非洲菊的低溫應(yīng)答過程均發(fā)揮作用，其中GjPAL2的響應(yīng)時(shí)間最早。

PAL在植物抗病防御反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，因此，常被用作評(píng)價(jià)植物抗病能力的重要生化指標(biāo)［28，34］。過表達(dá)PAL的轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)煙草尾孢病原菌抗性顯著提高［35］；過表達(dá)PAL的蓮藕轉(zhuǎn)基因植株根瘤菌侵染速度延緩，結(jié)節(jié)數(shù)減少［36］；擬南芥PAL1/PAL2/PAL3/PAL4敲除突變體對(duì)細(xì)菌性病原菌（Pseudomonas syringae）的敏感性增加［2］。本研究除GjPAL2外，其余3個(gè)GjPALs接種隱地疫霉4和6 d的根系中的表達(dá)量均極顯著高于對(duì)照，說明它們參與非洲菊-隱地疫霉互作。

綜上所述，4個(gè)GjPALs均參與非洲菊對(duì)不同逆境的應(yīng)答過程，但各成員在不同組織部位和在不同逆境處理下的作用存在一定差異。其中，GjPAL1和GjPAL4雖然在不同組織部位中的表達(dá)情況相差較大，但在不同逆境下的表達(dá)模式更為相近。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得4個(gè)非洲菊PAL基因（GjPAL1-GjPAL4），它們的CDS長(zhǎng)度為2 115-2 136 bp，編碼蛋白含704-711個(gè)氨基酸，為不含信號(hào)肽的穩(wěn)定酸性親水蛋白。GjPALs含有跨膜螺旋結(jié)構(gòu)且主要定位在細(xì)胞質(zhì)。

GjPAL1在葉中表達(dá)量最高，其他均在根中表達(dá)量最高；4個(gè)GjPALs的表達(dá)均受低溫處理顯著抑制；GjPAL1和GjPAL2的表達(dá)受SA、NaCl和PEG抑制顯著；GjPAL3受NaCl和PEG處理顯著誘導(dǎo)；隱地疫霉處理?xiàng)l件下，GjPAL1和GjPAL4的表達(dá)顯著升高，GjPAL2顯著降低。GjPALs在非洲菊抵御逆境過程中發(fā)揮著重要作用。