於 亭，魏慧霞，田慶梅，紀(jì)海峰，宋繼科,3,4，解孝鋒

0引言

目前我國(guó)已成為世界第一近視大國(guó)，并且近視已成為世界范圍內(nèi)的主要公共衛(wèi)生問題。Holden等[1]預(yù)測(cè)，到2050年，將有47.58億近視患者(占世界人口的49.8%)和9.38億高度近視患者(占世界人口的9.8%)。目前造成近視的原因尚不明確[2]，對(duì)近視的治療仍以矯正視力的方法為主，但現(xiàn)有的治療方法尚不能解決近視增長(zhǎng)率逐年增加的問題[3]。近視的發(fā)生發(fā)展主要與眼軸過度增長(zhǎng)相關(guān)，其中脈絡(luò)膜作為視網(wǎng)膜和鞏膜之間的高度血管化層，其獨(dú)特位置可將視網(wǎng)膜信號(hào)傳遞至鞏膜，在近視的發(fā)展中起重要作用[4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[5]及臨床研究[6-7]也已證實(shí)脈絡(luò)膜與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近來在近視研究中發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照相比，在眼軸大于26mm的高度近視患者中內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的血清濃度發(fā)生改變，提示ET-1可能參與近視發(fā)展，但其機(jī)制尚未完全明確[8]。而脈絡(luò)膜作為眼內(nèi)高度血管化組織可能受到血管收縮因子ET-1的影響參與近視發(fā)生發(fā)展。針刺疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)暢氣血，使經(jīng)脈之氣血旺盛通達(dá)[9]。大量臨床實(shí)踐證實(shí)，針刺治療近視相比其他治療方案顯示出更加顯著效果[10-14]，但目前針刺治療近視，仍多停留在臨床研究水平，且其效應(yīng)機(jī)制不清楚。本研究擬建立透鏡誘導(dǎo)型近視豚鼠模型，探討近視發(fā)展過程中豚鼠脈絡(luò)膜毛細(xì)血管血流密度和脈絡(luò)膜ET-1及其受體表達(dá)變化，并通過電針干預(yù)治療初步闡釋其對(duì)近視的治療作用。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用雄性健康英國(guó)種三色短毛豚鼠(濟(jì)南西嶺角生物科技有限公司)，體質(zhì)量100～120g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物入組前均排除白內(nèi)障、角膜病變、近視等眼病。飼養(yǎng)條件：室溫保持22℃～25℃，予以12h/12h的晝夜節(jié)律，環(huán)境光照300Lx。實(shí)驗(yàn)期間所有豚鼠自由攝食、進(jìn)水，并給予富含維生素的飼料及新鮮蔬菜等以補(bǔ)充維生素C。實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格遵守視覺與眼科動(dòng)物研究協(xié)會(huì)原則，并且經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.1.2主要儀器及試劑10g/L鹽酸環(huán)噴脫酯滴眼液(愛爾康中國(guó)眼科產(chǎn)品有限公司，北京)；4g/L鹽酸奧布卡因(日本參天制藥株式會(huì)社，日本)；組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(含基因組去除劑)、化學(xué)修飾熱啟動(dòng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(思科捷科學(xué)儀器有限公司，山東)；ET-1、ETAR、ETBR試劑盒(江萊生物科技有限公司，上海)；ET-1一抗(博奧森生物技術(shù)有限公司，北京)；ET-1二抗(思科捷科學(xué)儀器有限公司，山東)；熒光倒置顯微鏡(Leica DM IL LED)；帶狀光檢影鏡(蘇州六六視覺科技股份有限公司)；眼科超聲診斷儀(Quantel Medical Ophthalmology公司，法國(guó))；光學(xué)相干斷層掃描儀(SpectralisHRA+OCT，海德堡公司，德國(guó))；Elx800 酶標(biāo)儀(BioTek，美國(guó))；針灸針(華佗牌蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，電子診療儀(華佗牌SDZ-V型，蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)。

1.2方法

1.2.1造模及分組45只豚鼠，隨機(jī)均分為正常對(duì)照(normal control，NC)組、透鏡誘導(dǎo)(lens-induced myopia，LIM)組、電針+透鏡誘導(dǎo)(lens-induced myopia+electroacupuncture，LIM+EA)組，每組15只。NC組豚鼠正常飼養(yǎng)，不干預(yù)；LIM組豚鼠使用醫(yī)用膠帶將-6.00D透鏡片配戴于豚鼠右眼，以建立近視模型，左眼不干預(yù)，見圖1；LIM+EA組在右眼透鏡誘導(dǎo)近視，左眼不干預(yù)，同時(shí)給予雙側(cè)合谷穴和太陽穴針刺，每天固定于上午9∶00開始電針治療，干預(yù)30min，早、晚巡視，及時(shí)發(fā)現(xiàn)脫落及臟的鏡片，清洗干凈后及時(shí)戴上，左眼為自身對(duì)照不干預(yù)。電針參數(shù)：連續(xù)波，頻率2Hz，強(qiáng)度2mA，脈沖長(zhǎng)度0.1s。

1.2.2檢影驗(yàn)光各組豚鼠于2、4wk行帶狀檢影驗(yàn)光檢查。檢查前結(jié)膜囊內(nèi)用10g/L鹽酸環(huán)噴脫酯滴眼液滴眼3次，每次1滴，間隔10min，滴眼后30min由同一驗(yàn)光師在暗室中進(jìn)行檢影驗(yàn)光，屈光度為垂直和水平兩條主子午線檢驗(yàn)的平均值。

1.2.3A超檢測(cè)眼軸長(zhǎng)度由眼科A超測(cè)量，檢查前以4g/L鹽酸奧布卡因滴眼液進(jìn)行表面麻醉。眼科超聲診斷儀參數(shù)設(shè)置：前房傳播速度1557m/s，玻璃體傳播速度1540m/s，晶狀體傳播速度1723m/s。測(cè)量時(shí)探頭垂直角膜平面，且盡可能對(duì)準(zhǔn)瞳孔中心，不壓迫角膜，取圖形較穩(wěn)定、清晰且晶狀體后囊膜和視網(wǎng)膜雙峰均高于基線為確定圖像，每眼重復(fù)測(cè)量10次，取平均值。整個(gè)過程均由同一技師操作完成。

1.2.4OCTA檢查各組豚鼠于2、4wk行OCTA檢查。檢查前結(jié)膜囊內(nèi)用10g/L鹽酸環(huán)噴脫酯滴眼液滴眼3次，每次1滴，間隔10min，滴眼后30min進(jìn)行檢測(cè)。由一人將豚鼠固定于OCT頜架合適位置，另一人按照設(shè)備使用方法對(duì)豚鼠眼球后極部進(jìn)行掃描。選擇870nm波長(zhǎng)，以視盤中心為中心，選擇1.5mm×3mm大小進(jìn)行拍攝。脈絡(luò)膜毛細(xì)血管定義為Bruch膜至膜下20μm，選取圖像質(zhì)量大于30的圖像，使用Image J 1.8.0軟件進(jìn)行測(cè)量。首先截取圖片，然后將圖片二值化(圖2B)，分析血流面積(圖2中白色高亮部分)與全部面積的比值。每只豚鼠測(cè)量3次，取平均值。測(cè)量過程均由兩位醫(yī)師在OCT檢查室內(nèi)進(jìn)行操作完成。

圖2 OCTA圖像 A：以視盤為中心，選擇1.5mm×3mm大小進(jìn)行檢測(cè)；B：脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層血管造影圖像。

1.2.5q-PCR 造模2、4wk后每組隨機(jī)選取3只豚鼠，麻醉致死后取出右眼眼球，沿角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體等眼前節(jié)組織，剝離玻璃體，使用虹膜刮去除視網(wǎng)膜，獲取脈絡(luò)膜組織。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用q-PCR技術(shù)檢測(cè)ET-1、ETAR和ETBR mRNA表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參基因。利用DNAStar 7.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，并由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。采用2-△△Ct方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，將NC組目的基因的相對(duì)表達(dá)量設(shè)置為1。

表1 ET-1、ETAR和ETBR引物序列

1.2.6ELISA檢測(cè)造模后2、4wk，每組取3只豚鼠，麻醉致死后分離右眼脈絡(luò)膜組織。使用液氮研磨，按質(zhì)量體積比(20mg∶200μL)加入含苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride，PMSF)的放射免疫沉淀法緩沖液裂解液(radio immunoprecipitation assay buffer,RIPA)，充分勻漿直至裂解完全，14000r/min離心4min，取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。按照酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒步驟檢測(cè)ET-1、ETAR和ETBR蛋白表達(dá)水平。

1.2.7免疫組化檢測(cè)造模4wk后，每組取3只豚鼠，麻醉致死后在12∶00方向用墨水做標(biāo)記，分離右眼球，剔除多余組織，置于眼球固定液中固定24h后進(jìn)行石蠟包埋。于視神經(jīng)前0.5mm處進(jìn)行5μm切片,梯度乙醇水化,超純水浸泡5min，水浴鍋加檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(95℃ 15min)進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS清洗。正常山羊血清封閉，依次加入一抗(1∶100)、二抗(1∶200)進(jìn)行孵育，DAB顯色(1min 22s)，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察、拍照。以細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)淡黃色或深棕色顆粒沉積者為染色陽性反應(yīng)。各組豚鼠隨機(jī)選取5張切片,每張切片在20倍鏡下隨機(jī)采集視野。

2結(jié)果

2.1屈光度和眼軸各組右眼屈光度在不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=1230.509，P時(shí)間<0.001；F組間=737.843，P組間<0.001；F組間×?xí)r間=222.284，P組間×?xí)r間<0.001)。造模后2、4wk，與NC組右眼相比，LIM組、LIM+EA組右眼近視屈光度均增加(均P<0.001)。造模后2、4wk，與LIM組右眼相比，LIM+EA組右眼近視屈光度減小(均P<0.01)，見表2。

表2 造模2、4wk后豚鼠屈光度和眼軸比較

各組右眼眼軸在不同時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=1463.554，P時(shí)間<0.001；F組間=52.529，P組間<0.001；F組間×?xí)r間=15.150，P組間×?xí)r間<0.001)。造模后2、4wk，與NC組右眼相比，LIM組、LIM+EA組右眼眼軸均增加(均P<0.001)。

造模后2、4wk，與LIM組右眼相比，LIM+EA組右眼眼軸均減小(P<0.05，<0.01)，見表2。

2.2脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度OCTA結(jié)果表明，造模2、4wk后，各組脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2wk：F=5.645，P<0.05；4wk：F=16.563，P<0.001)。造模2、4wk后，與NC組(2wk：28.74%±4.11%，4wk：27.64%±2.91%)相比，LIM組右眼脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度降低(2wk：23.43%±3.9%，P<0.01；4wk：21.29%±2.17%，P<0.001)。造模2、4wk后，與LIM組相比，LIM+EA組右眼脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度升高(2wk：27.66%±1.43%，P<0.05；4wk：25.28%±2.39%，均P<0.01)。造模2、4wk后，與NC組相比，LIM+EA組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 造模2、4wk時(shí)脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度 aP<0.05，bP<0.01 vs LIM組。

2.3ET-1和ETAR及ETBRmRNA表達(dá)水平PCR結(jié)果表明，不同時(shí)間點(diǎn)各組右眼脈絡(luò)膜中ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2wk：FET-1=15.086，PET-1<0.01；FETAR=7.331，PETAR<0.05；FETBR=9.368，PETBR<0.05；4wk：FET-1=17.844，PET-1<0.01；FETAR=37.084，PETAR<0.001；FETBR=20.153，PETBR<0.05)。造模2、4wk后，與NC組相比，LIM組ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與LIM組相比，LIM+EA組ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達(dá)水平降低(2wk：ETAR，P>0.05；其余均為P<0.05)；與NC組相比，LIM+EA組ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖4 造模2、4wk時(shí)ET-1、ETAR、ETBR mRNA表達(dá)水平 aP<0.05，bP<0.01 vs LIM組。

2.4ET-1和ETAR及ETBR蛋白表達(dá)水平ELISA結(jié)果表明，不同時(shí)間點(diǎn)各組右眼脈絡(luò)膜中ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2wk：FET-1=15.464，PET-1<0.01；FETAR=6.098，PETAR<0.05；FETBR=15.988，PETBR<0.01；4wk：FET-1=25.829，PET-1<0.01；FETAR=49.759，PETAR<0.001；FETBR=12.391，PETBR<0.01)。造模后2、4wk，與NC組相比，LIM組右眼脈絡(luò)膜中ET-1、ETAR、ETBR蛋白表達(dá)水平升高(均P<0.05)；與LIM組相比，LIM+EA組ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表達(dá)水平降低(2wk：ETAR，P>0.05；其余均為P<0.05)；與NC組相比，LIM+EA組ET-1、ETAR、ETBR 蛋白表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 造模2、4wk后脈絡(luò)膜ET-1、ETAR、ETBR蛋白表達(dá)水平

2.5免疫組化檢測(cè)脈絡(luò)膜ET-1蛋白造模后4wk可見，ET-1免疫陽性反應(yīng)呈棕色,脈絡(luò)膜胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)。NC組中脈絡(luò)膜ET-1免疫反應(yīng)呈棕色，且血管排列整齊有序；LIM組中脈絡(luò)膜ET-1免疫反應(yīng)較強(qiáng)，著色較深，且血管排列紊亂不齊；LIM+EA組中脈絡(luò)膜ET-1免疫反應(yīng)呈棕色，且血管排列相對(duì)整齊，見圖5。

圖5 造模后4wk時(shí)ET-1蛋白在脈絡(luò)膜中的表達(dá) A：NC組；B：LIM組；C：LIM+EA組。

3討論

豚鼠屬于哺乳動(dòng)物，由于其屈光狀態(tài)、正視化機(jī)制與人類相似，常用于制作近視模型[10-11]，并且豚鼠透鏡誘導(dǎo)型模型已廣泛應(yīng)用于近視的實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)采用負(fù)透鏡誘導(dǎo)豚鼠制備近視模型，研究模擬人眼在近距離工作狀態(tài)下近視發(fā)生發(fā)展中的作用，為本研究奠定了模型基礎(chǔ)。

ET-1是于1988年首次從豬主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中分離出來一種有效的血管收縮劑[15]，是評(píng)估眼內(nèi)血?jiǎng)恿Φ挠杏脴?biāo)志，在角膜上皮、睫狀體、脈絡(luò)膜以及視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)[16]。近來，有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)ET-1含量在高度近視兒童和青少年血清中含量發(fā)生改變[8]。與眼軸小于26mm的近視患者相比，在眼軸大于26mm的患者中發(fā)現(xiàn)ET-1血清濃度顯著降低，并且ET-1濃度與眼軸長(zhǎng)度呈弱負(fù)相關(guān)，提示ET-1的水平變化可能影響近視發(fā)展[8]。ET-1屬于內(nèi)源性血管收縮因子，是評(píng)估眼內(nèi)血流動(dòng)力學(xué)的有用標(biāo)志物，并且ET-1在眼內(nèi)分布廣泛，脈絡(luò)膜中水平最高[17]。ET-1主要通過與ETAR和ETBR結(jié)合而發(fā)揮血管收縮作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)ET-1可以通過調(diào)節(jié)眼收縮，以調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血流[8]。而豚鼠作為無視網(wǎng)膜血管哺乳動(dòng)物[18]，其血液以及氧氣供應(yīng)的主要來源是脈絡(luò)膜[4]。研究已發(fā)現(xiàn)，向健康男性注射ET-1后會(huì)降低脈絡(luò)膜的血流[19]。并且越來越多的證據(jù)也表明近視發(fā)展過程中脈絡(luò)膜血流會(huì)降低[6,20-21]。提示ET-1可能會(huì)通過影響脈絡(luò)膜血流參與近視的發(fā)生發(fā)展。而在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在近視發(fā)展過程中，隨著脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度降低，血流下降的同時(shí)ET-1表達(dá)水平明顯上調(diào)，符合我們的猜測(cè)。

在解剖學(xué)上，脈絡(luò)膜是由毛細(xì)血管和中大血管組成，其中血管是不斷暴露于脈動(dòng)血流和壓力引起的各種類型的血?jiǎng)恿χ?，而作為與血液直接接觸的單層，血管內(nèi)皮細(xì)胞承受著大部分流體剪切應(yīng)力[22]。剪切力可以通過刺激血管擴(kuò)張劑的產(chǎn)生對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生保護(hù)作用[23]，并且研究發(fā)現(xiàn)剪切力的變化會(huì)改變ET-1的表達(dá)[24]。先前已有研究報(bào)道，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管的血流與近視程度負(fù)相關(guān)[25]。此外，Zhang等[5]在近視豚鼠中發(fā)現(xiàn)，隨著近視程度的加深脈絡(luò)膜血流逐漸降低，而Gupta等[20]在人類高度近視眼中也發(fā)現(xiàn)脈絡(luò)膜血管成分的減少。Al-Sheikh等[6]研究發(fā)現(xiàn)與正常組相比，在近視眼中脈絡(luò)膜毛細(xì)血管血流面積顯著降低。Milani等[26]在高度近視患者中也發(fā)現(xiàn)，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管灌注區(qū)減少，脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度降低。提示脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度與近視密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在近視發(fā)展中脈絡(luò)膜毛細(xì)血管密度降低。而脈絡(luò)膜血流的減少會(huì)影響血管剪切力，這可能會(huì)影響ET-1的表達(dá)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，隨著近視的發(fā)生發(fā)展脈絡(luò)膜變薄，ET-1及其受體表達(dá)水平明顯上調(diào)，可能是ET-1通過與ETAR和ETBR結(jié)合引起了脈絡(luò)膜血管的收縮，導(dǎo)致脈絡(luò)膜血流降低影響近視的發(fā)展。

目前對(duì)于近視的治療手段十分有限，而針刺在臨床[12-13]和動(dòng)物[10-11]中已證實(shí)可以改善近視發(fā)展，但具體機(jī)制尚未明確。有研究發(fā)現(xiàn)針刺后可以降低眼周血管平滑肌緊張度，解除睫狀肌痙攣，加快血流速度，改善消除缺血和缺氧狀態(tài)，而有利于眼緩解視疲勞癥狀[12]。因此，我們猜測(cè)電針可以改善脈絡(luò)膜血液循環(huán)。

脈絡(luò)膜主要是處于交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)調(diào)控之下[27]。目前研究發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物和鳥類的脈絡(luò)膜主要分布三種神經(jīng)纖維：(1)來自翼腭神經(jīng)節(jié)(pterygopalatine ganglion，PPG)和睫狀神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生的副交感神經(jīng)纖維；(2)來自頸上神經(jīng)節(jié)產(chǎn)生的交感神經(jīng)纖維；(3)來自三叉神經(jīng)節(jié)的感覺纖維。其中哺乳動(dòng)物中的PPG是從面部核運(yùn)動(dòng)復(fù)合物的唾液上核(superior salivatory nucleus,SSN)接收輸入的[28]。Linder[29]在出血性低血壓兔子中發(fā)現(xiàn)，面部神經(jīng)刺激可使脈絡(luò)膜血流升高。先前的研究也表明，下丘腦支核的血液壓力敏感位點(diǎn)可輸入到SSN的脈絡(luò)膜神經(jīng)元，由SSN-PPG通路介導(dǎo)部分對(duì)脈絡(luò)膜血管舒張性補(bǔ)償[27]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)電針刺激大鼠脈絡(luò)膜血管的副交感神經(jīng)節(jié)前纖維細(xì)胞體的SSN,可使眼底血流增加[30]。提示，電針可通過SSN-PPG通路提高近視發(fā)展中的脈絡(luò)膜血流。因此，我們猜測(cè)電針干預(yù)治療后，通過SSN-PPG通路改善了脈絡(luò)膜的血流，影響了血管剪切力下調(diào)ET-1及其受體含量，延緩近視的發(fā)生發(fā)展。本研究中，我們也觀察到電針干預(yù)后脈絡(luò)膜毛細(xì)血管血流密度上升，改善了脈絡(luò)膜血流，下調(diào)ET-1及其受體含量。然而，具體信號(hào)分子及發(fā)展機(jī)制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步研究。其中，脈絡(luò)膜血流將是我們今后研究的重點(diǎn)，不斷探索電針治療近視與脈絡(luò)膜血流變化之間的內(nèi)在相關(guān)性，為近視的治療提供有效的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。