明 媚，張 勁，羅 鋼，蔡麗英，梅 雪

0引言

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma，UM)作為成人眼部最為常見的起源于葡萄膜的惡性腫瘤，發(fā)病率高居眼部腫瘤的第二位，且近年來呈上升趨勢[1]。盡管現(xiàn)有診療手段不斷進步，但患者總體生存率依然較低，預(yù)后不佳[2]。研究發(fā)現(xiàn)，高增殖活性及易發(fā)生眼外轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致該腫瘤診療困難及死亡率高的主要原因，有超過90%的患者死于肝轉(zhuǎn)移[3]。高遷移率族蛋白A1(high mobility group A1，HMGA1)作為一種核蛋白，在細胞分化、轉(zhuǎn)移、胚胎形成及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用[4]，研究發(fā)現(xiàn)HMGA1蛋白在多種惡性腫瘤組織中呈高表達[5]。亦有研究指出，HMGA1參與了腫瘤細胞增殖及侵襲過程[6]，但其在UM中的作用鮮有報道。本研究分析UM組織中HMGA1蛋白表達，并觀察其與人UM細胞系M23增殖、遷移和侵襲的相關(guān)性，以期為UM的病理機制研究提供基礎(chǔ)資料。

1對象和方法

1.1對象選取2014-02/2019-08在我院接受手術(shù)治療的UM患者53例53眼，其中男29例29眼，女24例24眼；年齡28～76(平均48.36±11.14)歲；眼別：左眼25例，右眼28例；發(fā)生部位：睫狀體18眼，脈絡(luò)膜35眼；病理學(xué)類型：上皮細胞型19眼，梭形細胞型25眼，混合型9眼；35眼出現(xiàn)鞏膜浸潤。所有患者術(shù)前未行放化療治療，均行病理學(xué)檢查確診，于眼球摘除后，剝離腫瘤組織，甲醛固定，石蠟包埋保存。同期，留取因外傷摘除眼球的正常葡萄膜組織34例34眼，其中男20例，女14例，年齡26～77(平均48.07±10.92)歲；眼別：右眼19例，左眼15例。所有患者排除UM和其他腫瘤。兩組患者性別、年齡、眼別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，均衡可比。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，入選對象均知情同意。

1.2方法

1.2.1主要試劑和設(shè)備免疫組織化學(xué)試劑盒及試劑購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人HMGA1多克隆抗體購自英國Abcam公司，人UM細胞系M23購自上海烜雅生物科技有限公司，胎牛血清購自杭州四季青生物工程有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液、青霉素-鏈霉素購自美國Gibco公司，HMGA1干擾序列和陰性對照序列由上海美軒生物科技有限公司提供，HMGA1和內(nèi)參引物由上海生工生物公司設(shè)計合成，Trizol總RNA提取試劑盒和轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，CCK-8試劑購自武漢博士德生物工程有限公司，Transwell小室購自上海夏夷實業(yè)有限公司，Matrige基質(zhì)膠購自美國BD公司，StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測組織中HMGA1蛋白表達取組織石蠟標本，按4μm厚度連續(xù)切片，脫臘、水化，浸入枸櫞酸鹽緩沖液行加熱處理，PBS沖洗3次，浸入3%過氧化氫溶液，PBS沖洗3次，將一抗兔抗人HMGA1多克隆抗體1∶400稀釋后加入，過夜孵育(4℃)，PBS沖洗3次，加入HRP標記二抗，室溫反應(yīng)60min，PBS沖洗3次，經(jīng)顯色、復(fù)染、脫水、封片，顯微鏡下觀察，高倍鏡下隨機取5個視野，根據(jù)染色情況和陽性細胞比例進行判定[7]：(1)染色情況：不染色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分；(2)陽性細胞比例：≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，≥76% 4分；(3)將(1)和(2)評分相乘，≤3分為陰性(-)，>3分為陽性(+)。

1.2.3細胞培養(yǎng)和處理用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞。5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)24h，胰酶消化，傳代。待細胞融合度達到90%時，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行分組轉(zhuǎn)染，HMGA1下調(diào)組轉(zhuǎn)染HMGA1干擾序列(5’-GAGTCAGAAAGAGCCCAGT-3’)；陰性對照組轉(zhuǎn)染陰性對照序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)；空白組不作處理。各組轉(zhuǎn)染后按上述條件繼續(xù)培養(yǎng)48h。

1.2.4實時熒光定量PCR術(shù)檢測HMGA1mRNA表達取細胞，加入裂解液，提取總RNA并檢測濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，使用實時熒光定量PCR儀按擴增試劑盒說明進行擴增，引物序列：HMGA1：上游：5’-GCAGGAAAAGGATGGGACTG-3’，下游：5’-AGCAGGGCTTCCAGTCCCAG-3’；GAPDH：上游：5’-CTTCTTTTGCGTCGCCAGCCGA-3’，下游：5’-ACCAGGCGCCCAATACGACCAA-3’。反應(yīng)條件：95℃ 3min，95℃ 30s，60℃ 30s，74℃ 30s，連續(xù)36個循環(huán)。用2-△△Ct法計算HMGA1 mRNA表達量。

1.2.5CCK-8法檢測細胞增殖能力取各組細胞，胰酶消化，制備細胞懸液，接種于96孔板，5×104/孔，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0、24、48、72、96h時，向各孔加入CCK-8液20μL，利用酶標儀取450nm波長下對各孔檢測，記錄吸光度值(OD)，重復(fù)實驗3次，每次設(shè)置6個復(fù)孔。

1.2.6Transwell法檢測細胞遷移能力取各組細胞，胰酶消化，用無血清培養(yǎng)液制備單細胞懸液，密度為5×105/mL，取200μL加入Transwell小室上室，將含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液加入小室下室，繼續(xù)培養(yǎng)24h，將小室取出，PBS沖洗，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，將散落細胞拭去，鏡下觀察，隨機取5個高倍視野，對穿膜細胞進行計數(shù)[8]。

1.2.7Transwell法檢測細胞侵襲能力將Matrige基質(zhì)膠用培養(yǎng)液稀釋后，在Transwell小室上室內(nèi)進行均勻平鋪，過夜風干。其余步驟同1.2.5中Transwell實驗操作步驟。

2結(jié)果

2.1UM和正常葡萄膜組織中HMGA1蛋白表達UM組織中HMGA1蛋白陽性表達率為77%(41/53)，高于正常葡萄膜組織中的29%(10/34)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=19.630，P<0.001)，見圖1。

圖1 免疫組織法檢測UM和正常葡萄膜組織中HMGA1蛋白表達(SP) A：正常葡萄膜組織中HMGA1蛋白呈低表達；B：UM組織中HMGA1蛋白呈高表達。

2.2UM患者腫瘤組織中HMGA1蛋白表達情況HMGA1蛋白陽性表達率在不同年齡、性別、眼別、發(fā)生部位、視盤受累、繼發(fā)視網(wǎng)膜脫落、腫瘤高度和病理學(xué)類型患者中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但與未發(fā)生鞏膜浸潤、未累及睫狀體和未發(fā)生眼外生長的患者相比，HMGA1蛋白在發(fā)生鞏膜浸潤、累及睫狀體和發(fā)生眼外生長的患者腫瘤組織中陽性表達率升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 UM患者腫瘤組織中HMGA1蛋白表達情況眼(%)

2.3各組細胞中HMGA1表達HMGA1下調(diào)組、陰性對照組和空白組細胞中HMGA1 mRNA相對表達量分別為0.29±0.08、0.98±0.07和1.01±0.06，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=193.400，P<0.001)，HMGA1 mRNA在陰性對照組和空白組細胞中相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.431)，HMGA1 mRNA在HMGA1下調(diào)組細胞中相對表達量低于陰性對照組和空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4各組細胞增殖能力與陰性對照組和空白組相比，HMGA1下調(diào)組細胞培養(yǎng)24、48、72、96h時吸光度OD值降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組細胞不同時間點吸光度OD值比較

2.5各組細胞遷移能力各細胞遷移能力相比，陰性對照組和空白組遷移細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，HMGA1下調(diào)組遷移細胞數(shù)明顯少于陰性對照組和空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2，表3。

圖2 Transwell法檢測各組細胞遷移能力 A：HMGA1下調(diào)組；B：陰性對照組；C：空白組。

2.6各組細胞侵襲能力各組細胞侵襲能力相比，陰性對照組和空白組侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，HMGA1下調(diào)組侵襲細胞數(shù)明顯少于陰性對照組和空白組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3，表3。

圖3 Transwell法檢測各組細胞侵襲能力 A：HMGA1下調(diào)組；B：陰性對照組；C：空白組。

表3 各組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)比較個)

3討論

UM作為眼內(nèi)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于視網(wǎng)膜母細胞瘤，且惡性程度高、增殖力和侵襲力強，早期便可發(fā)生轉(zhuǎn)移[9]，有研究指出，轉(zhuǎn)移特別是突破眼眶的遠處轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[10]。因此，積極尋找與UM轉(zhuǎn)移相關(guān)的敏感基因?qū)颊咴\療及改善預(yù)后具有重要意義。HMGA1定位于人染色體6q21，在胚胎期高表達，但在成人正常組織中普遍低表達，可通過調(diào)控多條途徑而在細胞生長、分化、細胞周期、基因轉(zhuǎn)錄及DNA復(fù)制修復(fù)中發(fā)揮重要作用[11]。近年研究發(fā)現(xiàn)，HMGA1蛋白高表達于多種惡性腫瘤組織[12-13]。研究表明，HMGA1高表達可促進乳腺癌MCF7和T47D細胞增殖[4]，HMGA1參與調(diào)控腎透明細胞癌轉(zhuǎn)移[11]，其可作為一種靶基因在細胞侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用[14]。本研究結(jié)果顯示，UM組織中HMGA1蛋白陽性表達率高于正常葡萄膜組織，說明HMGA1蛋白在UM組織中呈高表達，可能與該腫瘤的發(fā)生有關(guān)。同時，本研究發(fā)現(xiàn)HMGA1蛋白陽性表達率與鞏膜浸潤、累及睫狀體和眼外生長相關(guān)，表明HMGA1蛋白可能參與了UM侵襲和轉(zhuǎn)移過程。

本研究利用基因干擾技術(shù)特異性沉默M23細胞中HMGA1表達，結(jié)果顯示，HMGA1 mRNA在HMGA1下調(diào)組細胞中相對表達量低于陰性對照組和空白組，表明HMGA1下調(diào)組細胞中HMGA1 mRNA表達被成功抑制。有研究指出，miR-424可靶向調(diào)控HMGA1阻滯細胞周期G1期進而影響宮頸癌細胞的增殖[15]。本研究結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白組相比，HMGA1下調(diào)組細胞培養(yǎng)24、48、72、96h時吸光度OD值降低，說明下調(diào)HMGA1表達可有效抑制M23細胞增殖，提示HMGA1可能參與了細胞增殖過程。另有研究指出，HMGA1可加速子宮頸癌的遷移和侵襲[16]。本研究結(jié)果顯示，HMGA1下調(diào)組遷移細胞數(shù)和侵襲細胞數(shù)均明顯少于陰性對照組和空白組，說明HMGA1可能參與了M23細胞遷移和侵襲過程，可能是調(diào)控細胞遷移和侵襲的重要基因之一，但具體調(diào)控機制尚待進一步研究明確。

綜上所述，UM組織中HMGA1蛋白陽性表達率升高，且與腫瘤惡性進展指標有關(guān)，下調(diào)M23細胞中HMGA1表達可減少細胞增殖，抑制細胞遷移和侵襲，有望為UM機制研究及臨床診療提供新的潛在靶基因。