向芬 李維 劉紅艷 銀霞 曾澤萱 周凌云

（湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，長(zhǎng)沙 410125）

氮肥投入是提高茶樹(shù)產(chǎn)量的有利保障，但過(guò)量長(zhǎng)期施用氮肥反而會(huì)造成茶葉減產(chǎn)，土壤板結(jié)等問(wèn)題，亦會(huì)對(duì)土壤微生態(tài)造成較大的影響［1］，進(jìn)而影響土壤微生物的活性與群落結(jié)構(gòu)［2］。土壤微生物參與土壤有機(jī)質(zhì)分解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化［3-4］，間接促進(jìn)了土壤物質(zhì)養(yǎng)分循環(huán)［5-6］，是土壤環(huán)境質(zhì)量早期評(píng)價(jià)的指標(biāo)［7］。

不同品種茶園的根際土壤細(xì)菌種類數(shù)、個(gè)體數(shù)各不相同［8］。茶園不同施肥模式比較發(fā)現(xiàn)，與不施肥對(duì)照比較，施肥模式的根際土壤細(xì)菌、真菌、放線菌等微生物數(shù)目增加，根際土壤微生物量碳、氮和土壤酶活性亦增加［9］，雖然N肥的施用能顯著提高非根際土壤微生物量碳氮含量［10-11］，有機(jī)肥施用能提高茶園土壤微生物區(qū)系的多樣性［12］，但對(duì)于不同減氮模式處理下的茶園土壤細(xì)菌的活性及群落結(jié)構(gòu)鮮見(jiàn)報(bào)道，而土壤中90%微生物為細(xì)菌［13］，可能與土壤中細(xì)菌種類繁雜，分離培養(yǎng)周期長(zhǎng)，難以比較全面的檢測(cè)土壤細(xì)菌的類別有關(guān)［14-15］。研究者前期對(duì)不同減氮模式下茶園土壤理化性質(zhì)、茶園產(chǎn)量、氮肥農(nóng)學(xué)效率進(jìn)行了研究［16］，發(fā)現(xiàn)減氮處理B能保證產(chǎn)量，氮肥農(nóng)學(xué)效率最高，土壤養(yǎng)分利用率高?；诤昊蚪M的高通量測(cè)序方法無(wú)需單獨(dú)對(duì)細(xì)菌分離培養(yǎng)，可對(duì)樣本中所有細(xì)菌種類進(jìn)行分析，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于土壤微生物群落研究［1，14，17］。為了探究不同減氮模式對(duì)茶樹(shù)地下部分細(xì)菌菌群組成的影響，本文通過(guò)高通量測(cè)序方法測(cè)定不同施氮量茶樹(shù)地下部分的細(xì)菌結(jié)構(gòu)及組成，為進(jìn)一步明確氮代謝相關(guān)細(xì)菌活動(dòng)規(guī)律及田間氮肥用量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)地位于湖南省茶葉研究所馬坡嶺基地茶園，地理位置113°04.512′ E，28°12.397′ N，地勢(shì)平坦，試驗(yàn)地土壤為第四紀(jì)紅壤，土層深厚，茶園土壤0-20 cm土層基本情況：全碳15.9 g/kg，全氮1.7 g/kg，堿解氮162 mg/kg，有效磷44.8 mg/kg，有效鉀264 mg/kg，碳氮比為9.35。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 茶園連續(xù)4年管理水平保持一致，于2013年10月18日-2016年10月18日對(duì)茶園連續(xù)4年進(jìn)行不同施氮量處理，試驗(yàn)設(shè)16 kg/667 m2（減氮55.6%處理A），26 kg/667 m2（減氮27.8%處理B），36 kg/667 m2（常規(guī)施肥處理C）、不施氮（CK）4個(gè)處理水平，每個(gè)處理小區(qū)200 m2，每個(gè)處理3次重復(fù)。具體施肥時(shí)以菜籽餅、硫酸鉀型復(fù)合肥為基肥，尿素為追肥的方式進(jìn)行施用，施用方式見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)茶園施肥方式Table 1 Fertilizer application methods in tea garden

1.2.2 樣品采集 從茶園施肥處理第4年開(kāi)始進(jìn)行樣品采集，非根際土壤樣品、根際樣品采集于2017年10月8日進(jìn)行，用土鉆（直徑2.5 cm）在每個(gè)小區(qū)按Z型5個(gè)點(diǎn)（非根際0-20 cm土壤，非根際20-40 cm土壤）進(jìn)行取樣，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，非根際土壤樣品在24 h內(nèi)去除茶樹(shù)根系，置于-4℃保存，用于非根際土壤細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)的測(cè)定。離茶樹(shù)根頸部25-45 cm處，深0-40 cm，寬50 cm挖取茶樹(shù)吸收根，盡量減少對(duì)根系的損傷，用軟毛刷清掃根系上的土壤，即根際土。

1.2.3 樣品測(cè)定 葉面積指數(shù)于2017年4月采用LAI-2200C冠層分析系統(tǒng)對(duì)各減氮處理葉面積指數(shù)進(jìn)行測(cè)定。土壤碳通量：于2017年5月采用Soilbox-343 便攜式土壤呼吸系統(tǒng)（VAISALA，芬蘭）進(jìn)行測(cè)定。將待測(cè)區(qū)域內(nèi)植被地上部全部清理干凈，并揀去較多的枯枝落葉。將非透明呼吸室罩在待測(cè)區(qū)域，呼吸室與土壤的接觸邊緣用干土密封，每小區(qū)隨機(jī)選取3 個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)單位時(shí)間箱內(nèi)CO2濃度的變化計(jì)算土壤呼吸速率［18］。

將茶園茶樹(shù)根際土壤、非根際0-20 cm土壤、非根際20-40 cm土壤使用TIANamp Bacteria DNA kit核酸提取試劑盒提取樣本中總DNA。對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因V3-V4高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Bio-rad T100 梯度PCR儀），引物序列為：341F：CCTAYGGGRBGCASCAG，806R：GGACTACNNGGGTATCTAAT。酶和緩沖液：使用 New England Biolabs 公 司 的 Phusion? High-Fidelity PCR Master。PCR 擴(kuò) 增 體 系（30 μL）：2×taq PCR mix 15 μL，Primer F（10 μmol/L）3 μL，Primer R（10 μmol/L）：3 μL，gDNA 2.5 μL，H2O 6.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性 5 min；34個(gè)循環(huán)包括（94℃，1 min；57℃，45 s；72℃，1 min）；72℃最后延伸10 min。將產(chǎn)物送交北京諾禾致源生物信息科技有限公司采用IonS5TMXL高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。先對(duì) PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化與定量，再使用 Thermofisher 公司的 Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)的構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)檢測(cè)合格后，使用Thermofisher 的Ion S5TMXL 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.2.4 序列數(shù)據(jù)處理與數(shù)據(jù)分析 基于IonS5TMXL測(cè)序平臺(tái)，利用單端測(cè)序（Single-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫(kù)進(jìn)行單端測(cè)序。通過(guò)對(duì)Reads剪切過(guò)濾，操作單元分類數(shù)（Operational taxonomic units，OTUs）聚類，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析，可以揭示樣品物種構(gòu)成，應(yīng)用VENN圖可以用來(lái)統(tǒng)計(jì)樣本中共有的和獨(dú)有的OTUs數(shù)目，采取BLAST將代表序列與GreenGene數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種分類注釋，分別在門、綱、目、科、屬的分類水平上統(tǒng)計(jì)樣本的菌群組成，進(jìn)一步的α多樣性分析（Alpha Diversity）及β多樣性分析（Beta Diversity）可以挖掘樣品之間的差異。為進(jìn)一步挖掘分組樣品間的群落結(jié)構(gòu)差異，選用T-test統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)分組樣品的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。采用DPS7.05軟件進(jìn)行微生物豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 減氮處理對(duì)茶樹(shù)冠層的影響

茶樹(shù)為葉用經(jīng)濟(jì)作物，葉面積指數(shù)能較好的反應(yīng)作物產(chǎn)量。從圖1可以看出隨著施氮量的增加茶樹(shù)葉面積指數(shù)增加，與對(duì)照不施肥比較，減氮處理B、常規(guī)施肥C的葉面積指數(shù)顯著、極顯著增加，但減氮處理B與常規(guī)施肥C的葉面積指數(shù)無(wú)顯著性差異。

圖1 減氮處理對(duì)茶樹(shù)葉面積指數(shù)的影響Fig.1 Effect of nitrogen reduction on tea leaf area index

2.2 測(cè)序結(jié)果質(zhì)量分析

根據(jù)圖2稀釋性曲線看出，各樣品的序列數(shù)據(jù)量達(dá)到30 000條時(shí)，OTUs基本趨于飽和，表明測(cè)序獲得了足夠多的數(shù)據(jù)量，樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量基本覆蓋所有類群的信息。圖3根際樣品曲線在橫軸上的跨度最小，表示物種的豐富度最小，而非根際土壤細(xì)菌的代表曲線相對(duì)更平緩，表示其中分布的物種更均勻。

圖2 不同土壤樣品測(cè)序稀釋曲線圖Fig.2 Rarefaction analysis of 16S libraries from different soil samples

圖3 不同土壤樣品的Rank Abundance曲線Fig.3 Rank Abundance curves of different soil samples

2.3 減氮處理對(duì)各土層中細(xì)菌多樣性指數(shù)的影響

Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)是衡量樣品中物種豐度的重要指標(biāo)，而香農(nóng)（Shannon）指數(shù)和辛普（Simpson）指數(shù)常用來(lái)衡量樣品物種多樣性，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，則說(shuō)明樣品中物種群落多樣性越高。由表2可知，與對(duì)照比較，施肥處理的茶樹(shù)根際土壤中的細(xì)菌物種豐度增加；而非根際土壤中細(xì)菌菌落的多樣性和豐度降低，細(xì)菌種群數(shù)在非根際土壤中比根際土壤高出44.50%-131.08%，非根際土壤中施肥處理以常規(guī)施肥處理的土壤細(xì)菌豐度較高，并以減氮較多的處理A最低，而根際土壤細(xì)菌豐度則以常規(guī)施肥處理（36 kg/667 m2）最低，減氮處理B（26 kg/667 m2）最高，但差異不顯著。其中細(xì)菌多樣性指標(biāo)Shannon指數(shù)顯示減氮處理B的土壤細(xì)菌多樣性在根際土壤與非根際0-20 cm土壤中最高，而在非根際20-40 cm土壤則是常規(guī)施肥處理C的細(xì)菌多樣性顯著增加（P<0.05）。

表2 各土壤樣品微生物豐富度指數(shù)與多樣性指數(shù)Table 2 Diversity and richness index of bacteria from twelve samples

2.4 各減氮處理土壤樣品細(xì)菌的Venn圖比較

根際土壤、非根際0-20 cm土壤及非根際20-40 cm土壤共有OTUs分別為505、854及835個(gè)。其中根際土壤、非根際0-20 cm土壤、非根際20-40 cm土壤的OUTs分布隨著施氮量增加逐漸降低，其中非根際20-40 cm土壤各處理分別占31.58%、27.86%、26.23%（圖4）。由圖5可知，茶樹(shù)地下部分各樣品在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌基本為氮代謝相關(guān)菌類。其中共有3個(gè)優(yōu)勢(shì)類群，分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi），其中相對(duì)富集在根際的優(yōu)勢(shì)菌為藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）；非根際土壤中的則為酸桿菌門（Acidobacteria），另外3種分別為擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、糖化菌門（Saccharibacteria）。在屬的水平上（圖6），根際與非根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌差異明顯，其中根際為旁氏伯克霍爾德菌（Burkholderia Paraburkholderia）、放線菌（Actinospica）、熱孢子絲菌（Thermosporothrix）3種，而非根際土壤則為水蛭桿菌（Mizugakiibacter）、嗜酸棲熱菌屬（Acidothermus）2種。并發(fā)現(xiàn)常規(guī)施肥處理C在非根際0-20 cm土壤與非根際20-40 cm土壤有兩個(gè)特異菌，分別為克羅斯耶拉菌（Crossiella）與羅爾斯頓菌（Ralstonia）。并從圖7的組間硝化螺旋菌門顯著性差異比較發(fā)現(xiàn)，非根際0-20 cm土壤的硝化螺旋菌門豐度較高，與對(duì)照比較，根際土壤各處理之間無(wú)顯著性差異；根際土壤的各施肥處理與非根際0-20 cm土壤的CK處理差異極顯著；非根際0-20 cm土壤的減氮處理A、B與CK差異極顯著，非根際20-40 cm土壤的減氮A、B處理與非根際0-20 cm土壤CK處理差異極顯著。

圖4 不同土壤樣品OTUs分布的Venn圖Fig.4 Venn diagrams of OTUs distribution of different soil samples

圖5 門水平的細(xì)菌組成聚類堆積圖Fig.5 Cluster stacking graph of bacteria composition at phylum level

圖6 屬分類水平的細(xì)菌組成聚類堆積圖Fig.6 Cluster stacking graph of bacteria composition at genus level

圖7 組間硝化螺旋菌門顯著性差異統(tǒng)計(jì)圖Fig.7 Statistical chart of significant difference with Nitrospirae between groups

2.5 減氮處理土壤樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性 分析

采用主坐標(biāo)分析方法對(duì)各處理組土壤樣品的細(xì)菌在屬分類水平上進(jìn)行分析，評(píng)估細(xì)菌群落間的差異。從圖8可以看出，主成分1（PC1）和主成分2（PC2）對(duì)固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變異的解釋量分別為35%和19.34%，A20、CK20與C40、CK40樣本相較與其他樣本而言分布較為分散，樣品間距離較遠(yuǎn)。

圖8 各土壤樣品細(xì)菌群落主坐標(biāo)分析Fig.8 PCoA analysis of bacteria in different soil samples

2.6 減氮處理對(duì)茶園土壤碳通量的影響

土壤碳通量變化與土壤微生物變化密切相關(guān)，對(duì)不同減氮處理后茶園的土壤碳通量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖9所示。以減氮處理B的土壤碳通量較高，為2.70 μmol/m2/s；常規(guī)施肥 C 處理次之，為2.63 μmol/m2/s；對(duì)照處理最低，為2.02 μmol/m2/s；各處理間差異不顯著。

圖9 減氮處理對(duì)茶園土壤碳通量的影響Fig.9 Effect of nitrogen reduction on soil carbon flux in tea garden

3 討論

Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)能夠克服傳統(tǒng)檢測(cè)方法的缺陷，具有通量高、錯(cuò)誤率低、成本低、流程自動(dòng)化、速度快等優(yōu)勢(shì)。已被廣泛用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究。本研究采用高通量Illumina Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)茶樹(shù)地下部分微生物進(jìn)行系統(tǒng)分析，能真實(shí)全面地了解土壤及根際微生物的組成情況。施氮能促進(jìn)茶樹(shù)生長(zhǎng)，茶葉葉面積指數(shù)增加，提高茶葉產(chǎn)量，本研究結(jié)果表明施氮能提高茶樹(shù)的茶葉葉面積指數(shù)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)減氮處理B的茶園土壤固氮細(xì)菌組成增加，茶樹(shù)地下部分的根際微生物多樣性增加。從而推測(cè)施氮量為26 kg/667 m2（減氮處理B）的處理有利于土壤中氮素循環(huán)平衡與氮素固定［19］，也有利于維持土壤微生物平衡。本研究結(jié)果表明施肥處理后茶園非根際土壤細(xì)菌多樣性與豐度均降低，推測(cè)氮素促使茶園土壤的變形菌門數(shù)量變多，從而改變了土壤的細(xì)菌群落構(gòu)成，這與李鳳霞等［20］的研究結(jié)果一致。各施肥處理茶樹(shù)地下部分在門水平上的優(yōu)勢(shì)菌基本為氮代謝相關(guān)菌類，如優(yōu)勢(shì)類群之一的變形菌門以及在根際的優(yōu)勢(shì)菌藍(lán)藻菌門（Cyanobacteria）［1］。其中施氮量為26 kg/667 m2（減氮處理B）的處理的Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和Shannon 指數(shù)結(jié)果表明0-20 cm土壤中細(xì)菌豐度較高，尤其是多樣性最高，而在非根際20-40 cm土壤中則是施氮量36 kg/667 m2（常規(guī)施肥C處理）的細(xì)菌多樣性顯著增高，這說(shuō)明適量施氮的茶園土壤細(xì)菌種類較多，并主要集中在養(yǎng)分利用的根際及周邊的土壤中，與吳海寧等［1］的結(jié)果一致，亦能和研究者課題組前期研究結(jié)果減氮處理B能保證常規(guī)施肥的產(chǎn)量，各施肥處理中以減氮處理B氮肥農(nóng)學(xué)效率最高，土壤養(yǎng)分剩余較少，氮肥的利用效率較高［16］相互印證。進(jìn)一步印證合理施氮條件下茶園土壤微生物的種群構(gòu)成、分布與數(shù)量及土壤養(yǎng)分具有良好的調(diào)節(jié)作用［21］。而施氮量36 kg/667 m2（常規(guī)施肥C處理）在非根際20-40 cm土壤中的多樣性較高，可能是由于在其非根際土壤中多了兩種特異菌：克羅斯耶拉菌與羅爾斯頓菌。主成分分析結(jié)果顯示CK40、C40樣本相較與其它樣本而言分布較為分散，樣品間距離較遠(yuǎn)，表明該土層攜帶更為豐富的物種多樣性，與Shannon指數(shù)的結(jié)果一致，其余樣品間的點(diǎn)距離比較近，說(shuō)明它們的固氮細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似。

組間硝化螺旋菌門顯著性差異統(tǒng)計(jì)情況表明，非根際土壤的硝化螺旋菌門較根際土壤豐度高，非根際土壤中以0-20 cm土壤的硝化螺旋菌門豐度較高，可能是由于茶園常年耕作的深度在20 cm左右，茶園土壤0-20 cm的土層較疏松，同時(shí)茶園的養(yǎng)分施用也集中在此土層，所以該土層的土壤微生物特別是固氮微生物較多。與對(duì)照比較，根際土壤各處理之間無(wú)顯著型差異；根際土壤的各施肥處理與非根際0-20 cm土壤的CK處理差異極顯著；非根際0-20 cm土壤的減氮處理A、B與CK差異極顯著，非根際20-40 cm土壤的減氮A、B處理與非根際0-20 cm土壤CK處理差異極顯著，而非根際土壤的常規(guī)施肥處理C與對(duì)照差異不顯著，亦說(shuō)明常規(guī)施肥處理C的土壤中豐度較高，可能是由于硝化螺旋菌門較多，說(shuō)明可能常規(guī)施肥處理C硝化作用較多，而茶樹(shù)偏好銨態(tài)氮［22］，不利于其養(yǎng)分的有效利用。土壤碳通量的結(jié)果顯示以減氮處理B的土壤二氧化碳通量指數(shù)最高，與高通量測(cè)序結(jié)果土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)分析的結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測(cè)序技術(shù)明確減氮處理B下的細(xì)菌種類較多，細(xì)菌豐度較高，并主要集中在養(yǎng)分吸收利用的根際及周邊土壤中，有利于茶園養(yǎng)分的吸收，土壤二氧化碳通量結(jié)果基本一致。雖然常規(guī)施肥處理C下的非根際20-40 cm土壤中細(xì)菌多樣性較多，但其中一部分為克羅斯耶拉菌與羅爾斯頓菌以及促進(jìn)硝化作用的硝化螺旋菌門，不利于養(yǎng)分的吸收與轉(zhuǎn)化，長(zhǎng)期過(guò)量施用氮肥對(duì)茶園土壤生態(tài)系統(tǒng)不利。這為進(jìn)一步探討氮肥施用效率機(jī)制及開(kāi)發(fā)微生物肥料奠定了基礎(chǔ)。