郭 寧，阿依努·努拉厚，卜 倩，瀏 夢(mèng)，王 雁

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病微血管常見(jiàn)并發(fā)癥之一，導(dǎo)致患者視力受損。DR的特征是毛細(xì)血管周細(xì)胞早期丟失和基底膜增厚，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)度增殖和血管生成，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)能夠促進(jìn)血管生成，VEGFA的異常表達(dá)水平可加重病理性血管生成和DR的發(fā)生[1]。目前DR的主要治療手段有玻璃體腔注射抗VEGF藥物、激光治療、類固醇療法及玻璃體切除術(shù)等[2]。但實(shí)踐證明這些治療手段僅可預(yù)防或暫時(shí)緩解視力喪失。因此，亟需探究DR治療的新的治療靶標(biāo)和方法。微小RNA(miRNA)是一類小的非編碼RNA，通過(guò)降解或阻斷信使RNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)。研究表明，miRNA通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)、視網(wǎng)膜新生血管形成及神經(jīng)元凋亡和變性對(duì)DR的早期治療具有一定作用[3-4]。另有研究發(fā)現(xiàn)miR-373與眼底疾病具有一定的相關(guān)性[5-6]。然而，miR-373是否參與DR發(fā)生發(fā)展目前罕見(jiàn)報(bào)道。此外，通過(guò)Mirtarbase網(wǎng)站預(yù)測(cè)到miR-373與VEGFA 3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，因此，本研究主要探討miR-373在DR視網(wǎng)膜組織中的表達(dá)及其靶向VEGFA對(duì)DR的影響。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～220g，7周齡，購(gòu)買且飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)北校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號(hào)：SCXK(新)2018-0002，SYXK(新)2018-0003]。本研究符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理要求，經(jīng)倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

1.1.2主要試劑和儀器設(shè)備293T細(xì)胞購(gòu)于無(wú)錫欣潤(rùn)生物科技有限公司；RPMI-1640、胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；蘇木精伊紅(HE)染色試劑盒、BCA試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技；miR-373 agomir、agomir-NC、miR-373 mimic、mimic-NC購(gòu)于上海艾博思生物科技有限公司；突變型VEGFA 3’UTR、野生型VEGFA 3’UTR購(gòu)于廣州輝駿生物科技股份有限公司；Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、β肌動(dòng)蛋白(β-actin)兔抗大鼠單克隆抗體(ab32503、ab115777)、VEGFA、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl-2)兔抗鼠多克隆抗體(ab46154、ab194583)購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、磷酸化-磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、磷酸化-絲蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)兔抗大鼠多克隆抗體(GTX100462、GTX132597、GTX121937、GTX128414)、山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗(GTX213110-01)購(gòu)于GeneTex公司；Dual-Luciferase Reporter System購(gòu)于Promega公司；Lipofectamine 2000、TRIzolTM、SuperScript Ⅳ反轉(zhuǎn)錄酶、PowerUp SYBR Green預(yù)混液購(gòu)于賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。主要儀器：血糖儀(上海羅氏制藥有限公司)；切片機(jī)(上海萊卡儀器有限公司)；全自動(dòng)酶標(biāo)儀、ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；正立金相顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1造模、分組與給藥將40只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(10只)和DR組(30只)，DR組大鼠腹腔注射60mg/kg鏈脲霉素(STZ，10g/L)誘導(dǎo)糖尿病；對(duì)照組注射等量檸檬酸鹽緩沖液。注射STZ 72h后，尾靜脈取血檢測(cè)血糖，血糖值≥16.7mmol/L提示糖尿病大鼠建模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)、miR-373 agomir組(10只)、agomir-NC組(10只)，miR-373 agomir組和agomir-NC組大鼠分別于右眼玻璃體腔注射200μL miR-373 agomir(200nmol)和agomir-NC(200nmol)，每周1次，共處理12wk；模型組大鼠右眼采用玻璃體腔注射200μL生理鹽水，每周1次，共處理12wk。每月記錄各組大鼠體質(zhì)量，并通過(guò)血糖儀檢測(cè)各組大鼠血糖值。

1.2.2HE染色觀察視網(wǎng)膜病變情況處理12wk后，每組大鼠用30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，摘取右眼眼球，并迅速剝離視網(wǎng)膜組織進(jìn)行冷凍儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?jīng)固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精伊紅染色，脫水，透明，中性樹(shù)脂封固，鏡下觀察。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中相關(guān)mRNA表達(dá)水平處理12wk后，取每組大鼠視網(wǎng)膜組織100mg加入1mL TRIzolTM試劑，提取總RNA，合成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：cDNA 200ng；正向引物(10μmol/L) 0.5μl；反向引物(10μmol/L) 0.5μL；10×HA Buffer 2.0μL；2×PowerUp SYBR Green Master Mix 10μL；加入ddH2O至20μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃ 5min 1個(gè)循環(huán)；變性94℃ 15s，退火58℃ 20s，延伸72℃ 1min，共40個(gè)循環(huán)；補(bǔ)充延伸72℃ 5min 1個(gè)循環(huán)。以U6和β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析。引物序列：miR-373上游引物5’-GCCAGAAGTGCTTCGATTTTG-3’，下游引物5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；VEGFA上游引物5’-TGGCTCACTGGCTTGCTCTA-3’，下游引物5’-ATCCAACTGCACCGTCACAG-3’；β-actin上游引物5’-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3’，下游引物5’-ACTAAGTCATAGTCCGCCTAGA-3’。

1.2.4雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-373與VEGFA靶向關(guān)系將293T細(xì)胞接種到24孔板中，并使用Lipofectamine 2000將野生型VEGFA 3’UTR或突變型VEGFA 3’UTR與miR-373 mimic共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞，同時(shí)轉(zhuǎn)染mimic-NC與野生型VEGFA 3’UTR或突變型VEGFA 3’UTR為對(duì)照，轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞裂解，并根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒測(cè)量熒光素酶活性。相對(duì)熒光素酶活性=海腎熒光素酶活性/螢火蟲熒光素酶活性。

1.2.5Western-blot檢測(cè)視網(wǎng)膜組織中相關(guān)蛋白表達(dá)水平處理12wk后，取各組大鼠視網(wǎng)膜組織100mg，分別加入RIPA裂解液，離心，收集上清，采用BCA試劑盒測(cè)定蛋白含量。取50μg蛋白液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉，分別加入一抗VEGFA(1∶500)、Bax(1∶2000)、Bcl-2(1∶2000)、PI3K(1∶2000)、p-PI3K(1∶2000)、AKT(1∶2000)、p-AKT(1∶2000)、β-actin(1∶10000)4℃過(guò)夜，加入二抗(1∶10000)室溫孵育1h。ECL曝光成像，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照，以Image J圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。以β-actin為內(nèi)參，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間或組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1DR大鼠模型評(píng)價(jià)造模前后，兩組大鼠體質(zhì)量和血糖濃度比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(體質(zhì)量：F時(shí)間=56.147，P時(shí)間<0.001；F組間=1385.833，P組間<0.001；F交互=81.619，P交互<0.001；血糖濃度：F時(shí)間=99.852，P時(shí)間<0.001；F組間=760.987，P組間<0.001；F交互=119.360，P交互<0.001)。造模前，對(duì)照組大鼠體質(zhì)量和血糖濃度與DR組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模4、8、12wk后大鼠無(wú)死亡，DR組大鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，血糖濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.001)，見(jiàn)表1。HE病理切片結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)病理性變化，DR組大鼠視網(wǎng)膜水腫，細(xì)胞分層模糊且排列紊亂，提示DR大鼠模型建立成功，見(jiàn)圖1。

圖1 兩組大鼠視網(wǎng)膜病理切片結(jié)果 A：對(duì)照組；B：DR組，箭頭表示細(xì)胞核固縮及組織排列紊亂。

表1 兩組大鼠造模前后體質(zhì)量及血糖濃度

2.2各組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-373和VEGFAmRNA表達(dá)水平對(duì)照組、模型組、agomir-NC組和miR-373 agomir組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-373表達(dá)水平(1.00±0.06、0.34±0.03、0.34±0.03、4.37±0.15)和VEGFA mRNA表達(dá)水平(1.00±0.09、3.54±0.17、3.52±0.19、1.50±0.24)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5513.582、536.590，均P<0.001)。與對(duì)照組比，模型組和agomir-NC組大鼠視網(wǎng)膜組織miR-373表達(dá)水平顯著下降，VEGFA mRNA含量顯著升高(P<0.05)；與agomir-NC組比，miR-373 agomir組視網(wǎng)膜組織miR-373表達(dá)水平顯著升高，VEGFA mRNA含量顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中miR-373和VEGFA mRNA表達(dá)水平 A：miR-373表達(dá)水平；B：VEGFA mRNA表達(dá)水平。aP<0.05 vs 對(duì)照組；cP<0.05 vs agomir-NC組。

2.3miR-373對(duì)大鼠體質(zhì)量和血糖濃度及視網(wǎng)膜組織病理變化的影響處理12wk后，agomir-NC組大鼠體質(zhì)量為171.29±15.16g，血糖濃度為21.41±2.67mmoL/L，miR-373 agomir組大鼠體質(zhì)量為264.62±14.02g，血糖濃度為17.22±0.30mmoL/L，與agomir-NC組比，miR-373 agomir組大鼠體質(zhì)量顯著升高(t=14.292，P<0.001)，血糖濃度顯著下降(t=4.927，P<0.001)。HE病理切片結(jié)果顯示，視網(wǎng)膜組織水腫情況得到緩解，細(xì)胞分層較為清晰，且排列較為整齊，見(jiàn)圖3。

圖3 miR-373 agomir對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織病理變化的影響 A：agomir-NC組，箭頭表示細(xì)胞核固縮及組織排列紊亂；B：miR-373 agomir組。

2.4各組大鼠視網(wǎng)膜組織Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況對(duì)照組、模型組、agomir-NC組和miR-373 agomir組大鼠視網(wǎng)膜組織Bax蛋白表達(dá)量(0.20±0.03、0.97±0.05、0.98±0.05、0.55±0.05)和Bcl-2蛋白表達(dá)量(1.00±0.06、0.22±0.02、0.23±0.03、0.46±0.04)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=197.155、243.227，均P<0.001)。與對(duì)照組比，模型組和agomir-NC組大鼠視網(wǎng)膜組織Bax蛋白表達(dá)量顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.05)；與agomir-NC組比，miR-373 agomir組大鼠視網(wǎng)膜組織Bax蛋白表達(dá)量顯著下降，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

圖4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)情況 A：Western-blot檢測(cè)結(jié)果；B：Western-blot檢測(cè)結(jié)果量化分析。aP<0.05 vs 對(duì)照組；cP<0.05 vs agomir-NC組。

2.5miR-373靶向VEGFA 通過(guò)Mirtarbase網(wǎng)站(http：//mirtarbase.cuhk.edu.cn/php/index.php)預(yù)測(cè)到miR-373與VEGFA 3’UTR存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，miR-373 mimic顯著抑制野生型VEGFA 3’UTR熒光素酶活性，對(duì)突變型VEGFA 3’UTR熒光素酶活性無(wú)影響(圖5A)。Western-blot結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、agomir-NC組和miR-373 agomir組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGFA蛋白表達(dá)量(0.19±0.03、0.96±0.07、0.96±0.06、0.34±0.04)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=205.045，P<0.001)，與agomir-NC組比，miR-373 agomir組VEGFA蛋白表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖5B。

圖5 miR-373靶向VEGFA A：雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果,aP<0.05 vs mimic-NC組；B：Western-blot檢測(cè)結(jié)果，aP<0.05 vs 對(duì)照組；cP<0.05 vs agomir-NC組。

2.6miR-373對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響對(duì)照組、模型組、agomir-NC組和miR-373 agomir組大鼠視網(wǎng)膜組織PI3K蛋白表達(dá)量(1.12±0.04、1.03±0.11、1.02±0.11、1.02±0.10)和AKT蛋白表達(dá)量(0.93±0.09、0.90±0.10、1.00±0.10、1.00±0.10)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.755、0.806，均P>0.05)，p-PI3K蛋白表達(dá)量(0.10±0.01、0.80±0.10、0.74±0.07、0.38±0.02)和p-AKT蛋白表達(dá)量(0.10±0.01、1.20±0.10、1.20±0.12、0.40±0.04)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=83.216、145.211，均P<0.001)。與對(duì)照組比，模型組和agomir-NC組大鼠視網(wǎng)膜組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化，p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)；與agomir-NC組比，miR-373 agomir組大鼠視網(wǎng)膜組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化，p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著下降(均P<0.05)，見(jiàn)圖6。

圖6 miR-373對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 A：Western-blot檢測(cè)結(jié)果；B：Western-blot檢測(cè)結(jié)果量化分析。aP<0.05 vs 對(duì)照組；cP<0.05 vs agomir-NC組。

3討論

在我國(guó)，DR的發(fā)病率和患病率逐年上升，以毛細(xì)血管周細(xì)胞減少、內(nèi)皮細(xì)胞/基底膜增厚及血管新生為主要臨床特征，可分為增殖性和非增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變，其中增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變是導(dǎo)致25～65歲人群失明和視力損害的主要誘因[2]。目前研究表明DR的發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及炎癥、神經(jīng)元調(diào)亡、細(xì)胞增殖、分化等多種病理過(guò)程，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明[7]。目前，許多研究證實(shí)miRNA參與DR發(fā)生與發(fā)展，且可能成為DR的新生物標(biāo)志物[8-11]。如miR-204通過(guò)調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)的表達(dá)，抑制DR大鼠的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[8]。在DR體外模型中，miR-199a-3p通過(guò)靶向VEGF/PI3K/AKT信號(hào)通路抑制血管生成，miR-590-3p通過(guò)靶向NLRP1抑制NADPH氧化酶(NOX4)信號(hào)通路的激活，減少細(xì)胞焦亡[9-10]。Liu等[11]研究表明2型糖尿病(T2DM)誘發(fā)的DR患者血清中miR-221的表達(dá)明顯升高，與糖化血紅蛋白等代謝參數(shù)顯著正相關(guān)，且對(duì)DR的診斷準(zhǔn)確性高于血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)和VEGF。

miR-373位于染色體19q13.4.21，屬于miR-520/miR-373家族，該家族由3個(gè)不同的miRNA簇組成，分別是miR-302/miR-367、miR-371/miR-372/miR-373和miR-520[12]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miR-373可以通過(guò)調(diào)控特定基因在人類癌癥中發(fā)揮癌基因或抑癌基因的作用[13-14]。糖尿病視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的分子基礎(chǔ)涉及促凋亡和抗凋亡的基因，Bax是視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡的關(guān)鍵因素，也是保護(hù)受損視網(wǎng)膜神經(jīng)元的治療性基因策略的靶點(diǎn)之一。Bcl-2與視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，Bcl-2與Bax的表達(dá)比例對(duì)決定細(xì)胞壽命至關(guān)重要[15]。本研究結(jié)果表明，miR-373在DR大鼠視網(wǎng)膜組織中表達(dá)量下調(diào)，視網(wǎng)膜組織Bax蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少；過(guò)表達(dá)miR-373后，可以明顯降低DR大鼠血糖，抑制視網(wǎng)膜組織Bax蛋白表達(dá)并促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，改善DR。與Teng等[16]研究結(jié)果相同，該研究報(bào)道過(guò)表達(dá)miR-373可抑制細(xì)胞凋亡。結(jié)合Yang等[5]和Tian等[6]研究結(jié)果，我們推測(cè)miR-373可能參與DR的發(fā)病過(guò)程，上調(diào)miR-373表達(dá)可改善DR。VEGFA屬于VEGF家族，在血管生成、腫瘤生長(zhǎng)及缺血性疾病中扮演著重要角色，與其受體結(jié)合，激活PKC、NOS、AKT、MAPK等途徑誘導(dǎo)血管生成。同時(shí)，也有研究表明VEGFA在DR視網(wǎng)膜組織中可以通過(guò)促進(jìn)新生血管形成，從而促使DR發(fā)生發(fā)展[17]。VEGF抑制劑如雷珠單抗、阿柏西普、康柏西普等因具備促使視網(wǎng)膜新生血管萎縮，改善視功能預(yù)后等功能，目前在臨床上被廣泛應(yīng)用。本研究通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)到miR-373可以與VEGFA的3’UTR區(qū)互補(bǔ)結(jié)合，并且應(yīng)用雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了VEGFA是miR-373的直接靶點(diǎn)。提示miR-373可能通過(guò)下調(diào)VEGFA表達(dá)阻礙DR發(fā)生發(fā)展。結(jié)合Oltra等[18]研究結(jié)果表明采用miRNA降低VEGF可以作為治療DR的一種方法。

PI3K/AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞的增殖、凋亡和分化，是體內(nèi)重要的細(xì)胞信號(hào)通路，同時(shí)在葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原合成、糖酵解和糖異生的調(diào)節(jié)中也發(fā)揮重要作用。Fang等[19]研究指出根據(jù)KEGG通路數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)測(cè)可知，VEGF位于PI3K/AKT通路的下游，且Simó等[20]研究表明胰島素通過(guò)激活PI3K/AKT通路誘導(dǎo)小鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)VEGF轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而引起DR惡化。本研究發(fā)現(xiàn)DR大鼠過(guò)表達(dá)miR-373后，p-PI3K、p-AKT及VEGFA蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。上述結(jié)果提示，miR-373通過(guò)下調(diào)VEGFA的表達(dá)并抑制PI3K/AKT通路蛋白的表達(dá)，從而改善DR。這與Wang等[9]研究結(jié)果一致。

綜上所述，本研究在動(dòng)物水平上表明miR-373通過(guò)靶向VEGFA參與DR的病理生理過(guò)程，其機(jī)制可能與miR-373抑制PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，提示miR-373可能成為治療DR的一個(gè)潛在的新靶點(diǎn)。